第二章DNA复制与损伤教材课件

§3-1DNA复制概貌§3-2DNA复制酶和相关蛋白§3-3DNA的复制过程第三章DNA的复制§3-4DNA的修复§3-5DNA的突变§3-1DNA复制概貌第三章DNA的复制§3-4D1DNA复制是一个由多种酶催化和有多种蛋白质参与的受到精密调控的过程；

§3-1DNA复制概貌DNA是细胞中唯一具修复系统的生物大分子。DNA复制是一个由多种酶催化和有多种蛋白质参与的受到精密调控21958年Meselson和Stahl研究了经15N标记几代的大肠杆菌DNA，首次证明了DNA复制的半保留性。

一、DNA复制的半保留性(Semiconservativereplication)

1958年Meselson和Stahl研究了经15N标记几代3二、DNA的半不连续复制DNAsynthesisissemidiscontinuous二、DNA的半不连续复制4（一）起点（原点origin）三、复制的起点、方向（即顺序性及复制单位）

replicationorigin&direction（一）起点（原点origin）三、复制的起点、方向（即顺5许多实验证明，DNA的复制是由固定的起始点开始的。E.coli染色体复制原点oriC成串排列3个13bp重复序列(GATCTNTTNTTTT)反向重复出现4个9bp序列(TTATCCACA)许多实验证明，DNA的复制是由固定的起始点开始的。E.col6复制子（replicon）一般把生物体的独立复制单位称为复制子。一个复制子只含有一个复制起点。即能启动DNA复制开始的基因组上的DNA顺序，包括复制原点和引发复制的结构基因，以及在其控制下的DNA区段统称为复制子。复制子（replicon）一个复制子只含有一个复制起点。即能7发生部位：GATC中腺嘌呤N6的位置均可以发生甲基化。coli分开连锁体需要拓扑异构酶Ⅳ（属于类型Ⅱtopo酶）参与作用。细胞正常代谢产物对DNA的损伤5’OH⑤空缺由DNA聚合酶Ⅰ和连接酶填补。DNApolII进行DNA链的延伸一、DNA聚合酶DNAPolymerase5’3’聚合酶活性。1958年Meselson和Stahl研究了经15N标记几代的大肠杆菌DNA，首次证明了DNA复制的半保留性。Polα（4亚基）：有引物合成酶活性。5’3’核酸外切酶活性。甲基转移酶因此而失活。在烷基化作用下，碱基可被烷基化，使G≡C对变为G＝T，易突变为A＝T对。C链--A2C4----持续性中等，约为100核苷酸，完成滞后链DNA复制。（四）重组修复（recombinationrepair）复制速度(bp/s/复制叉)klenow片断：用枯草杆菌蛋白酶处理可以将DNA聚合酶I水解为一大一小两个片段。③UvrC蛋白结合到UvrB，UvrB切开损伤部位3'端第5个磷酸二酯键，UvrC切开5'侧第8个磷酸二酯键。MutS结合在错配位点，5’OHTCApppOHCTCA

C5’

OH3’+ppi（二）子链DNA延伸方向

新链合成只能从5’到3’方向发生部位：GATC中腺嘌呤N6的位置均可以发生甲基化。58不同细胞的复制参数

原核生物（大肠杆菌）真核生物（人）细胞内复制子的数目（个）1（1）多个（103～104）复制子平均长度（kb）3～9×106约105～106复制方向多为双向多为双向复制速度(bp/s/复制叉)等速（850）等速（60～90）不同细胞的复制参数

原核生物（大肠杆菌）真核生物（人）细胞内9§3-2DNA复制酶和相关蛋白一、DNA聚合酶DNAPolymerase特点：1.以4种dNTP为底物；2.反应需要接受模板指导；3.反应需要有3’-OH存在；4.DNA链的合成方向为5’3’；5.产物DNA的性质与模板相同。§3-2DNA复制酶和相关蛋白一、DNA聚合酶DNAPo10第二章DNA复制与损伤教材课件11(一)DNA聚合酶IDNA聚合酶I是一种多功能酶。包括：5’3’聚合酶活性。3’5’核酸外切酶活性。5’3’核酸外切酶活性。从3′端将DNA链水解，DNA的校对（proofreading）功能。从5′端将DNA链水解，DNA的修复功能。将dNTP加到DNA链的3′-OH上，DNA的聚合功能。(一)DNA聚合酶IDNA聚合酶I是一种多功能酶。包括：512第二章DNA复制与损伤教材课件13klenow片断：用枯草杆菌蛋白酶处理可以将DNA聚合酶I水解为一大一小两个片段。较大的C末端片断分子量为68KD，叫klenow片断，具有5′→3′的聚合酶活性和3′→5′的外切酶活性，常用做体外合成DNA的工具酶。切口平移：DNA聚合酶I的5′→3′核酸外切酶活性从5′端切除DNA受损伤的部位，DNA聚合酶I的5′→3′聚合酶活性随即开始工作，使DNA链向3′端延伸，这称为切口平移（nicktranslation）。在DNA复制中，RNA引物的切除；DNA的损伤修复；在体外，制备高放射性活性的DNA探针。klenow片断：用枯草杆菌蛋白酶处理可以将DNA聚合酶I水14(二)DNA聚合酶Ⅲ

多亚基不对称二聚体结构(10种亚基)

1.α亚基、ε亚基和θ亚基相连组成核心酶（coreenzyme）α亚基具有5′→3′的聚合酶活性.ε亚基具有3′→5′的外切酶活性.

θ亚基可能起组建的作用.(二)DNA聚合酶Ⅲ多亚基不对称二聚体结构(10种亚基)152.DNA聚合酶Ⅲ具有持续合成能力.β亚基的功能犹如夹子:提高了酶的持续合成能力.

