胚胎体外培养和胚胎评估的培训培训课件

胚胎体外培养和胚胎评估的培训胚胎体外培养和胚胎评估的培训1胚胎体外培养胚胎评估胚胎体外培养2空气、振动、光照…培养箱外环境人员/操作培养流程℃alarmiauto-start

％O2

％CO2cal90℃auto-startdoor90℃hl37.05.095.0培养箱内环境气体、

湿度、培养皿、油…培养液胚胎体外培养体系空气、振动、光照…培养箱外环境人员/操作℃alarmiaut3培养箱外环境空气及污染物振动、噪音光照室内湿度培养箱外环境空气及污染物4挥发性有机化合物VOC总挥发性有机化合物（TVOC）：熔点低于室温沸点50～260℃挥发性有机化合物的总称世界卫生组织(WHO,1989)

挥发性有机化合物VOC总挥发性有机化合物（TVOC）：世界卫5VOC分类苯系物（苯、甲苯、二甲苯、苯乙烯）二异氰酸酯（TDI）二异氰甲苯酯有机氯化物（三氯乙烯、三氯甲烷、三氯乙烷）氟里昂类石油烃类有机酮、醛、胺、醇、醚、酯、酸等VOC分类苯系物（苯、甲苯、二甲苯、苯乙烯）6测定VOC先俘获、后测定各种VOC的俘获方法不同测定总VOC？目前测定的“TVOC”：6~13个碳原子的苯系有机物其他VOC有各自的俘获测定方法未知VOC很难测定测定VOC先俘获、后测定未知VOC很难测定7尘埃粒子直径>0.5um的悬浮粒子十万级：3500000/m3万级：350000/m3千级：35000/m3尘埃粒子直径>0.5um的悬浮粒子8光照来源：室内照明灯、显微镜光源危害：损害线粒体培养液成分分解紫外线产生活性氧，对所有细胞有害光照来源：室内照明灯、显微镜光源9光照豚鼠卵，超过一小时，影响后续受精和有丝分裂低照度利于人卵的囊胚形成和妊娠有相反的结论——兔卵进行光照20～30分钟后，随后的受精率和着床率并未受到明显影响光照豚鼠卵，超过一小时，影响后续受精和有丝分裂10相对湿度（RH）1m3空气25℃23g水蒸气10g水蒸气RH=绝对湿度/饱和湿度30℃30g水蒸气RH=43.5%RH=33.3%相对湿度（RH）1m3空气25℃23g水蒸气10g水蒸气R11理想的室内相对湿度？设备抑制霉菌人员减少液体蒸发010030~60%理想的室内相对湿度？设备抑制霉菌人员减少液体蒸发01003012培养箱内环境气体温度培养皿液滴培养方式油培养箱内环境气体13气体二氧化碳培养箱CO2℃alarmiauto-start

％O2

％CO2cal90℃auto-startdoor90℃hl37.05.095.0三气培养箱桌面式培养箱N2气体二氧化碳培养箱CO2℃alarmiauto-％O2％14气体纯度99.99%?99.995%?99.999%?剩余的0.001%是什么？CO2气体纯度99.99%?剩余的0.001%是什么？CO215高浓度氧，胚胎基因表达异常？低氧培养改善体外胚胎发育低氧培养，人囊胚细胞数增加低氧培养高浓度氧，胚胎基因表达异常？低氧培养16低氧培养部分文献——不必要低氧?培养液内，添加了抗氧化物质（牛磺酸、丙酮酸）可能消除高氧的不利影响37.05.095.0maxmin℃%CO2%rHdesautozeroauto-startcontrolidesstart/stopIO低氧培养部分文献——不必要低氧?37.05.095.0max17ASRM，2013年支持低氧环境利于囊胚形成！ASRM，2013年支持低氧环境利于囊胚形成！18低氧同样利于卵裂期胚胎LowoxygenconcentrationsforembryocultureinassistedreproductivetechnologiesStephanBontekoe1,*,EleniMantikou1,MadelonvanWely1,PublishedOnline:11JUL2012Assessedasup-to-date:4NOV2011DOI:

