分子生物学研究方法课件

分子生物学研究方法分子生物学研究方法第一节基因操作的主要技术原理

1．核酸的凝胶电泳(Agarose&Polyacrylamide)

将某种分子放到特定的电场中，它就会以一定的速度向适当的电极移动。某物质在电场作用下的迁移速度叫作电泳的速率，它与电场强度成正比，与该分子所携带的净电荷数成正比，而与分子的磨擦系数成反比（分子大小、极性、介质的粘度系数等）。在生理条件下，核酸分子中的磷酸基团是离子化的，所以，DNA和RNA实际上呈多聚阴离子状态（Polyanions）。将DNA、RNA放到电场中，它就会由负极→正极移动。第一节基因操作的主要技术原理1．核酸的凝胶电泳(A分子生物学研究方法课件2．核酸的分子杂交技术

在大多数核酸杂交反应中，经过凝胶电泳分离的DNA或RNA分子，都是在杂交之前，通过毛细管作用或电导作用按其在凝胶中的位置原封不动地“吸印”转移到滤膜上的。常用的滤膜有尼龙滤膜、硝酸纤维素滤膜，叠氮苯氧甲基纤维素滤纸（DBM）和二乙氨基乙基纤维素滤膜（DEAE）2．核酸的分子杂交技术核酸分子杂交实验包括如下两个步骤：

1.将核酸样品转移到固体支持物滤膜上，这个过程特称为核酸印迹(nucleicacidblotting)转移，主要有电泳凝胶核酸印迹法、斑点和狭线印迹法(dotandslotblotting)、菌落和噬菌斑印迹法(colonyandplaqueblotting)；

2.将具有核酸印迹的滤膜同带有放射性标记或其它标记的DNA或RNA探针进行杂交。所以有时也称这类核酸杂交为印迹杂交。核酸分子杂交实验包括如下两个步骤：

1.将核酸样品转移分子生物学研究方法课件分子生物学研究方法课件3．细菌的转化

所谓细菌转化，是指一种细菌菌株由于捕获了来自另一种细菌菌株的DNA，而导致性状特征发生遗传改变的生命过程。这种提供转化DNA的菌株叫做供体菌株，而接受转化DNA的寄主菌株则称做受体菌株。大肠杆菌是最广泛使用的实验菌株。在加入转化DNA之前，必须预先用CaCl2处理大肠杆菌细胞，使之呈感受态（CompetentCells）。Mg2+对维持外源DNA的稳定性起重要作用，质粒DNA中的抗生素是筛选标记。

3．细菌的转化4．DNA序列分析a.Sanger的双脱氧链终止法

Cambridge的F.Sanger在1977年发明用双脱氧链终止法测定单链DNA的序列，其基本原理如下：①DNA聚合酶能够用单链DNA作为模板，合成准确的DNA互补链；DNA聚合酶常用Klenow大片段，无5'→3'外切酶活性。②该酶能够用2'，3'--双脱氧核苷三磷酸作底物并将其聚合到新生寡核苷酸链的3'-末端，从而终止其延伸反应。在DNA测序反应中，加入模板DNA，引物（特异性引物，如T7，T3，M13等），DNA聚合酶，dATP，dTTP，dGTP，dCTP和一种ddNTP。4．DNA序列分析分子生物学研究方法课件双脱氧链末端终止法测序基本原理示意图双脱氧链末端终止法测序基本原理示意图分子生物学研究方法课件b．DNA序列分析自动化(分析反应\读片过程

)

用四甲基若丹明(Tetramethylrhodamine)作为荧光剂标记DNA引物，带有这种引物的DNA片段能在激光诱导下发出荧光。按照标准的双脱氧终止法或化学终止法进行测序反应，跑DNA凝胶后,用计算机检测。b．DNA序列分析自动化(分析反应\读片过程)DNA测序的全过程(实际)DNA测序的全过程(实际)5．基因的定点诱变（site-directedmutagenesis）