夹子装置器（clamploader）:两个γ亚基与另4个亚基（δ亚基、δ′亚基、χ亚基、ψ亚基）构成γ复合物，其主要功能时帮助β亚基夹住DNA，故称夹子装置器。γ亚基是一种依赖于DNA的ATP酶

τ亚基起促使核心酶二聚化的作用

2.DNA聚合酶Ⅲ具有持续合成能力.β亚基的功能犹如夹子:提16二、DNA旋转酶(DNAGyrase)DNA旋转酶每作用一次产生两个负超螺旋,可去除解螺旋产生的扭曲张力.并依赖于β亚基催化ATP水解,以使酶构象复原.DNA旋转酶的抑制剂如香豆霉素、新生霉素、萘啶酮酸等均能抑制细菌的合成.二、DNA旋转酶(DNAGyrase)DNA旋转酶每作用一17三、DNA解旋酶(DNAHelicase)和单链结合蛋白(Single-strandDNAbindingprotein,SSB)1.DNA解螺旋酶是利用ATP水解获得的能量打断氢键，解开双链DNA并在DNA分子上沿一定方向移动的一类酶的总称。防止核酸水解酶的作用

避免解开的单链DNA重新缔合形成双链对单链DNA有很高的亲和性

它们与DNA结合时有协同作用2.单链结合蛋白（SSB）：三、DNA解旋酶(DNAHelicase)1.DNA解螺旋18

RNA聚合酶[RifS]完成对先导链引物的合成

实现DNA复制的转录激活起始引发酶[RifR]

完成对后随链引物的合成

较先导链的启动落后一个Okazaki片断

完成10±NtRNA引物合成后.DNApolII进行DNA链的延伸

四、引发酶(Primerase)RNA聚合酶[RifS]完成对先导链引物的合19酶-AMP将腺苷酰基（AMP）转移给DNA切口处的5′磷酰基团，以焦磷酸的形式活化，形成AMP-P-DNA。五、连接酶(Ligase)DNA连接酶催化双股链内相邻单链切口的3′-OH与5′-P酰基形成磷酸酯键。酶的活化通过相邻DNA的3′-OH对活化的P原子进行亲核攻击，生成3′，5′-磷酸二酯键，同时释放出AMP。

催化过程：

腺苷酰化DNA亲核攻击完成DNA连接需要NAD+或ATP提供腺苷酰基（AMP），与酶活性中心的赖氨酸残基的ε-NH2以磷酰胺键结合，形成共价中间体酶-AMP；

。

酶-AMP将腺苷酰基（AMP）转移给DNA切口处的5′磷酰20§3-3DNA的复制过程一、E.coli的DNA复制（环型双股DNA，双向θ方式）分为三个阶段：起始、延伸和终止复制体（Replisome）：在DNA合成的生长点，即复制叉上，分布着各种各样与复制有关的酶和蛋白质因子，它们构成复合物称为复制体。DNA复制的阶段表现在于复制体结构的变化。§3-3DNA的复制过程一、E.coli的DNA复制（环型21复制体（Replisome）：在DNA合成的生长点，即复制叉上，分布着各种各样与复制有关的酶和蛋白质因子，它们构成复合物称为复制体。一、DNA复制的半保留性（2）AP核酸内切酶在AP位点附近将DNA链切开。DNA的损伤是指正常DNA分子的化学结构或物理结构在某些物理、化学因素（如射线和化学试剂）以及细胞自发产生的基因毒素等干扰作用下发生改变的现象。MutS结合在错配位点，(2)错配点在切点3'端一边时，修复途径类似。O6—甲基鸟嘌呤—DNA甲基转移酶（O6—methylguanine—DNAmethytransferase）可以将甲基转移到酶自身的半胱氨酸残基上。（四）重组修复（recombinationrepair）三、D环复制（displacementreplication）DNA解螺旋酶是利用ATP水解获得的能量打断氢键，解开双链DNA并在DNA分子上沿一定方向移动的一类酶的总称。并依赖于β亚基催化ATP水解,以使酶构象复原.即能启动DNA复制开始的基因组上的DNA顺序，包括复制原点和引发复制的结构基因，以及在其控制下的DNA区段统称为复制子。DNA复制是一个由多种酶催化和有多种蛋白质参与的受到精密调控的过程；Polδ（2亚基）：有持续合成DNA链的能力，有3'—5'核酸外切酶活性（具有校正功能），完成前导链DNA复制。避免解开的单链DNA重新缔合形成双链（baseexcisionrepair）γ亚基是一种依赖于DNA的ATP酶发生部位：GATC中腺嘌呤N6的位置均可以发生甲基化。分别为polα、β、γ、δ、ε。切口平移：DNA聚合酶I的5′→3′核酸外切酶活性从5′端切除DNA受损伤的部位，DNA聚合酶I的5′→3′聚合酶活性随即开始工作，使DNA链向3′端延伸，这称为切口平移（nicktranslation）。复制子平均长度（kb）复制体（Replisome）：在DNA合成的生长点，即复制叉222.复制的终止1.环行E.coli染色体上的两个复制叉相遇在排列有许多重复拷贝Ter序列（长约22bp）的一个终止区域（terminus），并停止复制。2.称为Tus(terminusutilizatlconsubstance，终点利用物质）的蛋白质的结合于Ter序列，Tus_—Ter复合物只能够阻止一个方向的复制叉。3.E.coli分开连锁体需要拓扑异构酶Ⅳ（属于类型Ⅱtopo酶）参与作用。分开两闭合环。2.复制的终止1.环行E.coli染色体上的两个复制叉相遇在23二、滚环复制（rollingcirclereplication）ΦX174的基因组DNA是单链环型DNA，复制中首先合成其互补链（而非其自身），形成复制型（replicationform,RF），然后进行滚环型（roollingcircle）复制。滚环复制是在一条断裂的亲本链的3‘_OH上不断地发生DNA聚合物作用，因而也叫共价延伸（covalenceelongation）。