10.1002/14651858.CD008950.pub2荟萃分析，随机对照研究1382名IVF/ICSI患者20%vs5%O2活产率从32%提高到43%低氧同样利于卵裂期胚胎Lowoxygenconcentr19温度鼠胚室温5分钟——降低卵裂率15分钟——囊胚形成率减半人卵母细胞——低温损害纺锤体温度鼠胚20温度——纺锤体解聚与恢复33℃下，5分钟解聚，10分钟完全消失37℃后,10分钟内恢复28℃，解聚加快，恢复时间长，20分钟不能完全恢复温度——纺锤体解聚与恢复33℃下，5分钟解聚，10分钟完全消21液滴/培养方式单独培养液滴/培养方式单独培养22集合培养胚胎自分泌、旁分泌作用减小体积适当增加胚胎数目液滴自分泌旁分泌集合培养胚胎自分泌、旁分泌作用液滴自分泌旁分泌23集合培养——依据鼠、羊、牛胚胎培养证据具体旁分泌因子未确定集合培养——依据鼠、羊、牛胚胎培养证据24集合培养——方法20～50ul2～5个胚胎/液滴盖油（石蜡油、矿物油）液滴矿物油液滴液滴集合培养——方法20～50ul液滴矿物油液滴液滴25集合培养缺点：不利于单个胚胎的连续观察解决1：按Day3形态学评分分组培养8细胞碎片0～10％8细胞碎片20～40％6细胞碎片20～50％集合培养缺点：不利于单个胚胎的连续观察解决1：按Day3形态26解决2：特殊培养皿液滴解决2：液滴27培养液培养液种类水、离子碳水化合物氨基酸pH值及缓冲物质维生素，抗生素螯合剂抗氧化物质蛋白质，大分子激素，生长因子培养液培养液种类28培养液种类序贯培养液单一培养液培养液种类序贯培养液29序贯培养mmol/LGardner,1998序贯培养mmol/LGardner,199830序贯培养葡萄糖不利于分裂期胚胎发育囊胚主要能量来源EDTA利于分裂期胚胎发育抑制囊胚内细胞团发育氨基酸序贯培养葡萄糖31序贯培养系统Day1~Day3:卵裂期培养液Day3~Day6：囊胚培养液序贯培养系统Day1~Day3:卵裂期培养液32单一培养液？单一培养：简化流程，形成率类似Day3换液Day3不换液！单一培养液？单一培养：简化流程，形成率类似33pH值与缓冲物质pH：代表氢离子浓度pH与细胞各种生理功能关系极密切pH指示剂：酚红缓冲物质：维持pH稳定，成对或一种：碳酸盐缓冲对、MOPS、HEPES1pH值147pH值与缓冲物质pH：代表氢离子浓度1pH值14734pH值与CO2浓度最重要的缓冲对碳酸盐缓冲对：HCO3-/H2CO2pH=pKa+lg（————）〔HCO3﹣〕〔H2CO3〕pH值与CO2浓度最重要的缓冲对pH=pKa+lg（————35培养系统的pH值7.2-7.4碳酸盐体系不稳定！暴露空气会使PH迅速升高盖油减少培养基气体交换培养系统的pH值7.2-7.436CO2浓度影响因素设定值：5%？6%传感器类型培养箱开门方式温度、湿度CO2浓度影响因素设定值：5%？6%37无机离子参与渗透压形成高浓度氯化钠不利于鼠囊胚形成胞外镁和钙的水平与早期胚胎细胞对细胞内稳态调节能力有关磷在含有葡萄糖的简单培养基例如HTF或Earl’s抑制人胚胎的发育无机离子无机离子参与渗透压形成无机离子38铵氨基酸代谢及自然分解产生的氨会导致胚胎毒性物质-铵离子的积累铵离子可以改变胚胎分化、代谢及基因表达会严重降低移植后种植率及胎儿发育率铵氨基酸代谢及自然分解产生的氨会导致胚胎毒性物质-铵离子的积39抗生素培养基中一般均含抗生素例如青霉素、链霉素和庆大霉素主要作用时防止培养基的细菌污染抗生素培养基中一般均含抗生素例如青霉素、链霉素和庆大霉素40蛋白质/大分子物质白蛋白可以降低配子和胚胎表面电荷，避免其粘到玻璃或塑料上便于操作，且可以抵消毒性效应如：人血清蛋白（HSA）和牛血清蛋白、人血浆蛋白粉、5%血浆蛋白注射液、及合成血清替代品（sss）蛋白质/大分子物质白蛋白可以降低配子和胚胎表面电荷，避免其41阻止培养液的蒸发及培养基pH的变化种类：矿物油石蜡油油阻止培养液的蒸发及培养基pH的变化油42培养液储运冷链运输，2~8℃保持容器密封，有泄漏的容器导致培养液碱化，镁离子沉淀减少细菌污染风险培养液储运冷链运输，2~8℃43分装目的：减少开瓶次数分装量：根据使用情况，一次一支分装容器，与量匹配标记分装日期分装目的：减少开瓶次数44胚胎移植－移植时期广泛采用D3（约8-cell）胚胎移植在体内此时的胚胎是在输卵管内，而不是在子宫内卵裂期移植的妊娠率低于D4及囊胚移植胚胎移植－移植时期广泛采用D3（约8-cell）胚胎移植45囊胚培养进一步筛选胚胎灵活的移植时间便于PGD/PGS减少异位妊娠囊胚培养进一步筛选胚胎46囊胚的整倍体率年龄与囊胚的整倍体率BarisAta2012年龄囊胚的整倍体率年龄与囊胚的整倍体率BarisAta20147人员及操作人员数量适当每项关键技术均至少2人能熟练实施确保足够人力实现双人复核卫生部（卫科教[2003]176号文件）规定，实验室专业技术人员不得少于3人。