使已克隆基因或DNA片段中的任何一个特定碱基发生取代、插入或缺失变化的过程叫作基因的定点诱变，是基因工程和蛋白质工程的重要手段。如：盒式诱变(cassettemutagenesis)，包括盒式取代诱变和混合寡核苷酸诱变两种方式。5．基因的定点诱变（site-directedmutag6．利用DNA与蛋白质的相互作用进行核酸研究.a.凝胶滞缓实验(Gelretardationassay)，又称DNA迁移率变化试验(DNAmobilityshiftassay--EMSA)。

6．利用DNA与蛋白质的相互作用进行核酸研究.a.凝胶滞b．DNaseI印迹试验（DNaseIfootprinting）主要步骤：

①用32P标记DNA双链末端，并用RE切去一端；

②加入细胞特定周期蛋白质提取物，温育；

③加入适量DNaseI或硫酸二甲酯-六氢吡啶，使DNA链发生断裂。

这一反应中，DNaseI或硫酸二甲酯的用量非常关键，要保证每一条DNA链只发生一次磷酸二酯断裂！

④沉淀DNA（包括与DNA相结合的蛋白质）；

⑤进行DNA凝胶分析。

如果某个蛋白质已经与DNA的特定区段相结合，那么，它就会保证该区段DNA免受消化或降解作用。在电泳凝胶的放射自显影图片上，相应于蛋白质结合的部位不产生放射性标记的条带,而是出现了一个空白的区域,形象地称为足迹。b．DNaseI印迹试验（DNaseIfootp7聚合酶链式反应（PCR）技术PCR（polymerasechainreaction）：聚合酶链式反应。1983年由美国科学家KaryMullis提出，1993年因此而获诺贝尔奖。PCR技术是指通过模拟体内DNA复制的方式，在体外选择性地将DNA某个特殊区域扩增出来的技术，它包括变性、退火、延伸三个步骤。7聚合酶链式反应（PCR）技术PCR（polymeraseKaryB.Mullis(1944-)，在Cetus公司工作期间，发明了PCR。他原本是要合成DNA引物来进行测序工作，却常为没有足够多的模板DNA而烦恼。1983年春夏之交的一个晚上，他开车去乡下别墅的路上萌发了用两个引物（而不是一个引物）去扩增模板DNA的想法…...KaryB.Mullis(1944-)，在CetusMullis开车的时候,瞬间感觉两排路灯就是DNA的两条链，自己的车和对面开来的车象是DNA聚合酶，面对面地合成.DNA，……Mullis开车的时候,瞬间感觉两排路灯就是DNA的两条链1983年9月中旬。Mullis在反应体系中加入DNA聚合酶后在37℃一直保温。结果第二天在琼脂糖电泳上没有看到任何条带。于是他认识到有必要用加热来解链，每次解链后再加入DNA聚合酶进行反应，依次循环。1983年12月，他终于看到了被同位素标记的PCR条带。Mullis的第一个PCR实验1983年9月中旬。Mullis在反应体系中加入DNA聚合酶PCR的基本原理

引物

dNTP

耐热DNA聚合酶模板DNA

变性（denaturation）：90～98℃；退火（annealing）：37～

72℃；延伸（extension）：72℃。基本要素扩增步骤PCR的基本原理引物变性（denaturation）：9分子生物学研究方法课件5’-GGTA……TCAT-3’3’-CCAT……AGTA-5’5’GGTA-OH（引物1）5’ATGA-OH（引物2）90~98℃3’-CCAT…………AGTA-5’5’-GGTA…………TCAT-3’37~72℃3’-CCAT…………AGTA-5’5’-GGTA…………TCAT-3’5’GGTA-OHOH-AGTA5’70~75℃5’-GGTA……TCAT-3’3’-CCAT……AGTA-5’5’-GGTA……TCAT-3’3’-CCAT……AGTA-5’90~98℃37~72℃3’-CCAT……AGTA-5’5’-GGTA……TCAT-3’5’GGTA-OHOH-AGTA5’70~75℃5’-GGTA……TCAT-3’3’-CCAT……AGTA-5’5’-GGTA……TCAT-3’3’-CCAT……AGTA-5’3’-CCAT……AGTA-5’5’-GGTA……TCAT-3’(略)(底物DNA)(略)(略)PCR扩增特异性DNA片段全过程5’-GGTA……TCAT-3’5’GGTA-OH（引物1分子生物学研究方法课件PCR反应体系1、脱氧核苷三磷酸（dNTP）dATP、dGTP、dCTP、dTTP是PCR的原材料，通过PCR过程聚合成互补链DNA。贮存浓度：2.5mM使用浓度：200μM使用浓度不当会影响扩增的产量、特异性和保真度。PCR反应体系1、脱氧核苷三磷酸（dNTP）dATP、dG2、缓冲液（buffer）标准10×：140mMTris-HCl（pH8.8）