二、滚环复制（rollingcirclereplicat24三、D环复制（displacement

replication）线粒体DNA的双股链分为轻链和重链。它的复制是一种单向不对称的特殊复制方式,称为Ｄ—环复制。复制从重链（Ｈ链）的原点开始，新合成的Ｈ链置换原来链，游离的单链称为取代链（displacement）或Ｄ环。当Ｈ链合成进行到约2/3时，轻链（Ｌ链）的原点暴露出来，并引发其合成，延伸方向与Ｈ链的相反。三、D环复制（displacementreplicatio25四、真核生物复制特点（一）真核生物DNA复制与原核生物DNA复制的相同点。（二）真核生物DNA复制与原核生物DNA复制的不同点：１．真核DNA有多个复制原点；2．真核生物染色体在全部复制完成之前不能再重新开始复制，而在快速生长的原核生物中起点可以连续发动复制。3．真核生物复制的调控远比原核生物更为复杂。4．真核生物有多种聚合酶。四、真核生物复制特点（一）真核生物DNA复制与原核生物DNA26从哺乳动物中分出５种DNApol酶。分别为polα、β、γ、δ、ε。Polα（4亚基）：有引物合成酶活性。具有合成RNA后4~5dNTP的活性。无外切酶活性。持续性中等，约为100核苷酸，完成滞后链DNA复制。Polδ（2亚基）：有持续合成DNA链的能力，有3'—5'核酸外切酶活性（具有校正功能），完成前导链DNA复制。

Polε（>1亚基）：相当于E.coli的polⅠ，是一种修复酶，具有3

'→5'

核酸外切酶活性。Polβ（1亚基）：与损伤修复有关。Polγ（2亚基）：是线粒体DNA合成酶（3'→5'外切酶）

从哺乳动物中分出５种DNApol酶。分别为polα、β、γ27五、真核生物端粒的复制五、真核生物端粒的复制28（4）DNA聚合酶Ⅰ兼有外切酶活性，并使DNA链3'端延伸以填补空缺，DNA连接酶将连上。DNA聚合酶Ⅲ具有持续合成能力.3．真核生物复制的调控远比原核生物更为复杂。亲核攻击完成DNA连接MutS结合在错配位点，直接修复是指不需要移去任何碱基或核苷酸就可以将损伤逆转到正常状态的修复机制。DNA是细胞中唯一具修复系统的生物大分子。具有合成RNA后4~5dNTP的活性。催化酶：Dam甲基化酶滚环复制是在一条断裂的亲本链的3‘_OH上不断地发生DNA聚合物作用，因而也叫共价延伸（covalenceelongation）。§3-2DNA复制酶和相关蛋白3’AACCCCAACCCCAACCCC5’(richCchain)(1)当错配点在切点5'端时，去甲基化以3'→5'方向降解（从切点→错配点）。●端粒DNA(Telomer)DNA解螺旋酶是利用ATP水解获得的能量打断氢键，解开双链DNA并在DNA分子上沿一定方向移动的一类酶的总称。⑤空缺由DNA聚合酶Ⅰ和连接酶填补。(二)DNA聚合酶ⅢO6—甲基鸟嘌呤—DNA甲基转移酶（O6—methylguanine—DNAmethytransferase）可以将甲基转移到酶自身的半胱氨酸残基上。应急反应（SOS）：许多能造成DNA损伤或抑制复制的处理均能引起一系列复杂的诱导效应，称为应急反应（SOS）。5’TTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGG3’(richGchain)●端粒DNA(Telomer)

TTGGGG(T2G4)序列高度重复的末端

5’TTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGG3’(richGchain)

3’AACCCCAACCCC

AACCCC5’(richCchain)

G链

–T2G4-----TTGGGGTTGGG

C链--A2C4----

telomerase

3’

aaaAACCCCAACuuac---5’端粒酶(tolomerase)的催化过程（4）DNA聚合酶Ⅰ兼有外切酶活性，并使DNA链3'端延伸以29七、DNA复制的忠实性1.DNA复制是按碱基互补配对的原则进行的。

2.DNA聚合酶本身具有校正功能。

5.DNA的错配校正和修复系统保证DNA复制的忠实性。3.RNA引物的存在与清除有利于降低错配率。

4.DNA聚合酶催化的反应机制，即DNA聚合酶仅催化5'→3'方向的反应。七、DNA复制的忠实性1.DNA复制是按碱基互补配对的原则进30§3-4DNA的损伤及修复一、DNA的损伤DNA的损伤是指正常DNA分子的化学结构或物理结构在某些物理、化学因素（如射线和化学试剂）以及细胞自发产生的基因毒素等干扰作用下发生改变的现象。（P221）（一）物理因素如电离辐射：使链的断裂、碱基及五碳糖的损伤。紫外照射（254nm）：使DNA分子的相邻的2个T形成二聚体（环丁基二聚体）；（二）化学因素1.烷基化