年周期超过1000个周期的中心需要适当增加技术人员每名全职胚胎学家完成250~400周期/年人员及操作人员数量适当卫生部（卫科教[2003]176号文件48人员及操作操作时间对卵、胚胎的应激核对人员及操作操作时间49胚胎体外培养胚胎评估胚胎体外培养50卵巢刺激后获得的胚胎发育潜能不一致减少移植胚胎数，挑选正确的胚胎！胚胎评估、胚胎选择是IVF实验室技术中的核心卵巢刺激后获得的胚胎发育潜能不一致51常规胚胎形态学评估始于第一例IVF-ET1981年Edwards阐述了形态学评估的方法常规胚胎形态学评估始于第一例IVF-ET52胚胎形态学评估多种评分体系可进行胚胎形态学评估缺点依赖操作者主观能力优势快速而有效胚胎形态学评估多种评分体系可进行胚胎形态学评估53Alpha“Toadvancetheartandscienceofclinicalembryologyforthebenefitofthepublicworldwide,throughinternationalpromotionofeducation,communication,andcollaboration.”objectives唯一由资深胚胎学家组成的国际组织Alpha“Toadvancetheartand54Alpha共识embryomorphologycryopreservationKPIsTheProfessionalStatusoftheClinicalEmbryologistAlpha共识embryomorphology55Istanbulconsensusworkshoponembryoassessment:proceedingofanexpertmeeting2010Istanbulconsensusworkshopon56胚胎的形态学指标透明带极体卵周隙胚胎形状裂球数量裂球形状裂球排列原核碎片多核颗粒空泡致密化囊胚腔大小ICM形状TE细胞数早卵裂胚胎的形态学指标透明带胚胎形状原核碎片致密化囊胚腔大小早卵裂57Righttime，rightembryo！Righttime，58评估时间观察内容受精后时间Expectedstageofdevelopment受精17±1hPronuclearstageSyngamycheck23±1hUpto50%insyngamy(upto20%atthe2-cellstage)早卵裂26±1hpost-ICSI28±1hpost-IVF2-cellstageDay244±1h4-cellstageDay368±1h8-cellstageDay492±2hMorulaDay5116±2hBlastocyst评估时间观察内容受精后时间Expectedstageof59原核期评分1998年前后提出原核核仁的数量，排列原核大小及排列胞浆状态2001年,原核期评分能够预测囊胚形成，与妊娠率相关近10余年一直存在争议，研究多为回顾性2011年time-lapse：对评分方法提出质疑原核期评分1998年前后提出2001年,原核期评分能够预测囊60原核期评分GradeRatingDescription1SymmetricalEquivalenttoZ1andZ22Non-symmetricalOtherarrangements,includingperipherally-sitedpronuclei3AbnormalPronucleiwith0or1NPB原核期评分GradeRatingDescription1Sy61早卵裂24～27小时的第一次分裂Shoukir，1997年提出早卵裂是发育能力的重要标志后多人研究证实早卵裂24～27小时的第一次分裂62分裂对称性卵裂球均等性012012Day2卵裂期评分分裂对称性卵裂球均等性012012Day2卵裂期评分63Day3细胞数Edwards提出人早期胚胎有相对固定的发育速度超出或低于此速度，均影响后续发育大量文献：细胞数——种植率、囊胚形成率！Day3细胞数Edwards提出人早期胚胎有相对固定的发育64[i]