4~8mMMgCl240mM(NH4)2SO430μg/mlBSA16mMDTT不同厂家生产的DNA聚合酶所用到的buffer不同。2、缓冲液（buffer）标准10×：140mMTris3、引物（primer）

最佳引物使用浓度为0.1μM~1.0μM之间。引物浓度太低，扩增产物太少；引物浓度太高，易出现非特异性扩增反应。一般贮存浓度：10μM

使用浓度：0.4μM引物设计要求:

设计的引物的核苷酸序列必须与模板链3’端的一段核苷酸序列互补,且3’端必须有游离的-OH基团；引物一般由20~30个核苷酸组成，4种核苷酸尽可能随机分布，GC含量应达40~60%；引物中应尽量避免回纹序列出现；引物中最好含有进一步操作中可利用的限制性核酸内切酶识别序列。3、引物（primer）最佳引物使用浓度为0.Tm（解链温度）值的计算公式：引物长度＜20nt时：Tm=4×（G+C）+2×（A+T）引物长度＞20nt时：Tm=81.5+0.41×（GC）%－600/LPCR过程中选择退火温度时，一般为（Tm－5）℃Tm（解链温度）值的计算公式：引物长度＜20nt时：Tm=44、模板DNA作为PCR的靶DNA一般是一个待扩增的特定双链DNA片段，应知道其两端20~30bp的核苷酸序列，供设计一对引物之用。PCR的模板是一条单链DNA片段，其3’端具有与引物杂交的序列。4、模板DNA作为PCR的靶DNA一般是一个待扩增的特定双5、耐高温DNA聚合酶TaqDNA聚合酶

来自嗜热古细菌Thermusaquaticus。该菌1967年从温泉中分离，最适生长温度70℃。现市场上销售的是该基因在E.coli细胞中的表达产物。特征：相对分子质量为94×103，为单分子酶，具较强的5’→3’DNA聚合酶活性和较弱的5’→3’外切酶活性，缺乏3’→5’外切酶活性。最适pH9.0，最适反应温度75℃。合成出错几率8.9×10-5～1.1×10-4。PwoDNA聚合酶

来自喜温性古细菌Pyrococcuswoesei。现市场上销售的是该基因在E.coli细胞中的表达产物。特征：相对分子质量为90×103，具较强的5’→3’DNA聚合酶活性，兼3’→5’外切酶活性。耐热性更高，保真度比TaqDNA聚合酶高10倍。5、耐高温DNA聚合酶TaqDNA聚合酶

TthDNA聚合酶来自喜温性真细菌ThermusthermophilusHB8。具较强的5’→3’DNA聚合酶活性，缺乏3’→5’外切酶活性。最适pH9.0，最适反应温度75℃。Mg2+存在时，以DNA为模板合成DNA，Mn2+存在时，可以RNA为模板合成cDNA，用于RT-PCR系统。VentDNA聚合酶来自嗜热高温球菌Thermococcuslitoralis

。相对分子质量85×103。100℃时该酶半衰期为1.8hr，具有3’→5’外切酶校对活性。合成的准确度比用TaqDNA聚合酶高5～

15倍。

PfuDNA聚合酶来自激烈热球菌Pyrococcusfariosus。保真度较高。TthDNA聚合酶来自喜温性真细菌Thermusth

KODDNA聚合酶特征：①具有强力的3’→5’核酸外切酶活性，与TaqDNA聚合酶相比，保真度比后者高50倍左右。②合成速度比TaqDNA聚合酶快2倍，比PfuDNA聚合酶快6倍。③耐热性比TaqDNA聚合酶好，在100℃、1小时的热处理后仍可保持约70％的活性，故根据需要可以将热变性步骤的温度设定值提得更高，这对处理GC含量高的模板等具有特异性高级结构的样品非常有利。KODDNA聚合酶特征：①具有强力的3’→5’核酸外PCR反应程序1、常规程序90～98℃预热30sec～5min；90～98℃变性15～30sec；40～60℃退火30sec；72℃延伸1min（1kb）；72℃延伸7～10min；4℃