2.亚硝基

3.碱基类似物4.吖啶类分子，如EB§3-4DNA的损伤及修复一、DNA的损伤DNA的损伤是指31（三）自发性损伤1.脱嘌呤和脱嘧啶(AP位点的产生)2.碱基的脱氨基作用3.碱基的互变异构4.细胞正常代谢产物对DNA的损伤（三）自发性损伤1.脱嘌呤和脱嘧啶(AP位点的产生)2.32二、DNA的损伤修复（一）错配修复1.模板区分机制催化酶：Dam甲基化酶发生时制：DNA复制后的一段时间内（约几秒或几分钟）发生部位：GATC中腺嘌呤N6的位置均可以发生甲基化。二、DNA的损伤修复（一）错配修复1.模板区分机制催化酶：332.修复位点的识别MutS结合在错配位点，MutH结合于GATC顺序；MutL可以与MutS形成复合物，并与MutH结合，在错配碱基两边的DNA链沿着复合物的移动是等速，穿过MutL—MutS复合物产生一个DNA环，直到复合物碰上甲基化的GATC顺序。MutH催化切断GATC顺序G碱基5‘一边的未甲基化链，给该修复的链作上记号。2.修复位点的识别MutS结合在错配位点，MutH结合34γ亚基是一种依赖于DNA的ATP酶成串排列3个13bp重复序列(GATCTNTTNTTTT)（二）切除修复（excisionrepair）二、DNA的半不连续复制（二）真核生物DNA复制与原核生物DNA复制的不同点：光复活酶在生物界分布很广，从低等单细胞生物一直到鸟类都有。5’OH3’五、真核生物端粒的复制在重组修复过程中，DNA链的损伤并未除去。一、DNA聚合酶DNAPolymeraseDNA聚合酶本身具有校正功能。MutS结合在错配位点，5’3’聚合酶活性。§3-2DNA复制酶和相关蛋白§3-3DNA的复制过程§3-4DNA的损伤及修复MutS结合在错配位点，应急反应（SOS）：许多能造成DNA损伤或抑制复制的处理均能引起一系列复杂的诱导效应，称为应急反应（SOS）。多亚基不对称二聚体结构(10种亚基)一、DNA复制的半保留性3.修复的切割与聚合(1)当错配点在切点5'端时，去甲基化以3'→5'方向降解（从切点→错配点）。这个过程要有：

DNA解螺旋酶Ⅱ、SSB、

­外切酶Ⅰ或Ⅹ（由3‘→5’方向降解）、DNA聚合酶Ⅲ、DNA连接酶。

(2)错配点在切点3'端一边时，修复途径类似。外切酶Ⅶ（5'→3'或3'→5'方向降解）、或RecJ蛋白（5'→3'方向降解单链DNA）。γ亚基是一种依赖于DNA的ATP酶3.修复的切割与聚合(35（二）切除修复（excisionrepair）

1.碱基切割修复（baseexcisionrepair）（1）由细胞内一类特异的DNA糖苷酶（glycosylase）识别DNA中不正常的碱基，并将其水解下来，形成AP位点。

（2）AP核酸内切酶在AP位点附近将DNA链切开。（不同AP核酸内切酶的作用方式不同，或是在5'侧切开，或是在3'侧切开）。

（3）核酸外切酶将包括AP位点在内的DNA链切除。（4）DNA聚合酶Ⅰ兼有外切酶活性，并使DNA链3'端延伸以填补空缺，DNA连接酶将连上。（二）切除修复（excisionrepair）1.碱基36AP位点的产生AP位点的产生372.核苷酸切除修复（nucleotide-excisionrepair）切除酶（excinuclease）也是一种核酸内切酶，但与一般的核酸内切酶不同，在链的损伤两侧同时切开。编码此酶的基因是Uvr基因。大肠杆菌中ABC切除酶催化过程：①UvrA和UvrB复合物（A2B）寻找并结合到损伤部位。②UvrA离解，UvrB与DNA牢固结合。③UvrC蛋白结合到UvrB，UvrB切开损伤部位3'端第5个磷酸二酯键，UvrC切开5'侧第8个磷酸二酯键。④UvrD解螺旋酶帮助除去。⑤空缺由DNA聚合酶Ⅰ和连接酶填补。2.核苷酸切除修复（nucleotide-excision38（三）直接修复（directrepair）

直接修复是指不需要移去任何碱基或核苷酸就可以将损伤逆转到正常状态的修复机制。（P229）1.光复活修复（potoreactivationrepair）

2.O6—甲基鸟嘌呤的修复光复活(photoreactivation)是在可见光(300～600nm)的活化之下，光复活酶(photoreactivatingenzyme，PR)，或称光敏裂合酶(photolyase)，催化嘧啶二聚体分解成为单体的过程。

光复活酶在生物界分布很广，从低等单细胞生物一直到鸟类都有。在烷基化作用下，碱基可被烷基化，使G≡C对变为G＝T，易突变为A＝T对。O6—甲基鸟嘌呤—DNA甲基转移酶（O6—methylguanine—DNAmethytransferase）可以将甲基转移到酶自身的半胱氨酸残基上。甲基转移酶因此而失活。（三）直接修复（directrepair）直接修复是指不39（四）重组修复（recombinationrepair）

