核酸药物和制药技术课件

反义核酸反义RNA分子：可以和目标基因的mRNA互补的

一段寡聚核苷酸分子，它影响mRNA正常功能；反义DNA分子：类似于反义RNA分子，可以抑制基因表达的分子；RNA-DNA嵌合分子：经化学修饰的寡聚核苷酸类似物：Oligo

反义核酸反义核酸反义RNA分子：可以和目标基因的mRNA互补1作用机理与前体RNA结合－干扰RNA剪切和成熟与mRNA结合，封闭核糖体结合位点，影响翻译与mRNA形成dsRNA，诱导RNaseH对其降解与互补DNA结合，形成DNA-RNA复合物，影响DNA复制作用机理与前体RNA结合－干扰RNA剪切和成熟与mRNA2特点双链RNA（如siRNA）作用强烈；与核酶连接作用更强。特点双链RNA（如siRNA）作用强烈；3核酶（Ribozyme)

核酶不是普通的蛋白质酶，而是一类具催化活性的核酸分子,1980年Cech在嗜热四膜虫中首先发现。目前已知具有催化功能的RNA结构可以分为5种发卡状核酶

锤头状核酶Ⅰ型内含子核酶

RNaseP核酶丁型肝炎病毒核酶核酶（Ribozyme)核酶不是普通的蛋白质酶，而是一类4天然锤头状核酶示意图GGACAUGGCCUCCUGUCACCGGA3′5′UUUGUUGCUGAUGAGUCCAAGCAGGUUAG底物位点催化活性位点天然锤头状核酶示意图GGACAUGGCCUCCUGUC5反义核苷酸药物的应用

反义核酸技术在实验室中取得了较好的效果，90年代以来国外一些制药公司开展了若干反义药物的临床实验。

1997年，美国Genta公司研制了针对Bcl2基因的反义药物，用于治疗前列腺癌和其他恶性肿瘤。美国Hybridon公司研制了针对巨细胞病毒（CMV）感染的反义药物并进行了临床实验。反义核苷酸药物的应用反义核酸技术在实验室中取得了较好的6RNA干扰药物RNA干扰（RNAinterference，RNAi）是一种由双链RNA诱导的基因表达调控和基因沉默的过程，其广泛存在于从植物、无脊椎动物到哺乳动物的各种生物。

RNAi的作用原理

双链RNA诱导诱导RNAi的过程主要分为两个阶段：

Ⅰ启动阶段Ⅱ执行阶段

RNA干扰药物RNA干扰（RNAinterfere7核酸药物和制药技术课件8RNAi的作用原理

启动阶段当细胞中由于感染等原因出现双链RNA分子时，细胞中一种称为Dicer的核酸酶就会识别这些双链RNA，并将其降解成21-23bp长的小干扰RNA（siRNA），单链siRNA与一些蛋白形成复合体，构成“RNA诱导的沉默小体”（RNA-inducedsilencingcomplex，RISC）执行阶段当目标mRNA与RISC中的siRNA完全配对时，RISC就会切割目标RNA，并由细胞中的核酸酶将其进一步降解，从而抑制目标基因的表达RNAi的作用原理启动阶段当细胞中由于感染等原9启动阶段原理图启动阶段RISCRISC前体Dicer（21-23bp）siRNA启动阶段原理图启动阶段RISCRISC前体Dicer（210执行阶段原理图执行阶段核酸酶切割胞内其它AAAAAAA切割RISCAAAAAAAmRNA核酸酶切割胞内其它AAAAAAA切割RISCAAAAAAAmRNA执行阶段原理图执行阶段核酸酶切割胞内其它AAAAAAA切割R11siRNA药物长链的RNA会诱导细胞合成并分泌干扰素，干扰素又会抑制细胞的蛋白质合成，造成一定的副作用。如果直接用21-23bp的小双链RNA即siRNA，则不会诱导干扰素反应，却能在细胞中激活RISC，发挥抑制基因表达的作用。

siRNA的作用

体外实验和动物模型研究证明siRNA药物可以成功抑制HIV、乙肝病毒、流感病毒、SARS冠状病毒、口蹄疫病毒等的感染。

siRNA还可以治疗一些非感染性疾病：美国正在开发一种治疗老年性黄斑变性的siRNA药物siRNA药物长链的RNA会诱导细胞合成并分泌干扰素，12siRNA药物优点与缺点优点：与反义RNA相似，siRNA作为药物具有目标基因专一性强