AlikaniM.HumReprod2000[i]AlikaniM.HumReprod20065碎片碎片：无细胞核，细胞膜包裹的细胞外胞浆结构（Alikani，1999）细胞代谢或分裂过程异常造成的凋亡过程染色体异常造成碎片？仅仅是目前我们对碎片的认识碎片碎片：无细胞核，细胞膜包裹的细胞外胞浆结构（Alikan66“细胞”大小与DNADay2胚胎，卵裂球65-70um小于45um——2％有DNA大于45um——67％有DNADay3胚胎，卵裂球55-60um小于40um——3％有DNA大于40um——66％有DNA45um35um“细胞”大小与DNADay2胚胎，卵裂球65-70um45u67碎片对胚胎发育的后续影响——局部融合Day4可能发生局部融合部分卵裂球和碎片排除在外碎片对胚胎发育的后续影响——局部融合Day4可能发生局部融合68局部融合——囊胚质量下降局部融合——囊胚质量下降69卵裂球对称性文献非常少卵裂球严重不均匀的胚胎种植率下降Hardarson，2001卵裂球对称性文献非常少70多核现象可能与染色体异常有关囊胚形成率下降种植率下降妊娠率下降VanRoyen，2003Magli，2007多核现象可能与染色体异常有关71Day3胚胎形态学评价细胞数与碎片含量，哪个指标更重要？在所有形态学指标中，细胞数是最重要的独立的预测胚胎活性的指标！RonitMachtinger，2013Day3胚胎形态学评价细胞数与碎片含量，哪个指标更重要？在72细胞数与囊胚形成率北京协和医院妇产科PUMCH－OBGYN细胞数与囊胚形成率北京协和医院妇产科PU73碎片、细胞数与day6囊胚形成北京协和医院妇产科PUMCH－OBGYN碎片、细胞数与day6囊胚形成北京协和医院妇产74卵裂期胚胎评估细胞数少于8个＝种植能力下降多于8个＝种植率可能下降碎片:定义:d2<45µm;d3<40µm分级：少量(<10%);中等(10–25%);大量(>25%)不需要记录碎片位置多核现象:一个卵裂球内超过一个细胞核;d2评估细胞大小:2-,4-,和8-cell阶段应均匀卵裂期胚胎评估细胞数75卵裂期胚胎分级GradeRatingDescription1Good<10%fragmentationstage-specificcellsizenomultinucleation2Fairupto25%fragmentationstage-specificcellsizeformajorityofcellsnoevidenceofmultinucleation3Poorseverefragmentation(>25%)cellsizenotstage-specificevidenceofmultinucleation卵裂期胚胎分级GradeRatingDescription176day4胚胎形态（桑葚胚）相关文献很少GradeA~F(2011)致密化与滋养层的形成有重要关系致密化非常重要day4胚胎形态（桑葚胚）相关文献很少致密化非常重要77Day4胚胎分级GradeRatingDescription1GoodEnteredintoa4throundofcleavageEvidenceofcompactionthatinvolvesvirtuallyalltheembryovolume2FairEnteredintoa4throundofcleavageCompactioninvolvesthemajorityofthevolumeoftheembryo3PoorDisproportionatecompactionof<½embryo,withsomecellsremainingasdiscreteblastomeresDay4胚胎分级GradeRatingDescriptio78囊胚质量评价Gardner评分方法1～6期6期5期4期3期2期囊胚质量评价Gardner评分方法6期5期4期3期2期79AA80BB81CC82AA83BB84CC85囊胚形态学评估滋养细胞层重要？内细胞团重要？囊胚形态学评估滋养细胞层重要？86第5天新鲜SET的回顾性研究形态学指标（扩张程度、ICM和TE）对于持续妊娠/活产的预测价值2006年1月至2010年6月的回顾性分析每ET的持续妊娠或活产率Ahlstrom2011第5天新鲜SET的回顾性研究形态学指标（扩张程度、ICM和T87结果形态指标分级妊娠率（％）P扩张程度338.1448.40.021内细胞团A46.8B34.00.024C14.3滋养细胞层A52.0B32.4<0.0001C8.0滋养层形态比ICM的预测价值更高结果形态指标分级妊娠率（％）P扩张程度338.1448.4088囊胚分级GradeRatingDescriptionStageofdevelopment1早期2囊胚3扩张囊胚4部分或完全孵出囊胚InnerCellMass1GoodProminent,easilydiscernible,withmanycellsthatarecompactedandtightlyadhered2FairEasilydiscerniblewithmanycellslooselygroupedtogether3PoorDifficulttodiscern,withfewcellsTrophecto-derm1GoodManycellsformingacohesiveepithelium2FairFewcellsformingalooseepithelium3PoorVeryfewcells囊胚分级GradeRatingDescriptionStag89小结胚胎培养体系是培养室环境、培养箱、培养液和人员操作的综合体胚胎形态学评估是胚胎选择的重要方法多种胚胎形态学指标有不同的意义，但已经逐渐达成共识小结胚胎培养体系是培养室环境、培养箱、培养液和人员操作的综合90谢谢!谢谢!91胚胎体外培养和胚胎评估的培训胚胎体外培养和胚胎评估的培训92胚胎体外培养胚胎评估胚胎体外培养93空气、振动、光照…培养箱外环境人员/操作培养流程℃alarmiauto-start