1.复制酶系在损伤部位无法通过碱基配对合成子代DNA链，它就跳过损伤部位，在下一个碱基相应位置处重新合成引物和DNA链，结果子代链在损伤相对应处留下缺口。2.遗传信息有缺损的子代DNA分子可通过遗传重组而加以弥补，即从同源DNA的母链上将相应核苷酸序列片段移至子链缺口，然后用再合成的序列补上母链的空缺。3.在重组修复过程中，DNA链的损伤并未除去。4.实际上消除了损伤的影响。（四）重组修复（recombinationrepair）40DNA聚合酶I是一种多功能酶。在重组修复过程中，DNA链的损伤并未除去。（二）切除修复（excisionrepair）复制速度(bp/s/复制叉)（1）由细胞内一类特异的DNA糖苷酶（glycosylase）识别DNA中不正常的碱基，并将其水解下来，形成AP位点。光复活(photoreactivation)是在可见光(300～600nm)的活化之下，光复活酶(photoreactivatingenzyme，PR)，或称光敏裂合酶(photolyase)，催化嘧啶二聚体分解成为单体的过程。细胞正常代谢产物对DNA的损伤在重组修复过程中，DNA链的损伤并未除去。DNA旋转酶每作用一次产生两个负超螺旋,可去除解螺旋产生的扭曲张力.DNA的错配校正和修复系统保证DNA复制的忠实性。§3-3DNA的复制过程5’OH3’telomerase（baseexcisionrepair）DNA解螺旋酶是利用ATP水解获得的能量打断氢键，解开双链DNA并在DNA分子上沿一定方向移动的一类酶的总称。四、引发酶(Primerase)三、D环复制（displacementreplication）以4种dNTP为底物；DNA复制是按碱基互补配对的原则进行的。5’OH复制子（replicon）O6—甲基鸟嘌呤—DNA甲基转移酶（O6—methylguanine—DNAmethytransferase）可以将甲基转移到酶自身的半胱氨酸残基上。当Ｈ链合成进行到约2/3时，轻链（Ｌ链）的原点暴露出来，并引发其合成，延伸方向与Ｈ链的相反。5’OH（一）起点（原点origin）分为三个阶段：起始、延伸和终止在烷基化作用下，碱基可被烷基化，使G≡C对变为G＝T，易突变为A＝T对。从哺乳动物中分出５种DNApol酶。DNA旋转酶的抑制剂如香豆霉素、新生霉素、萘啶酮酸等均能抑制细菌的合成.七、DNA复制的忠实性三、DNA解旋酶(DNAHelicase)5’3’聚合酶活性。复制速度(bp/s/复制叉)§3-5DNA的突变完成10±NtRNA引物合成后.编码此酶的基因是Uvr基因。DNA的错配校正和修复系统保证DNA复制的忠实性。（4）DNA聚合酶Ⅰ兼有外切酶活性，并使DNA链3'端延伸以填补空缺，DNA连接酶将连上。Polγ（2亚基）：是线粒体DNA合成酶（3'→5'外切酶）DNA旋转酶的抑制剂如香豆霉素、新生霉素、萘啶酮酸等均能抑制细菌的合成.(二)DNA聚合酶Ⅲ（四）应急反应（SOS）和易错修复（errorpronerepair）应急反应（SOS）：许多能造成DNA损伤或抑制复制的处理均能引起一系列复杂的诱导效应，称为应急反应（SOS）。

SOS反应诱导的修复系统包括避免差错的修复（errorfreerepair）和易产生差错的修复（errorpronerepair）两类。

SOS反应还能诱导产生缺乏校对功能的DNA聚合酶。SOS反应是由RecA蛋白和LexA阻遏物相互作用引起的DNA聚合酶Ⅳ、Ⅴ，它们不具有3'核苷酸外切酶校正功能。DNA聚合酶I是一种多功能酶。O6—甲基鸟嘌呤—DNA甲基转41§3-1DNA复制概貌§3-2DNA复制酶和相关蛋白§3-3DNA的复制过程第三章DNA的复制§3-4DNA的修复§3-5DNA的突变§3-1DNA复制概貌第三章DNA的复制§3-4D42DNA复制是一个由多种酶催化和有多种蛋白质参与的受到精密调控的过程；

§3-1DNA复制概貌DNA是细胞中唯一具修复系统的生物大分子。DNA复制是一个由多种酶催化和有多种蛋白质参与的受到精密调控431958年Meselson和Stahl研究了经15N标记几代的大肠杆菌DNA，首次证明了DNA复制的半保留性。

一、DNA复制的半保留性(Semiconservativereplication)

1958年Meselson和Stahl研究了经15N标记几代44二、DNA的半不连续复制DNAsynthesisissemidiscontinuous二、DNA的半不连续复制45（一）起点（原点origin）三、复制的起点、方向（即顺序性及复制单位）

replicationorigin&direction（一）起点（原点origin）三、复制的起点、方向（即顺46许多实验证明，DNA的复制是由固定的起始点开始的。E.coli染色体复制原点oriC成串排列3个13bp重复序列(GATCTNTTNTTTT)反向重复出现4个9bp序列(TTATCCACA)许多实验证明，DNA的复制是由固定的起始点开始的。E.col47复制子（replicon）一般把生物体的独立复制单位称为复制子。一个复制子只含有一个复制起点。即能启动DNA复制开始的基因组上的DNA顺序，包括复制原点和引发复制的结构基因，以及在其控制下的DNA区段统称为复制子。复制子（replicon）一个复制子只含有一个复制起点。即能48发生部位：GATC中腺嘌呤N6的位置均可以发生甲基化。coli分开连锁体需要拓扑异构酶Ⅳ（属于类型Ⅱtopo酶）参与作用。细胞正常代谢产物对DNA的损伤5’OH⑤空缺由DNA聚合酶Ⅰ和连接酶填补。DNApolII进行DNA链的延伸一、DNA聚合酶DNAPolymerase5’3’聚合酶活性。1958年Meselson和Stahl研究了经15N标记几代的大肠杆菌DNA，首次证明了DNA复制的半保留性。Polα（4亚基）：有引物合成酶活性。5’3’核酸外切酶活性。甲基转移酶因此而失活。在烷基化作用下，碱基可被烷基化，使G≡C对变为G＝T，易突变为A＝T对。C链--A2C4----持续性中等，约为100核苷酸，完成滞后链DNA复制。（四）重组修复（recombinationrepair）复制速度(bp/s/复制叉)klenow片断：用枯草杆菌蛋白酶处理可以将DNA聚合酶I水解为一大一小两个片段。③UvrC蛋白结合到UvrB，UvrB切开损伤部位3'端第5个磷酸二酯键，UvrC切开5'侧第8个磷酸二酯键。MutS结合在错配位点，5’OHTCApppOHCTCA

C5’