与反义RNA相比，siRNA药物的作用机制更加明确，效果更加肯定缺点：siRNA的作用需要与目标RNA间发生完全的配对，因此对于目标RNA的突变很敏感。个别位点的突变会使效果大打折扣

在用于抗病毒治疗时，病毒可能出现抗药突变株siRNA药物优点与缺点优点：与反义RNA相似，siR13siRNA的设计和制备siRNA的制备

实验室制法：构建目标基因两侧分别带有噬菌体T7、SP6等启动子的表达质粒体外转录正义链反义链混合双链RNADicer酶加工Dicer酶加工siRNA构建目标基因两侧分别带有噬菌体T7、SP6等启动子的表达质粒体外转录构建目标基因两侧分别带有噬菌体T7、SP6等启动子的表达质粒体外转录正义链构建目标基因两侧分别带有噬菌体T7、SP6等启动子的表达质粒体外转录反义链正义链构建目标基因两侧分别带有噬菌体T7、SP6等启动子的表达质粒体外转录构建目标基因两侧分别带有噬菌体T7、SP6等启动子的表达质粒体外转录构建目标基因两侧分别带有噬菌体T7、SP6等启动子的表达质粒体外转录正义链构建目标基因两侧分别带有噬菌体T7、SP6等启动子的表达质粒体外转录反义链正义链构建目标基因两侧分别带有噬菌体T7、SP6等启动子的表达质粒体外转录反义链正义链构建目标基因两侧分别带有噬菌体T7、SP6等启动子的表达质粒体外转录反义链正义链构建目标基因两侧分别带有噬菌体T7、SP6等启动子的表达质粒体外转录Dicer酶加工siRNADicer酶加工siRNADicer酶加工siRNA实验室制法：构建目标基因两侧分别带有噬菌体T7、SP6等启动子的表达质粒体外转录实验室制法：构建目标基因两侧分别带有噬菌体T7、SP6等启动子的表达质粒体外转录实验室制法：构建目标基因两侧分别带有噬菌体T7、SP6等启动子的表达质粒正义链体外转录实验室制法：构建目标基因两侧分别带有噬菌体T7、SP6等启动子的表达质粒反义链正义链体外转录实验室制法：构建目标基因两侧分别带有噬菌体T7、SP6等启动子的表达质粒反义链正义链体外转录实验室制法：构建目标基因两侧分别带有噬菌体T7、SP6等启动子的表达质粒反义链正义链体外转录实验室制法：构建目标基因两侧分别带有噬菌体T7、SP6等启动子的表达质粒混合反义链正义链体外转录实验室制法：构建目标基因两侧分别带有噬菌体T7、SP6等启动子的表达质粒双链RNA混合反义链正义链体外转录实验室制法：构建目标基因两侧分别带有噬菌体T7、SP6等启动子的表达质粒Dicer酶加工双链RNA混合反义链正义链体外转录实验室制法：构建目标基因两侧分别带有噬菌体T7、SP6等启动子的表达质粒siRNADicer酶加工双链RNA混合反义链正义链体外转录实验室制法：构建目标基因两侧分别带有噬菌体T7、SP6等启动子的表达质粒siRNA的设计和制备siRNA的制备实验室制法：构建目标基14siRNA的设计和制备

siRNA的设计应选取对于疾病发生具有至关重要作用，而对细胞的其他功能影响不大的保守基因作为目标基因，再根据目标基因的序列设计siRNATomTuschl根据实验提出了一个设计siRNA的原则：选择转译起始密码子后50-100碱基的范围，以AA作为正义链的第1，2个核苷酸，GC比为50﹪左右，同时在正义链和反义链的3′-都有TT两个核苷酸的突变siRNA的设计和制备siRNA的设计应选15siRNA的设计和制备

siRNA的制备siRNADicer酶加工双链RNA混合反义链正义链体外转录实验室制法：构建目标基因两侧分别带有噬菌体T7、SP6等启动子的表达质粒siRNADicer酶加工双链RNA混合反义链正义链体外转录实验室制法：构建目标基因两侧分别带有噬菌体T7、SP6等启动子的表达质粒大规模的化学合成方法：可以在合成时加入保护基团增加siRNA的稳定性大规模的化学合成方法：可以在合成时加入保护基团增加siRNA的稳定性大规模的化学合成方法：可以在合成时加入保护基团增加siRNA的稳定性siRNA的设计和制备siRNA的制备siRN16核酸药物的修饰和给药人体内存在大量的核酸酶，在体内应用反义RNA，siRNA等新型核酸药物治疗时，一个关键问题就是保证它们能够抵抗核酸酶的降解并被有效地运输到靶细胞。RNA的化学修饰是一个有效的途径修饰磷酸二酯键修饰核酸修饰骨架化学修饰修饰骨架化学修饰修饰核酸修饰骨架化学修饰修饰磷酸二酯键修饰核酸修饰骨架邓子新《NatureChemicalBiology》2007.