％O2

％CO2cal90℃auto-startdoor90℃hl37.05.095.0培养箱内环境气体、

湿度、培养皿、油…培养液胚胎体外培养体系空气、振动、光照…培养箱外环境人员/操作℃alarmiaut94培养箱外环境空气及污染物振动、噪音光照室内湿度培养箱外环境空气及污染物95挥发性有机化合物VOC总挥发性有机化合物（TVOC）：熔点低于室温沸点50～260℃挥发性有机化合物的总称世界卫生组织(WHO,1989)

挥发性有机化合物VOC总挥发性有机化合物（TVOC）：世界卫96VOC分类苯系物（苯、甲苯、二甲苯、苯乙烯）二异氰酸酯（TDI）二异氰甲苯酯有机氯化物（三氯乙烯、三氯甲烷、三氯乙烷）氟里昂类石油烃类有机酮、醛、胺、醇、醚、酯、酸等VOC分类苯系物（苯、甲苯、二甲苯、苯乙烯）97测定VOC先俘获、后测定各种VOC的俘获方法不同测定总VOC？目前测定的“TVOC”：6~13个碳原子的苯系有机物其他VOC有各自的俘获测定方法未知VOC很难测定测定VOC先俘获、后测定未知VOC很难测定98尘埃粒子直径>0.5um的悬浮粒子十万级：3500000/m3万级：350000/m3千级：35000/m3尘埃粒子直径>0.5um的悬浮粒子99光照来源：室内照明灯、显微镜光源危害：损害线粒体培养液成分分解紫外线产生活性氧，对所有细胞有害光照来源：室内照明灯、显微镜光源100光照豚鼠卵，超过一小时，影响后续受精和有丝分裂低照度利于人卵的囊胚形成和妊娠有相反的结论——兔卵进行光照20～30分钟后，随后的受精率和着床率并未受到明显影响光照豚鼠卵，超过一小时，影响后续受精和有丝分裂101相对湿度（RH）1m3空气25℃23g水蒸气10g水蒸气RH=绝对湿度/饱和湿度30℃30g水蒸气RH=43.5%RH=33.3%相对湿度（RH）1m3空气25℃23g水蒸气10g水蒸气R102理想的室内相对湿度？设备抑制霉菌人员减少液体蒸发010030~60%理想的室内相对湿度？设备抑制霉菌人员减少液体蒸发010030103培养箱内环境气体温度培养皿液滴培养方式油培养箱内环境气体104气体二氧化碳培养箱CO2℃alarmiauto-start