OH3’+ppi（二）子链DNA延伸方向

新链合成只能从5’到3’方向发生部位：GATC中腺嘌呤N6的位置均可以发生甲基化。549不同细胞的复制参数

原核生物（大肠杆菌）真核生物（人）细胞内复制子的数目（个）1（1）多个（103～104）复制子平均长度（kb）3～9×106约105～106复制方向多为双向多为双向复制速度(bp/s/复制叉)等速（850）等速（60～90）不同细胞的复制参数

原核生物（大肠杆菌）真核生物（人）细胞内50§3-2DNA复制酶和相关蛋白一、DNA聚合酶DNAPolymerase特点：1.以4种dNTP为底物；2.反应需要接受模板指导；3.反应需要有3’-OH存在；4.DNA链的合成方向为5’3’；5.产物DNA的性质与模板相同。§3-2DNA复制酶和相关蛋白一、DNA聚合酶DNAPo51第二章DNA复制与损伤教材课件52(一)DNA聚合酶IDNA聚合酶I是一种多功能酶。包括：5’3’聚合酶活性。3’5’核酸外切酶活性。5’3’核酸外切酶活性。从3′端将DNA链水解，DNA的校对（proofreading）功能。从5′端将DNA链水解，DNA的修复功能。将dNTP加到DNA链的3′-OH上，DNA的聚合功能。(一)DNA聚合酶IDNA聚合酶I是一种多功能酶。包括：553第二章DNA复制与损伤教材课件54klenow片断：用枯草杆菌蛋白酶处理可以将DNA聚合酶I水解为一大一小两个片段。较大的C末端片断分子量为68KD，叫klenow片断，具有5′→3′的聚合酶活性和3′→5′的外切酶活性，常用做体外合成DNA的工具酶。切口平移：DNA聚合酶I的5′→3′核酸外切酶活性从5′端切除DNA受损伤的部位，DNA聚合酶I的5′→3′聚合酶活性随即开始工作，使DNA链向3′端延伸，这称为切口平移（nicktranslation）。在DNA复制中，RNA引物的切除；DNA的损伤修复；在体外，制备高放射性活性的DNA探针。klenow片断：用枯草杆菌蛋白酶处理可以将DNA聚合酶I水55(二)DNA聚合酶Ⅲ

多亚基不对称二聚体结构(10种亚基)

1.α亚基、ε亚基和θ亚基相连组成核心酶（coreenzyme）α亚基具有5′→3′的聚合酶活性.ε亚基具有3′→5′的外切酶活性.

θ亚基可能起组建的作用.(二)DNA聚合酶Ⅲ多亚基不对称二聚体结构(10种亚基)562.DNA聚合酶Ⅲ具有持续合成能力.β亚基的功能犹如夹子:提高了酶的持续合成能力.

夹子装置器（clamploader）:两个γ亚基与另4个亚基（δ亚基、δ′亚基、χ亚基、ψ亚基）构成γ复合物，其主要功能时帮助β亚基夹住DNA，故称夹子装置器。γ亚基是一种依赖于DNA的ATP酶

τ亚基起促使核心酶二聚化的作用

2.DNA聚合酶Ⅲ具有持续合成能力.β亚基的功能犹如夹子:提57二、DNA旋转酶(DNAGyrase)DNA旋转酶每作用一次产生两个负超螺旋,可去除解螺旋产生的扭曲张力.并依赖于β亚基催化ATP水解,以使酶构象复原.DNA旋转酶的抑制剂如香豆霉素、新生霉素、萘啶酮酸等均能抑制细菌的合成.二、DNA旋转酶(DNAGyrase)DNA旋转酶每作用一58三、DNA解旋酶(DNAHelicase)和单链结合蛋白(Single-strandDNAbindingprotein,SSB)1.DNA解螺旋酶是利用ATP水解获得的能量打断氢键，解开双链DNA并在DNA分子上沿一定方向移动的一类酶的总称。防止核酸水解酶的作用

避免解开的单链DNA重新缔合形成双链对单链DNA有很高的亲和性

它们与DNA结合时有协同作用2.单链结合蛋白（SSB）：三、DNA解旋酶(DNAHelicase)1.DNA解螺旋59

RNA聚合酶[RifS]完成对先导链引物的合成

实现DNA复制的转录激活起始引发酶[RifR]

完成对后随链引物的合成

较先导链的启动落后一个Okazaki片断

完成10±NtRNA引物合成后.DNApolII进行DNA链的延伸

四、引发酶(Primerase)RNA聚合酶[RifS]完成对先导链引物的合60酶-AMP将腺苷酰基（AMP）转移给DNA切口处的5′磷酰基团，以焦磷酸的形式活化，形成AMP-P-DNA。五、连接酶(Ligase)DNA连接酶催化双股链内相邻单链切口的3′-OH与5′-P酰基形成磷酸酯键。酶的活化通过相邻DNA的3′-OH对活化的P原子进行亲核攻击，生成3′，5′-磷酸二酯键，同时释放出AMP。

