单细胞凝胶电泳技术

单细胞凝胶电泳技术的试验步骤试剂及材料：

1）0.01MPBSpH7.3：8gNaCl、0.2gKCl、1.44gNa2HPO4和0.24gKH2PO4,溶于800ml蒸馏水中，用HCl调节溶液的pH值至7.3，最后加蒸馏水定容至1L即可。保存存于室温或4℃冰箱中。

2）0.8%正常熔点凝胶（PBS配制）

3）0.6％低熔点凝胶（PBS配制）

4）毛玻璃片5）盖玻片

6）碱性裂解液（2.5mol/LNaCl;100mmol/LNa2EDTA;10mmol/LTris;1%肌氨酸钠），临用前加10％DNMSO，1％TritonX-100

7）电泳缓冲液（1mmol/LNa2EDTA;300mmol/LNaOH；Tris.Cl，pH7.5）

8）EB（2ug/ml）

步骤：

1.制备第一层胶：100ml0.8％正常熔点胶，加盖盖玻片，4℃固化10min；

2.制备第二层胶：轻轻地去除盖玻片，在第一层胶上滴加75ul含1×10000个细胞的0.6％低熔点胶（cell与凝胶比例为1：5），加盖盖玻片，4℃固化10min；

3.裂解：去掉盖玻片，将凝胶浸入冰冷的碱性裂解液内（临用前加10％DMAO，1％TritonX-100），4℃裂解1h；

4.取出玻片，用PBS缓冲液漂洗3次后置于水平电泳槽内，加入pH13的电泳缓冲液（没过玻片2-3min），放置20min（黑闭）。

5.电泳：电压20V，300mA，30min

6.取出玻片，用PBS或Tris.Cl，pH7.5漂洗3次，每次3min；或双蒸水漂洗2次，每次5～15min，1.2.5改良彗星试验操作步骤为节省实验时间，本研究将铺三层胶法改为铺一层胶法，同时在中和及染色等步骤进行了改良，具体操作如下:将已染毒的淋巴细胞悬液与40℃的1%低溶点\o"医学百科：琼脂"琼脂糖等浓度混匀后，取70μl混合液直接滴加在磨毛玻片上，加盖玻片，4℃冷凝，20min后揭盖片;4℃于碱性裂解液中裂解1h;解旋20min;4℃电泳（25V，300mA）30min;中和5min;加碘化丙啶，暗处染色10min，加盖片;于莹光\o"医学百科：显微镜"显微镜下镜检，照像。四、操作步骤1.各种细胞用冰冷的PBS洗一次，离心收集，用PBS重悬，密度为1×104-5个/ml。2.铺胶：下述各浓度琼脂糖凝胶均用PBS配制。3.第1层凝胶的制备：将加热熔解的正常熔点琼脂糖(NMA)，冷至45-60℃，取适量铺于载玻片CometSlide上，再置4℃下10min使NMA凝固。也可以先铺胶，晾干后无尘存放，14.第2层凝胶的制备：低熔点琼脂糖LMA在60-70℃水浴加热至少20min使之完全溶化，冷至37℃（可以放置于细胞培养箱中或水浴箱冷却至37℃，低熔点琼脂糖LMA在37℃可维持3小时）。将20μL细胞（约104个）和75μL的LMA混合均匀。然后，迅速将适量含细胞的LMA滴到第1层琼脂糖上，立即盖上另一干净盖玻片，置4℃10min使第25.第3层凝胶的铺制：:第2层LMA凝固后，在室温下小心移去盖玻片，重复第二层的步骤。（此步可以不作，一般铺一层细胞就足够）6.细胞裂解：移去盖玻片，将玻片置于平皿中，轻轻加入预冷的新鲜配置的细胞裂解混合液（配制见试剂使用说明的1，2）。4℃下裂解1-3h。取出载玻片用蒸馏水漂洗2次，要求动作轻柔，以免琼脂糖脱落。7.DNA碱解旋：将载玻片置于水平电泳槽。倒入新配制的电泳缓冲液约覆过载玻片胶面0.25cm左右，室温放置20min，以便使DNA在碱性条件下解螺旋和产生碱易变性区段，使DNA断链在电场中易于迁移。8.细胞电泳：电压15-25V，电压、电流可用改变缓冲液面高低来调节，电泳时间为10-20min。建议预实验，摸索最佳的电压、电流及时间。9.电泳后将载玻片置于平皿内。加入蒸馏水，漂洗2次，每次5min，弃去蒸馏水，每载玻片加2-3滴染色剂，盖上盖玻片（也可以不盖上），避光染色10min。盖上盖玻片的目的是可以隔日分析，或便于操作。10.观察、拍照和分析：荧光显微镜515-560nm（绿光）波长的激发光，可清楚地观察到核DNA和迁移的DNA(即慧星尾)。色泽和图像十分精美，每个样本随机选择20-100个细胞，图片保存后，用相应的软件分析结果。。单细胞凝胶电泳（彗星实验）操作步骤1.各种细胞用冰冷的PBS洗1～2次，离心收集，用PBS0.3ml重悬，密度为1×105-6个/ml。