％O2

％CO2cal90℃auto-startdoor90℃hl37.05.095.0三气培养箱桌面式培养箱N2气体二氧化碳培养箱CO2℃alarmiauto-％O2％105气体纯度99.99%?99.995%?99.999%?剩余的0.001%是什么？CO2气体纯度99.99%?剩余的0.001%是什么？CO2106高浓度氧，胚胎基因表达异常？低氧培养改善体外胚胎发育低氧培养，人囊胚细胞数增加低氧培养高浓度氧，胚胎基因表达异常？低氧培养107低氧培养部分文献——不必要低氧?培养液内，添加了抗氧化物质（牛磺酸、丙酮酸）可能消除高氧的不利影响37.05.095.0maxmin℃%CO2%rHdesautozeroauto-startcontrolidesstart/stopIO低氧培养部分文献——不必要低氧?37.05.095.0max108ASRM，2013年支持低氧环境利于囊胚形成！ASRM，2013年支持低氧环境利于囊胚形成！109低氧同样利于卵裂期胚胎LowoxygenconcentrationsforembryocultureinassistedreproductivetechnologiesStephanBontekoe1,*,EleniMantikou1,MadelonvanWely1,PublishedOnline:11JUL2012Assessedasup-to-date:4NOV2011DOI:

10.1002/14651858.CD008950.pub2荟萃分析，随机对照研究1382名IVF/ICSI患者20%vs5%O2活产率从32%提高到43%低氧同样利于卵裂期胚胎Lowoxygenconcentr110温度鼠胚室温5分钟——降低卵裂率15分钟——囊胚形成率减半人卵母细胞——低温损害纺锤体温度鼠胚111温度——纺锤体解聚与恢复33℃下，5分钟解聚，10分钟完全消失37℃后,10分钟内恢复28℃，解聚加快，恢复时间长，20分钟不能完全恢复温度——纺锤体解聚与恢复33℃下，5分钟解聚，10分钟完全消112液滴/培养方式单独培养液滴/培养方式单独培养113集合培养胚胎自分泌、旁分泌作用减小体积适当增加胚胎数目液滴自分泌旁分泌集合培养胚胎自分泌、旁分泌作用液滴自分泌旁分泌114集合培养——依据鼠、羊、牛胚胎培养证据具体旁分泌因子未确定集合培养——依据鼠、羊、牛胚胎培养证据115集合培养——方法20～50ul2～5个胚胎/液滴盖油（石蜡油、矿物油）液滴矿物油液滴液滴集合培养——方法20～50ul液滴矿物油液滴液滴116集合培养缺点：不利于单个胚胎的连续观察解决1：按Day3形态学评分分组培养8细胞碎片0～10％8细胞碎片20～40％6细胞碎片20～50％集合培养缺点：不利于单个胚胎的连续观察解决1：按Day3形态117解决2：特殊培养皿液滴解决2：液滴118培养液培养液种类水、离子碳水化合物氨基酸pH值及缓冲物质维生素，抗生素螯合剂抗氧化物质蛋白质，大分子激素，生长因子培养液培养液种类119培养液种类序贯培养液单一培养液培养液种类序贯培养液120序贯培养mmol/LGardner,1998序贯培养mmol/LGardner,1998121序贯培养葡萄糖不利于分裂期胚胎发育囊胚主要能量来源EDTA利于分裂期胚胎发育抑制囊胚内细胞团发育氨基酸序贯培养葡萄糖122序贯培养系统Day1~Day3:卵裂期培养液Day3~Day6：囊胚培养液序贯培养系统Day1~Day3:卵裂期培养液123单一培养液？单一培养：简化流程，形成率类似Day3换液Day3不换液！单一培养液？单一培养：简化流程，形成率类似124pH值与缓冲物质pH：代表氢离子浓度pH与细胞各种生理功能关系极密切pH指示剂：酚红缓冲物质：维持pH稳定，成对或一种：碳酸盐缓冲对、MOPS、HEPES1pH值147pH值与缓冲物质pH：代表氢离子浓度1pH值147125pH值与CO2浓度最重要的缓冲对碳酸盐缓冲对：HCO3-/H2CO2pH=pKa+lg（————）〔HCO3﹣〕〔H2CO3〕pH值与CO2浓度最重要的缓冲对pH=pKa+lg（————126培养系统的pH值7.2-7.4碳酸盐体系不稳定！暴露空气会使PH迅速升高盖油减少培养基气体交换培养系统的pH值7.2-7.4127CO2浓度影响因素设定值：5%？6%传感器类型培养箱开门方式温度、湿度CO2浓度影响因素设定值：5%？6%128无机离子参与渗透压形成高浓度氯化钠不利于鼠囊胚形成胞外镁和钙的水平与早期胚胎细胞对细胞内稳态调节能力有关磷在含有葡萄糖的简单培养基例如HTF或Earl’s抑制人胚胎的发育无机离子无机离子参与渗透压形成无机离子129铵氨基酸代谢及自然分解产生的氨会导致胚胎毒性物质-铵离子的积累铵离子可以改变胚胎分化、代谢及基因表达会严重降低移植后种植率及胎儿发育率铵氨基酸代谢及自然分解产生的氨会导致胚胎毒性物质-铵离子的积130抗生素培养基中一般均含抗生素例如青霉素、链霉素和庆大霉素主要作用时防止培养基的细菌污染抗生素培养基中一般均含抗生素例如青霉素、链霉素和庆大霉素131蛋白质/大分子物质白蛋白可以降低配子和胚胎表面电荷，避免其粘到玻璃或塑料上便于操作，且可以抵消毒性效应如：人血清蛋白（HSA）和牛血清蛋白、人血浆蛋白粉、5%血浆