催化过程：

腺苷酰化DNA亲核攻击完成DNA连接需要NAD+或ATP提供腺苷酰基（AMP），与酶活性中心的赖氨酸残基的ε-NH2以磷酰胺键结合，形成共价中间体酶-AMP；

。

酶-AMP将腺苷酰基（AMP）转移给DNA切口处的5′磷酰61§3-3DNA的复制过程一、E.coli的DNA复制（环型双股DNA，双向θ方式）分为三个阶段：起始、延伸和终止复制体（Replisome）：在DNA合成的生长点，即复制叉上，分布着各种各样与复制有关的酶和蛋白质因子，它们构成复合物称为复制体。DNA复制的阶段表现在于复制体结构的变化。§3-3DNA的复制过程一、E.coli的DNA复制（环型62复制体（Replisome）：在DNA合成的生长点，即复制叉上，分布着各种各样与复制有关的酶和蛋白质因子，它们构成复合物称为复制体。一、DNA复制的半保留性（2）AP核酸内切酶在AP位点附近将DNA链切开。DNA的损伤是指正常DNA分子的化学结构或物理结构在某些物理、化学因素（如射线和化学试剂）以及细胞自发产生的基因毒素等干扰作用下发生改变的现象。MutS结合在错配位点，(2)错配点在切点3'端一边时，修复途径类似。O6—甲基鸟嘌呤—DNA甲基转移酶（O6—methylguanine—DNAmethytransferase）可以将甲基转移到酶自身的半胱氨酸残基上。（四）重组修复（recombinationrepair）三、D环复制（displacementreplication）DNA解螺旋酶是利用ATP水解获得的能量打断氢键，解开双链DNA并在DNA分子上沿一定方向移动的一类酶的总称。并依赖于β亚基催化ATP水解,以使酶构象复原.即能启动DNA复制开始的基因组上的DNA顺序，包括复制原点和引发复制的结构基因，以及在其控制下的DNA区段统称为复制子。DNA复制是一个由多种酶催化和有多种蛋白质参与的受到精密调控的过程；Polδ（2亚基）：有持续合成DNA链的能力，有3'—5'核酸外切酶活性（具有校正功能），完成前导链DNA复制。避免解开的单链DNA重新缔合形成双链（baseexcisionrepair）γ亚基是一种依赖于DNA的ATP酶发生部位：GATC中腺嘌呤N6的位置均可以发生甲基化。分别为polα、β、γ、δ、ε。切口平移：DNA聚合酶I的5′→3′核酸外切酶活性从5′端切除DNA受损伤的部位，DNA聚合酶I的5′→3′聚合酶活性随即开始工作，使DNA链向3′端延伸，这称为切口平移（nicktranslation）。复制子平均长度（kb）复制体（Replisome）：在DNA合成的生长点，即复制叉632.复制的终止1.环行E.coli染色体上的两个复制叉相遇在排列有许多重复拷贝Ter序列（长约22bp）的一个终止区域（terminus），并停止复制。2.称为Tus(terminusutilizatlconsubstance，终点利用物质）的蛋白质的结合于Ter序列，Tus_—Ter复合物只能够阻止一个方向的复制叉。3.E.coli分开连锁体需要拓扑异构酶Ⅳ（属于类型Ⅱtopo酶）参与作用。分开两闭合环。2.复制的终止1.环行E.coli染色体上的两个复制叉相遇在64二、滚环复制（rollingcirclereplication）ΦX174的基因组DNA是单链环型DNA，复制中首先合成其互补链（而非其自身），形成复制型（replicationform,RF），然后进行滚环型（roollingcircle）复制。滚环复制是在一条断裂的亲本链的3‘_OH上不断地发生DNA聚合物作用，因而也叫共价延伸（covalenceelongation）。

二、滚环复制（rollingcirclereplicat65三、D环复制（displacement

replication）线粒体DNA的双股链分为轻链和重链。它的复制是一种单向不对称的特殊复制方式,称为Ｄ—环复制。复制从重链（Ｈ链）的原点开始，新合成的Ｈ链置换原来链，游离的单链称为取代链（displacement）或Ｄ环。当Ｈ链合成进行到约2/3时，轻链（Ｌ链）的原点暴露出来，并引发其合成，延伸方向与Ｈ链的相反。三、D环复制（displacementreplicatio66四、真核生物复制特点（一）真核生物DNA复制与原核生物DNA复制的相同点。（二）真核生物DNA复制与原核生物DNA复制的不同点：１．真核DNA有多个复制原点；2．真核生物染色体在全部复制完成之前不能再重新开始复制，而在快速生长的原核生物中起点可以连续发动复制。3．真核生物复制的调控远比原核生物更为复杂。4．真核生物有多种聚合酶。四、真核生物复制特点（一）真核生物DNA复制与原核生物DNA67从哺乳动物中分出５种DNApol酶。分别为polα、β、γ、δ、ε。Polα（4亚基）：有引物合成酶活性。具有合成RNA后4~5dNTP的活性。无外切酶活性。持续性中等，约为100核苷酸，完成滞后链DNA复制。Polδ（2亚基）：有持续合成DNA链的能力，有3'—5'核酸外切酶活性（具有校正功能），完成前导链DNA复制。

Polε（>1亚基）：相当于E.coli的polⅠ，是一种修复酶，具有3

'→5'

核酸外切酶活性。Polβ（1亚基）：与损伤修复有关。Polγ（2亚基）：是线粒体DNA合成酶（3'→5'外切酶）

从哺乳动物中分出５种DNApol酶。分别为polα、β、γ68五、真核生物端粒的复制五、真核生物端粒的复制69（4）DNA聚合酶Ⅰ兼有外切酶活性，并使DNA链3'端延伸以填补空缺，DNA连接酶将连上。DNA聚合酶Ⅲ具有持续合成能力.3．真核生物复制的调控远比原核生物更为复杂。亲核攻击完成DNA连接MutS结合在错配位点，直接修复是指不需要移去任何碱基或核苷酸就可以将损伤逆转到正常状态的修复机制。DNA是细胞中唯一具修复系统的生物大分子。具有合成RNA后4~5dNTP的活性。催化酶：Dam甲基化酶滚环复制是在一条断裂的亲本链的3‘_OH上不断地发生DNA聚合物作用，因而也叫共价延伸（covalenceelongation）。§3-2DNA复制酶和相关蛋白3’AACCCCAACCCCAACCCC5’(richCchain)(1)当错配点在切点5'端时，去甲基化以3'→5'方向降解（从切点→错配点）。●端粒DNA(Telomer)DNA解螺旋酶是利用ATP水解获得的能量打断氢键，解开双链DNA并在DNA分子上沿一定方向移动的一类酶的总称。⑤空缺由DNA聚合酶Ⅰ和连接酶填补。(二)DNA聚合酶ⅢO6—甲基鸟嘌呤—DNA甲基转移酶（O6—methylguanine—DNAmethytransferase）可以将甲基转移到酶自身的半胱氨酸残基上。应急反应（SOS）：许多能造成DNA损伤或抑制复制的处理均能引起一系列复杂的诱导效应，称为应急反应（SOS）。5’TTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGG3’(richGchain)●端粒DNA(Telomer)