核酸药物的修饰和给药人体内存在大量的核酸酶，在体内应17核酸药物的修饰和给药增强核酸药物有效运送到靶组织的方式：

Ⅰ用脂质体等材料包埋核酸药物静脉注射。如果在脂质体上加入有助于膜融合的分子如氯喹，可以进一步提高它们进入细胞的效率Ⅱ在核酸分子上连接一段可以进入细胞的肽段即转导肽不同的应用目的应采用不同的给药方式：局部注射、静脉注射，有报道表明核酸药物还可以通过皮肤给药核酸药物的修饰和给药增强核酸药物有效运送到靶组织的方18THANKYOUTHANKYOU19反义核酸反义RNA分子：可以和目标基因的mRNA互补的

一段寡聚核苷酸分子，它影响mRNA正常功能；反义DNA分子：类似于反义RNA分子，可以抑制基因表达的分子；RNA-DNA嵌合分子：经化学修饰的寡聚核苷酸类似物：Oligo

反义核酸反义核酸反义RNA分子：可以和目标基因的mRNA互补20作用机理与前体RNA结合－干扰RNA剪切和成熟与mRNA结合，封闭核糖体结合位点，影响翻译与mRNA形成dsRNA，诱导RNaseH对其降解与互补DNA结合，形成DNA-RNA复合物，影响DNA复制作用机理与前体RNA结合－干扰RNA剪切和成熟与mRNA21特点双链RNA（如siRNA）作用强烈；与核酶连接作用更强。特点双链RNA（如siRNA）作用强烈；22核酶（Ribozyme)

核酶不是普通的蛋白质酶，而是一类具催化活性的核酸分子,1980年Cech在嗜热四膜虫中首先发现。目前已知具有催化功能的RNA结构可以分为5种发卡状核酶

锤头状核酶Ⅰ型内含子核酶

RNaseP核酶丁型肝炎病毒核酶核酶（Ribozyme)核酶不是普通的蛋白质酶，而是一类23天然锤头状核酶示意图GGACAUGGCCUCCUGUCACCGGA3′5′UUUGUUGCUGAUGAGUCCAAGCAGGUUAG底物位点催化活性位点天然锤头状核酶示意图GGACAUGGCCUCCUGUC24反义核苷酸药物的应用

反义核酸技术在实验室中取得了较好的效果，90年代以来国外一些制药公司开展了若干反义药物的临床实验。

1997年，美国Genta公司研制了针对Bcl2基因的反义药物，用于治疗前列腺癌和其他恶性肿瘤。美国Hybridon公司研制了针对巨细胞病毒（CMV）感染的反义药物并进行了临床实验。反义核苷酸药物的应用反义核酸技术在实验室中取得了较好的25RNA干扰药物RNA干扰（RNAinterference，RNAi）是一种由双链RNA诱导的基因表达调控和基因沉默的过程，其广泛存在于从植物、无脊椎动物到哺乳动物的各种生物。

RNAi的作用原理

双链RNA诱导诱导RNAi的过程主要分为两个阶段：

Ⅰ启动阶段Ⅱ执行阶段

RNA干扰药物RNA干扰（RNAinterfere26核酸药物和制药技术课件27RNAi的作用原理

启动阶段当细胞中由于感染等原因出现双链RNA分子时，细胞中一种称为Dicer的核酸酶就会识别这些双链RNA，并将其降解成21-23bp长的小干扰RNA（siRNA），单链siRNA与一些蛋白形成复合体，构成“RNA诱导的沉默小体”（RNA-inducedsilencingcomplex，RISC）执行阶段当目标mRNA与RISC中的siRNA完全配对时，RISC就会切割目标RNA，并由细胞中的核酸酶将其进一步降解，从而抑制目标基因的表达RNAi的作用原理启动阶段当细胞中由于感染等原28启动阶段原理图启动阶段RISCRISC前体Dicer（21-23bp）siRNA启动阶段原理图启动阶段RISCRISC前体Dicer（229执行阶段原理图执行阶段核酸酶切割胞内其它AAAAAAA切割RISCAAAAAAAmRNA核酸酶切割胞内其它AAAAAAA切割RISCAAAAAAAmRNA执行阶段原理图执行阶段核酸酶切割胞内其它AAAAAAA切割R30siRNA药物长链的RNA会诱导细胞合成并分泌干扰素，干扰素又会抑制细胞的蛋白质合成，造成一定的副作用。如果直接用21-23bp的小双链RNA即siRNA，则不会诱导干扰素反应，却能在细胞中激活RISC，发挥抑制基因表达的作用。