蛋白注射液、及合成血清替代品（sss）蛋白质/大分子物质白蛋白可以降低配子和胚胎表面电荷，避免其132阻止培养液的蒸发及培养基pH的变化种类：矿物油石蜡油油阻止培养液的蒸发及培养基pH的变化油133培养液储运冷链运输，2~8℃保持容器密封，有泄漏的容器导致培养液碱化，镁离子沉淀减少细菌污染风险培养液储运冷链运输，2~8℃134分装目的：减少开瓶次数分装量：根据使用情况，一次一支分装容器，与量匹配标记分装日期分装目的：减少开瓶次数135胚胎移植－移植时期广泛采用D3（约8-cell）胚胎移植在体内此时的胚胎是在输卵管内，而不是在子宫内卵裂期移植的妊娠率低于D4及囊胚移植胚胎移植－移植时期广泛采用D3（约8-cell）胚胎移植136囊胚培养进一步筛选胚胎灵活的移植时间便于PGD/PGS减少异位妊娠囊胚培养进一步筛选胚胎137囊胚的整倍体率年龄与囊胚的整倍体率BarisAta2012年龄囊胚的整倍体率年龄与囊胚的整倍体率BarisAta201138人员及操作人员数量适当每项关键技术均至少2人能熟练实施确保足够人力实现双人复核卫生部（卫科教[2003]176号文件）规定，实验室专业技术人员不得少于3人。年周期超过1000个周期的中心需要适当增加技术人员每名全职胚胎学家完成250~400周期/年人员及操作人员数量适当卫生部（卫科教[2003]176号文件139人员及操作操作时间对卵、胚胎的应激核对人员及操作操作时间140胚胎体外培养胚胎评估胚胎体外培养141卵巢刺激后获得的胚胎发育潜能不一致减少移植胚胎数，挑选正确的胚胎！胚胎评估、胚胎选择是IVF实验室技术中的核心卵巢刺激后获得的胚胎发育潜能不一致142常规胚胎形态学评估始于第一例IVF-ET1981年Edwards阐述了形态学评估的方法常规胚胎形态学评估始于第一例IVF-ET143胚胎形态学评估多种评分体系可进行胚胎形态学评估缺点依赖操作者主观能力优势快速而有效胚胎形态学评估多种评分体系可进行胚胎形态学评估144Alpha“Toadvancetheartandscienceofclinicalembryologyforthebenefitofthepublicworldwide,throughinternationalpromotionofeducation,communication,andcollaboration.”objectives唯一由资深胚胎学家组成的国际组织Alpha“Toadvancetheartand145Alpha共识embryomorphologycryopreservationKPIsTheProfessionalStatusoftheClinicalEmbryologistAlpha共识embryomorphology146Istanbulconsensusworkshoponembryoassessment:proceedingofanexpertmeeting2010Istanbulconsensusworkshopon147胚胎的形态学指标透明带极体卵周隙胚胎形状裂球数量裂球形状裂球排列原核碎片多核颗粒空泡致密化囊胚腔大小ICM形状TE细胞数早卵裂胚胎的形态学指标透明带胚胎形状原核碎片致密化囊胚腔大小早卵裂148Righttime，rightembryo！Righttime，149评估时间观察内容受精后时间Expectedstageofdevelopment受精17±1hPronuclearstageSyngamycheck23±1hUpto50%insyngamy(upto20%atthe2-cellstage)早卵裂26±1hpost-ICSI28±1hpost-IVF2-cellstageDay244±1h4-cellstageDay368±1h8-cellstageDay492±2hMorulaDay5116±2hBlastocyst评估时间观察内容受精后时间Expectedstageof150原核期评分1998年前后提出原核核仁的数量，排列原核大小及排列胞浆状态2001年,原核期评分能够预测囊胚形成，与妊娠率相关近10余年一直存在争议，研究多为回顾性2011年time-lapse：对评分方法提出质疑原核期评分1998年前后提出2001年,原核期评分能够预测囊151原核期评分GradeRatingDescription1SymmetricalEquivalenttoZ1andZ22Non-symmetricalOtherarrangements,includingperipherally-sitedpronuclei3AbnormalPronucleiwith0or1NPB原核期评分GradeRatingDescription1Sy152早卵裂24～27小时的第一次分裂Shoukir，1997年提出早卵裂是发育能力的重要标志后多人研究证实早卵裂24～27小时的第一次分裂153分裂对称性卵裂球均等性012012Day2卵裂期评分分裂对称性卵裂球均等性012012Day2卵裂期评分154Day3细胞数Edwards提出人早期胚胎有相对固定的发育速度超出或低于此速度，均影响后续发育大量文献：细胞数——种植率、囊胚形成率！Day3细胞数Edwards提出人早期胚胎有相对固定的发育155[i]