TTGGGG(T2G4)序列高度重复的末端

5’TTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGG3’(richGchain)

3’AACCCCAACCCC

AACCCC5’(richCchain)

G链

–T2G4-----TTGGGGTTGGG

C链--A2C4----

telomerase

3’

aaaAACCCCAACuuac---5’端粒酶(tolomerase)的催化过程（4）DNA聚合酶Ⅰ兼有外切酶活性，并使DNA链3'端延伸以70七、DNA复制的忠实性1.DNA复制是按碱基互补配对的原则进行的。

2.DNA聚合酶本身具有校正功能。

5.DNA的错配校正和修复系统保证DNA复制的忠实性。3.RNA引物的存在与清除有利于降低错配率。

4.DNA聚合酶催化的反应机制，即DNA聚合酶仅催化5'→3'方向的反应。七、DNA复制的忠实性1.DNA复制是按碱基互补配对的原则进71§3-4DNA的损伤及修复一、DNA的损伤DNA的损伤是指正常DNA分子的化学结构或物理结构在某些物理、化学因素（如射线和化学试剂）以及细胞自发产生的基因毒素等干扰作用下发生改变的现象。（P221）（一）物理因素如电离辐射：使链的断裂、碱基及五碳糖的损伤。紫外照射（254nm）：使DNA分子的相邻的2个T形成二聚体（环丁基二聚体）；（二）化学因素1.烷基化

2.亚硝基

3.碱基类似物4.吖啶类分子，如EB§3-4DNA的损伤及修复一、DNA的损伤DNA的损伤是指72（三）自发性损伤1.脱嘌呤和脱嘧啶(AP位点的产生)2.碱基的脱氨基作用3.碱基的互变异构4.细胞正常代谢产物对DNA的损伤（三）自发性损伤1.脱嘌呤和脱嘧啶(AP位点的产生)2.73二、DNA的损伤修复（一）错配修复1.模板区分机制催化酶：Dam甲基化酶发生时制：DNA复制后的一段时间内（约几秒或几分钟）发生部位：GATC中腺嘌呤N6的位置均可以发生甲基化。二、DNA的损伤修复（一）错配修复1.模板区分机制催化酶：742.修复位点的识别MutS结合在错配位点，MutH结合于GATC顺序；MutL可以与MutS形成复合物，并与MutH结合，在错配碱基两边的DNA链沿着复合物的移动是等速，穿过MutL—MutS复合物产生一个DNA环，直到复合物碰上甲基化的GATC顺序。MutH催化切断GATC顺序G碱基5‘一边的未甲基化链，给该修复的链作上记号。2.修复位点的识别MutS结合在错配位点，MutH结合75γ亚基是一种依赖于DNA的ATP酶成串排列3个13bp重复序列(GATCTNTTNTTTT)（二）切除修复（excisionrepair）二、DNA的半不连续复制（二）真核生物DNA复制与原核生物DNA复制的不同点：光复活酶在生物界分布很广，从低等单细胞生物一直到鸟类都有。5’OH3’五、真核生物端粒的复制在重组修复过程中，DNA链的损伤并未除去。一、DNA聚合酶DNAPolymeraseDNA聚合酶本身具有校正功能。MutS结合在错配位点，5’3’聚合酶活性。§3-2DNA复制酶和相关蛋白§3-3DNA的复制过程§3-4DNA的损伤及修复MutS结合在错配位点，应急反应（SOS）：许多能造成DNA损伤或抑制复制的处理均能引起一系列复杂的诱导效应，称为应急反应（SOS）。多亚基不对称二聚体结构(10种亚基)一、DNA复制的半保留性3.修复的切割与聚合(1)当错配点在切点5'端时，去甲基化以3'→5'方向降解（从切点→错配点）。这个过程要有：

DNA解螺旋酶Ⅱ、SSB、

­外切酶Ⅰ或Ⅹ（由3‘→5’方向降解）、DNA聚合酶Ⅲ、DNA连接酶。

(2)错配点在切点3'端一边时，修复途径类似。外切酶Ⅶ（5'→3'或3'→5'方向降解）、或RecJ蛋白（5'→3'方向降解单链DNA）。γ亚基是一种依赖于DNA的ATP酶3.修复的切割与聚合(76（二）切除修复（excisionrepair）

1.碱基切割修复（baseexcisionrepair）（1）由细胞内一类特异的DNA糖苷酶（glycosylase）识别DNA中不正常的碱基，并将其水解下来，形成AP位点。

（2）AP核酸内切酶在AP位点附近将DNA链切开。（不同AP核酸内切酶的作用方式不同，或是在5'侧切开，或是在3'侧切开）。

（3）核酸外切酶将包括AP位点在内的DNA链切除。（4）DNA聚合酶Ⅰ兼有外切酶活性，并使DNA链3'端延伸以填补空缺，DNA连接酶将连上。（二）切除修复（excisionrepair）1.碱基77AP位点的产生AP位点的产生782.核苷酸切除修复（nucleotide-excisionrepair）切除酶（excinuclease）也是一种核酸内切酶，但与一般的核酸内切酶不同，在链的损伤两侧同时切开。编码此酶的基因是Uvr基因。大肠杆菌中ABC切除酶催化过程：①UvrA和UvrB复合物（A2B）寻找并结合到损伤部位。②UvrA离解，UvrB与DN