保存。20～35循环PCR反应程序1、常规程序90～98℃预热30sec～5反应底物和产物在DNA扩增中不断发生变化，最终将会导致聚合反应进入平台期，平台期出现的时间与聚合酶的特性有关。研究表明，利用Klenow片段进行20次扩增后进入平台期，累积产物拷贝数为2×105，当采用TaqDNA聚合酶时，扩增25次后才进入平台期，拷贝数可达4×106。出现平台期的原因可能有：①后期循环酶浓度或聚合时间不足；②引物耗尽；③dNTP耗尽；④产物浓度过高，以致ds-DNA解链后又迅速退火，不能与引物结合。反应底物和产物在DNA扩增中不断发生变化，最终将会导致聚合反

一、基因工程概述

1.概念

基因工程：是指将外源基因经过剪切加工，再插入到一个具有自我复制能力的载体DNA中，就得到重组DNA，再将重组DNA转移到一个寄主细胞中，外源基因就可以随着寄主细胞的分裂进行繁殖，寄主细胞也借此获得外源基因所携带的新特性。

第二节基因工程

一、基因工程概述

1.概念

基因工程：是2.基因工程的基本程序及技术特点：

①基本程序：

分—切—接—转—筛

2.基因工程的基本程序及技术特点：

①基本程序：

基因工程的基本程序基因工程的基本程序分子生物学研究方法课件②技术特点：

1.可在体外根据需要进行人工的、有目的的基因重组、表达、测序、诱变、修复；

2.方法简便、快速、准确、特异，能保证研究与开发的需要。②技术特点：

1.可在体外根据需要进行人工3.基因工程的主要技术DNA、RNA的分离纯化凝胶电泳技术PCR技术DNA合成技术DNA重组微生物的培养、保存酶切鉴定

DNA测序分子杂交3.基因工程的主要技术DNA、RNA的分离纯化4.1概念4.基因克隆克隆的概念

⑴在多细胞的高等生物个体水平上，是指由具有相同基因型的同一物种的两个或数个个体组成的群体。⑵在细胞水平上，是指由同一个祖细胞分裂而来的一群遗传上同一的子细胞群体。⑶在分子生物学上，是指将外源DNA插入具有复制能力的载体DNA中，使之永久保存和复制的过程。4.1概念4.基因克隆克隆的概念

⑴在多细胞的高等生物个体水亚克隆的概念

是对已经获得的目的DNA片段进行重新克隆，其目的在于对目的DNA进行进一步分析，或者进行重组改造等。亚克隆的概念是对已经获得的目的DNA片段进行重新克隆，其目

基因克隆是指应用酶学的方法，在体外将目的基因与载体DNA结合成一具有自我复制能力的DNA分子（重组体），继而通过转化或转染宿主细胞、筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增、提取获得大量相同的DNA分子拷贝。基因克隆4.2基因克隆示意图4.2基因克隆示意图二.基因工程的要素及实施二.基因工程的要素及实施（一）、工具酶限制性核酸内切酶识别并在特定位点切割DNADNA连接酶通过生成3′,5′-磷酸二酯键,把两个或多个DNA片段连接成一个DNA分子DNA聚合酶Ⅰ探针标记、从3′-OH端补平双链ＤＮＡ中的缺口反转录酶以RNA链为模板，进行cDNA合成多核苷酸激酶5′－ＯＨ磷酸化、探针标记末端转移酶在双链核酸的末端3′－ＯＨ加上多聚单核苷酸碱性磷酸酶切除5′末端磷酸基1.常用的工具酶的功能：酶类名称功能（一）、工具酶限制性核酸内切酶识别并在特定位点切割DNADN