AlikaniM.HumReprod2000[i]AlikaniM.HumReprod200156碎片碎片：无细胞核，细胞膜包裹的细胞外胞浆结构（Alikani，1999）细胞代谢或分裂过程异常造成的凋亡过程染色体异常造成碎片？仅仅是目前我们对碎片的认识碎片碎片：无细胞核，细胞膜包裹的细胞外胞浆结构（Alikan157“细胞”大小与DNADay2胚胎，卵裂球65-70um小于45um——2％有DNA大于45um——67％有DNADay3胚胎，卵裂球55-60um小于40um——3％有DNA大于40um——66％有DNA45um35um“细胞”大小与DNADay2胚胎，卵裂球65-70um45u158碎片对胚胎发育的后续影响——局部融合Day4可能发生局部融合部分卵裂球和碎片排除在外碎片对胚胎发育的后续影响——局部融合Day4可能发生局部融合159局部融合——囊胚质量下降局部融合——囊胚质量下降160卵裂球对称性文献非常少卵裂球严重不均匀的胚胎种植率下降Hardarson，2001卵裂球对称性文献非常少161多核现象可能与染色体异常有关囊胚形成率下降种植率下降妊娠率下降VanRoyen，2003Magli，2007多核现象可能与染色体异常有关162Day3胚胎形态学评价细胞数与碎片含量，哪个指标更重要？在所有形态学指标中，细胞数是最重要的独立的预测胚胎活性的指标！RonitMachtinger，2013Day3胚胎形态学评价细胞数与碎片含量，哪个指标更重要？在163细胞数与囊胚形成率北京协和医院妇产科PUMCH－OBGYN细胞数与囊胚形成率北京协和医院妇产科PU164碎片、细胞数与day6囊胚形成北京协和医院妇产科PUMCH－OBGYN碎片、细胞数与day6囊胚形成北京协和医院妇产165卵裂期胚胎评估细胞数少于8个＝种植能力下降多于8个＝种植率可能下降碎片:定义:d2<45µm;d3<40µm分级：少量(<10%);中等(10–25%);大量(>25%)不需要记录碎片位置多核现象:一个卵裂球内超过一个细胞核;d2评估细胞大小:2-,4-,和8-cell阶段应均匀卵裂期胚胎评估细胞数166卵裂期胚胎分级GradeRatingDescription1Good