2.铺胶：下述各浓度琼脂糖凝胶均用PBS配制。3.第1层凝胶的制备：用微波炉加热溶解正常熔点琼脂糖(NMA)，再冷至45～60℃，取适量（100μL～1ml）铺于载玻片上，立即盖上干净盖玻片，再置4℃下至少30min使NMA凝固。也可以先铺胶，晾干后无尘存放，1周内使用。

4.第2层凝胶的制备:低熔点琼脂糖LMA在微波炉中加热使之完全溶化，冷至37℃（可以放置于细胞培养箱中或水浴箱冷却至37℃，低熔点琼脂糖LMA在37℃可维持3小时）。移去盖玻片，将20μL细胞悬液和75μL的LMA混合均匀,然后，迅速将适量含细胞的LMA滴到第1层琼脂糖上，立即盖上干净盖玻片，置4℃30min使第2层LMA凝固。注意，使用盖玻片的目的是使琼脂糖平整，显微镜下方便观察。

5.细胞裂解：移去盖玻片，将载玻片置于平皿中，轻轻加入预冷的新鲜配置的细胞裂解混合液(PH10.0)。4℃下裂解1～3h或过夜。取出载玻片用蒸馏水漂洗2次，要求动作轻柔，以免琼脂糖脱落。

6.DNA碱解旋：将载玻片置于水平电泳槽正极端，并列放置，不留空隙。倒入新配制的电泳缓冲液约覆过载玻片胶面0.25cm左右，室温放置20～40min，以便使DNA在碱性条件下解螺旋和产生碱易变性区段，使DNA断链在电场中易于迁移。

7.细胞电泳：稳压25V，稳流300ｍＡ，电压、电流可用改变缓冲液面高低来调节，电泳时间为20～30min。

8.电泳后将载玻片置于平皿内，缓缓沿壁加入0.4mmol/LTris-HCl(pH7.5)缓冲液或双蒸水，漂洗2次，每次5～15min，弃去Tris-HCl或双蒸水，使用PBS洗干净，并用滤纸吸干水分。（再缓缓加入无水乙醇将凝胶浸埋脱水10min～1h之后,吸去乙醇,自然凉干或室温下过夜。）

9．染色：每张载玻片加2～3滴染色剂（常用30g/l溴化乙锭溶液染色），盖上盖玻片（也可以不盖上），避光染色20min。染色时应戴手套。盖上盖玻片的目的是可以隔日分析，或便于操作。

影响因素1．琼脂糖凝胶薄板的制备：该实验需要制备两层琼脂糖凝胶薄板，应注意琼脂糖的浓度、制备时间和温度。第1层是紧贴冰冻玻片砂面的1%正常凝点(42±2)℃的琼脂糖凝胶，吸取85μl制成面积为18mm×18mm，厚度为0.25mm的凝胶。然后置4℃存放约20分钟，如时间过短，不能得到“老化”的凝胶与玻片粘合不紧,容易在液体浸泡处理和电泳过程中自然脱落，造成实验失败；反之，如果放置时间过长，凝胶极易干裂而脱落。第2层凝胶是1%低凝点(26±2)℃琼脂糖液，与细胞混合时琼脂糖液的温度30～372．细胞数和实验温度的影响：（1）实验细胞数应调至约3.0×105，如果细胞数过低，一张片子中细胞数太少，很难完成100个彗星计数分析；反之细胞数过高，片中细胞过密，位于不同层面的细胞相互重叠，难以分析彗星DNA损伤。(2)实验温度的控制。样品应置4℃3.碱化处理及电泳的条件:凝胶内的细胞需在碱性(pH值10)环境下进行处理，其作用一是去除细胞蛋白质，使DNA暴露出来；其次是碱化处理使DNA紧密螺旋结构解旋，DNA损伤片断及其极性端暴露出来［3］。电泳条件：电压或电流过大，严重受损伤的细胞可能出现的拖尾过长，彗星消失而影响结果，其次是正常的细胞可能因电压或电流过大而形成少许拖尾的假阳性结果。反之，电压或电流过小，受损伤的细胞不会出现拖尾，而出现假阴性结果。电泳的电压多选用低电压，一般在18～50v，在电泳过程中电泳液的温度应不超过15℃(应在44.荧光染色及彗星图象分析：(1)采用DAPI荧光剂染色，质量浓度在1～5μg/ml，用量为10μl。染色15分钟后即可观察，视野中明亮荧光的“彗星”被光照时间一般不易超过2分钟，以免荧光剂快速衰退而不宜继续观察和拍照。(2)彗星的图像分析主要靠肉眼显微镜读片，对DNA损伤程度标准的正确判断是非常重要的。不同程度损伤可根据彗星的尾部与