阿尔伯(Arber)、史密斯(Smith)和内森斯(Nathans)，获1978年度诺贝尔生理学和医学奖.2.一把特殊的剪刀

——限制性内切酶的发现阿尔伯(Arber)、史密斯(Smith)和3.限制性核酸内切酶(restrictionenzyme)的分类、作用及命名作用：识别双链DNA内部特异位点并裂解磷酸二酯键分类：Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型命名（举例）EcoRⅠ(E：属名；co：种名；R：株；Ⅰ：发现次序)3.限制性核酸内切酶(restrictionenzyme)3.限制性核酸内切酶(restrictionenzyme)的识别和切割识别和切割位点：回文结构4～6bp出现两种末端：粘性末端（粘端）

平头末端（平端）

产生了平头末端产生了粘性末端3.限制性核酸内切酶(restrictionenzyme)粘性末端与平头末端粘性末端与平头末端4.修饰与限制作用4.修饰与限制作用

活性：①5′→3′聚合酶活性：

②核酸外切酶活性：5′→3′外切酶活性3′→5′外切酶活性

DNApolⅠ经枯草杆菌蛋白酶裂解可得大、小两个片段大片段（Klenow片段）具有5′→3′聚合活性和3′→5′外切活性，是常用的工具酶。5.DNA聚合酶Ⅰ(polⅠ)

活性：①5′→3′聚合酶活性：5.DNA6.DNA连接酶6.DNA连接酶分子生物学研究方法课件7.同工异源酶：来源不同，但能识别和切割同一位点。8.同尾酶：识别序列不同，但产生相同的粘性末端。7.同工异源酶：来源不同，但能识别和切割同一位点。（二）、载体（vector）1.本质：DNA，能在宿主细胞中进行自我复制和表达2.克隆载体的种类：原核载体：质粒(pBR322,pUC…）噬菌体（λ，M13）等真核载体：动物病毒载体pLXSN等（二）、载体（vector）1.本质：DNA，能在宿3.载体的基本要求：

①.复制单位;

②.克隆位点(多个单克隆位点);

③.筛选标记;

④.分子量尽可能小;

⑤.外源DNA插入后不影响载体本身的复制能力.

没有一个天然的DNA完全符合载体条件,故使用时需进行改造.

3.载体的基本要求：

①.复制单位;

②.克隆位点(多

4.常用的克隆载体Ⅰ：质粒质粒(plasmid)—存在于细菌染色体外的小型环状双链DNA分子。

4.常用的克隆载体Ⅰ：质粒质粒(plas从天然质粒到质粒载体从天然质粒到质粒载体*大小2~10kb；*优点：易于操作、保存；*缺点：转化效率较低；*转化方法：化学法电转移法*应用：a.小基因组的克隆

b.单一序列的克隆(目的基因的克隆)（1）质粒载体的一般特点：*大小2~10kb；（1）质粒载体的一般特点：（2）理想的质粒载体具有如下特点：

①拷贝数多;②两三个遗传标志，如抗药性基因：抗氨苄青霉素基因(ampr)

、抗四环素基因(terr)；β-半乳糖苷酶基因(lacZ)——筛选标志③多个限制酶的单一切点，即多克隆位点(multiplecloningsites,MCS)（2）理想的质粒载体具有如下特点：①pBR系列

来源于Psc101、colE1和RSF2124三个天然质粒改造重组而成。pBR322是应用最多的大肠杆菌质粒载体，用氯霉素扩增法可使质粒DNA占细胞DNA总量的50%，这对制备大量质粒DNA极为有利。（3）质粒载体举例①pBR系列