siRNA的作用

体外实验和动物模型研究证明siRNA药物可以成功抑制HIV、乙肝病毒、流感病毒、SARS冠状病毒、口蹄疫病毒等的感染。

siRNA还可以治疗一些非感染性疾病：美国正在开发一种治疗老年性黄斑变性的siRNA药物siRNA药物长链的RNA会诱导细胞合成并分泌干扰素，31siRNA药物优点与缺点优点：与反义RNA相似，siRNA作为药物具有目标基因专一性强

与反义RNA相比，siRNA药物的作用机制更加明确，效果更加肯定缺点：siRNA的作用需要与目标RNA间发生完全的配对，因此对于目标RNA的突变很敏感。个别位点的突变会使效果大打折扣

在用于抗病毒治疗时，病毒可能出现抗药突变株siRNA药物优点与缺点优点：与反义RNA相似，siR32siRNA的设计和制备siRNA的制备

实验室制法：构建目标基因两侧分别带有噬菌体T7、SP6等启动子的表达质粒体外转录正义链反义链混合双链RNADicer酶加工Dicer酶加工siRNA构建目标基因两侧分别带有噬菌体T7、SP6等启动子的表达质粒体外转录构建目标基因两侧分别带有噬菌体T7、SP6等启动子的表达质粒体外转录正义链构建目标基因两侧分别带有噬菌体T7、SP6等启动子的表达质粒体外转录反义链正义链构建目标基因两侧分别带有噬菌体T7、SP6等启动子的表达质粒体外转录构建目标基因两侧分别带有噬菌体T7、SP6等启动子的表达质粒体外转录构建目标基因两侧分别带有噬菌体T7、SP6等启动子的表达质粒体外转录正义链构建目标基因两侧分别带有噬菌体T7、SP6等启动子的表达质粒体外转录反义链正义链构建目标基因两侧分别带有噬菌体T7、SP6等启动子的表达质粒体外转录反义链正义链构建目标基因两侧分别带有噬菌体T7、SP6等启动子的表达质粒体外转录反义链正义链构建目标基因两侧分别带有噬菌体T7、SP6等启动子的表达质粒体外转录Dicer酶加工siRNADicer酶加工siRNADicer酶加工siRNA实验室制法：构建目标基因两侧分别带有噬菌体T7、SP6等启动子的表达质粒体外转录实验室制法：构建目标基因两侧分别带有噬菌体T7、SP6等启动子的表达质粒体外转录实验室制法：构建目标基因两侧分别带有噬菌体T7、SP6等启动子的表达质粒正义链体外转录实验室制法：构建目标基因两侧分别带有噬菌体T7、SP6等启动子的表达质粒反义链正义链体外转录实验室制法：构建目标基因两侧分别带有噬菌体T7、SP6等启动子的表达质粒反义链正义链体外转录实验室制法：构建目标基因两侧分别带有噬菌体T7、SP6等启动子的表达质粒反义链正义链体外转录实验室制法：构建目标基因两侧分别带有噬菌体T7、SP6等启动子的表达质粒混合反义链正义链体外转录实验室制法：构建目标基因两侧分别带有噬菌体T7、SP6等启动子的表达质粒双链RNA混合反义链正义链体外转录实验室制法：构建目标基因两侧分别带有噬菌体T7、SP6等启动子的表达质粒Dicer酶加工双链RNA混合反义链正义链体外转录实验室制法：构建目标基因两侧分别带有噬菌体T7、SP6等启动子的表达质粒siRNADicer酶加工双链RNA混合反义链正义链体外转录实验室制法：构建目标基因两侧分别带有噬菌体T7、SP6等启动子的表达质粒siRNA的设计和制备siRNA的制备实验室制法：构建目标基33siRNA的设计和制备

siRNA的设计应选取对于疾病发生具有至关重要作用，而对细胞的其他功能影响不大的保守基因作为目标基因，再根据目标基因的序列设计siRNATomTuschl根据实验提出了一个设计siRNA的原则：选择转译起始密码子后50-100碱基的范围，以AA作为正义链的第1，2个核苷酸，GC比为