来源于Psc101、colE1和R分子生物学研究方法课件分子生物学研究方法课件②pUC系列

pUC系列质粒（pUC8、9、12、13、18、19）具有pBR和M13的许多特性，一般2.7kb.含有Ampr基因和LacZ基因的一部分。

②pUC系列

pUC系列质粒（pUC8、9分子生物学研究方法课件5.常用的克隆载体Ⅱ——噬菌体载体5.常用的克隆载体Ⅱ——噬菌体载体（1）λ噬菌体(λphage)的特点：①.一种能感染大肠杆菌的病毒，野生型含有双链线状DNA分子（λDNA），长度48.5kb,分子两端各有一个12bp组成的粘性末端,感染大肠杆菌后,线状DNA通过粘性末端互补连接成环,连接处称COS位点。②.本身有复制体系;③.感染大肠杆菌后要进行环化（1）λ噬菌体(λphage)的特点：λDNA感染大肠杆菌后的环化过程λDNA感染大肠杆菌后的环化过程④.λDNA在体外可包装成病毒颗粒,感染效率高;⑤.载体容量大,可装入大片段外源DNA(20kb);⑥.可人工加入多克隆位点;⑦.筛选容易——噬菌斑筛选;⑧.主要用于DNA文库的构建.④.λDNA在体外可包装成病毒颗粒,感染（2）M13噬菌体

特点：一种丝状单链噬菌体，闭环正链ssDNA，全长6.5kb,感染大肠杆菌后,ssDNA转变为dsDNA,可用作克隆载体。

最大优点：产生单链DNA,可制备单链DNA探针。

（2）M13噬菌体

特点：一种丝状单链噬菌体，闭

柯斯质粒(cosmid)粘性质粒

基本结构特征:是一种人工改造的载体,双链环状DNA

组成:λDNA的cos区+质粒+控制包装作用的序列

克隆容量：31~45kb

常用的克隆载体Ⅲ——柯斯质粒

柯斯质粒(cosmid)粘性质粒

基本结4.cosmid较小,约4–6kb.

5.cosmid重组体可象噬菌体一样进行外壳装配,形成噬菌体颗粒,感染大肠杆菌效率比质粒高得多,进入宿主细胞后,只能象质粒一样扩增,并依赖抗药性被筛选.1.具有λ-DNA的COS位点;

2.具有质粒的复制起点和抗药性标记(Ampr);

3.具有多种单一的酶切位点.

柯斯质粒(cosmid)的特点:

4.cosmid较小,约4–6kb.

5.cosm柯斯质粒的优缺点:

1.克隆效率高;

2.可利用质粒DNA的方式扩增;

3.可克隆较大DNA片段;

主要用于真核基因的克隆,基因组文库构建

4.缺点:产生串联现象。

柯斯质粒的优缺点:

1.克隆效率高;

2.可利用质粒YAC载体

酵母人工染色体，可容纳外源基因片段长达200kb-1000kb，含有酵母第4号染色体的着丝粒和自主复制序列CEN4、ARS1，作为端粒的Tel序列，选择性标志URA3、TRP1和SUP4，能在酵母中稳定的复制，常用于大的染色体基因组DNA文库构建。其他克隆载体：YAC载体其他克隆载体：

插入型载体——含单一的限制性酶切位点，可接受10kb以下的外源片段，可用于cDNA文库构建；

取代型载体——含某一限制性酶的两个切点，可接受20kb左右的外源片段，可用于基因组DNA文库构建。经人工改造生成的基因克隆载体类型

插入型载体——含单一的限制性酶切位点，可接受1目的基因(targetDNA)的制备目的基因（外源基因）制备基因组DNA基因文库(genomiclibrary)—存在于转化细菌中、克隆载体携带的所有基因组DNA的集合制备cDNAcDNA文库(cDNAlibrary)制备用于表达的基因片段：PCR技术、化学合成目的基因(targetDNA)的制备目的基因（外源基因）文库构建

基因组文库\cDNA文库

区别：材料

基因结构不同

文库内容

载体

使用范围文库构建

基因组文库\cDNA文库

区别：材料

构建基因文库的克隆载体粘粒(Cosmid)细菌人工染色体(BAC)酵母人工染色体(YAC)P1噬菌体人工染色体(PAC)构建基因文库的克隆载体粘粒(Cosmid)基因文库的构建的步骤:①载体DNA的分离②真核生物DNA的分离③部分酶解④片段回收(9-23kb)⑤载体与插入片段的连接⑥包装⑦文库的效价测定⑧文库的扩增⑨文库的保存⑩重组克隆鉴定基因文库的构建的步骤:①载体DNA的分离cDNA文库的构建：基因重组反转录酶mRNAcDNA高丰度中丰度低丰度cDNA文库的构建：基因重组反转录酶mRNAcDNA高丰度中

cDNA文库的构建cDNA文库能否构建成功的关键是:

高质量的mRNA的获得一个好的cDNA文库的特征:①包含有足够大量的独立克隆，代表最初的mRNA样品中的所有转录本②克隆中包含接近全长的mRNAcDNA文库的构建cDNA文库能cDNAlibraryconstructionAAAAA5’3’mRNA(allmRNAsincell)annealoligo(dT)primersof12-18basesinlengthAAAAATTTTT5’3’5’addreversetranscriptaseanddNTPsAAAAATTTTT5’3’3’5’cDNAaddRNaseH(specificfortheRNAstrandofanRNA-DNAhybrid)andcarryoutapartialdigestionAATTTTT5’shortRNAfragmentsserveasprimersforsecondstrandsynthesisusingDNApolymeraseI3’3’cDNAlibraryconstructionAAAAAAAAATTTTT5’3’shortRNAfragmentsserveasprimersforsecondstrandsynthesisusingDNApolymeraseIAAATTTTT5’3’DNApolymeraseIremovestheremainingRNAwithits5’to3’exonucleaseactivityandcontinuessynthesisDNAligasesealsthegapsAAATTTTT5’3’AAAAATTTTT5’3’double-strandedcDNAAAAAA5’shortRNAfragmentsserAAAAATTTTT5’3’NNNNNNNNGNNNNNNNNCTTAAEcoRIlinkersareligatedtobothends usingDNAligaseAAAAANNNNNNNNGTTTTTNNNNNNNNCTTAAdouble-strandedcDNAcopiesofmRNAwithEcoRIcohesiveendsarenowreadytoligateintoabacteriophagelambdavectorcutwithEcoRI5’3’AATTCNNNNNNNNGNNNNNNNNAAAAA5’NNNNNNNNGEcoRIlinkers分子生物学研究方法课件CIP:牛小肠碱性磷酸酶粘性末端连接法（连接效率高）和去５’磷酸连接法载体与目的基因的连接方法CIP:牛小肠碱性磷酸酶粘性末端连接法（连接效率高）载体与目人工接头法：人工接头法：同聚物接尾法同聚物接尾法重组DNA技术的基本过程小结目的基因的制备载体的选择和制备DNA分子的体外连接将外源DNA导入宿主细胞目的基因的筛选和鉴定重组DNA技术的基本过程小结目的基因的制备基因工程的基本操作步骤及其应用意义基因工程的基本操作步骤：①获取外源目的基因；②寻找基因载体(通常为质粒、噬菌体等)使用限制性内切酶，使目的基因与载体产生相同粘性末端，两个末端互补连接，形成重组DNA；③通过转化(或感染)将重组DNA引入寄主细胞；④从大量的寄主细胞中筛选出带有重组DNA的细胞进行培养。基因工程的基本操作步骤及其应用意义基因工程的基本操作步骤：意义：①利用基因工程技术，可以大量生产在一些正常细胞中产量很低的多肽物质，用于医药等工业生产中；②定向改造生物基因结构，生产抗病强、品质优的各种农副产品，以提高经济价值；③用于生命科学的基础研究；④值得注意的是，基因工程技术若使用不当、管理不善，也会给人类带来灾难。意义：分子生物学研究方法分子生物学研究方法第一节基因操作的主要技术原理

1．核酸的凝胶电泳(Agarose&Polyacrylamide)

将某种分子放到特定的电场中，它就会以一定的速度向适当的电极移动。某物质在电场作用下的迁移速度叫作电泳的速率，它与电场强度成正比，与该分子所携带的净电荷数成正比，而与分子的磨擦系数成反比（分子大小、极性、介质的粘度系数等）。在生理条件下，核酸分子中的磷酸基团是离子化的，所以，DNA和RNA实际上呈多聚阴离子状态（Polyanions）。将DNA、RNA放到电场中，它就会由负极→正极移动。第一节基因操作的主要技术原理1．核酸的凝胶电泳(A分子生物学研究方法课件2．核酸的分子杂交技术

在大多数核酸杂交反应中，经过凝胶电泳分离的DNA或RNA分子，都是在杂交之前，通过毛细管作用或电导作用按其在凝胶中的位置原封不动地“吸印”转移到滤膜上的。常用的滤膜有尼龙滤膜、硝酸纤维素滤膜，叠氮苯氧甲基纤维素滤纸（DBM）和二乙氨基乙基纤维素滤膜（DEAE）2．核酸的分子杂交技术核酸分子杂交实验包括如下两个步骤：

1.将核酸样品转移到固体支持物滤膜上，这个过程特称为核酸印迹(nucleicacidblotting)转移，主要有电泳凝胶核酸印迹法、斑点和狭线印迹法(dotandslotblotting)、菌落和噬菌斑印迹法(colonyandplaqueblotting)；

2.将具有核酸印迹的滤膜同带有放射性标记或其它标记的DNA或RNA探针进行杂交。所以有时也称这类核酸杂交为印迹杂交。核酸分子杂交实验包括如下两个步骤：

1.将核酸样品转移分子生物学研究方法课件分子生物学研究方法课件3．细菌的转化

所谓细菌转化，是指一种细菌菌株由于捕获了来自另一种细菌菌株的DNA，而导致性状特征发生遗传改变的生命过程。这种提供转化DNA的菌株叫做供体菌株，而接受转化DNA的寄主菌株则称做受体菌株。大肠杆菌是最广泛使用的实验菌株。在加入转化DNA之前，必须预先用CaCl2处理大肠杆菌细胞，使之呈感受态（CompetentCells）。Mg2+对维持外源DNA的稳定性起重要作用，质粒DNA中的抗生素是筛选标记。

3．细菌的转化4．DNA序列分析a.Sanger的双脱氧链终止法

Cambridge的F.Sanger在1977年发明用双脱氧链终止法测定单链DNA的序列，其基本原理如下：①DNA聚合酶能够用单链DNA作为模板，合成准确的DNA互补链；DNA聚合酶常用Klenow大片段，无5'→3'外切酶活性。②该酶能够用2'，3'--双脱氧核苷三磷酸作底物并将其聚合到新生寡核苷酸链的3'-末端，从而终止其延伸反应。在DNA测序反应中，加入模板DNA，引物（特异性引物，如T7，T3，M13等），DNA聚合酶，dATP，dTTP，dGTP，dCTP和一种ddNTP。4．DNA序列分析分子生物学研究方法课件双脱氧链末端终止法测序基本原理示意图双脱氧链末端终止法测序基本原理示意图分子生物学研究方法课件b．DNA序列分析自动化(分析反应\读片过程

)

用四甲基若丹明(Tetramethylrhodamine)作为荧光剂标记DNA引物，带有这种引物的DNA片段能在激光诱导下发出荧光。按照标准的双脱氧终止法或化学终止法进行测序反应，跑DNA凝胶后,用计算机检测。b．DNA序列分析自动化(分析反应\读片过程)DNA测序的全过程(实际)DNA测序的全过程(实际)5．基因的定点诱变（site-directedmutagenesis）

使已克隆基因或DNA片段中的任何一个特定碱基发生取代、插入或缺失变化的过程叫作基因的定点诱变，是基因工程和蛋白质工程的重要手段。如：盒式诱变(cassettemutagenesis)，包括盒式取代诱变和混合寡核苷酸诱变两种方式。5．基因的定点诱变（site-directedmutag6．利用DNA与蛋白质的相互作用进行核酸研究.a.凝胶滞缓实验(Gelretardationassay)，又称DNA迁移率变化试验(DNAmobilityshiftassay--EMSA)。

6．利用DNA与蛋白质的相互作用进行核酸研究.a.凝胶滞b．DNaseI印迹试验（DNaseIfootprinting）主要步骤：

①用32P标记DNA双链末端，并用RE切去一端；

②加入细胞特定周期蛋白质提取物，温育；

③加入适量DNaseI或硫酸二甲酯-六氢吡啶，使DNA链发生断裂。

这一反应中，DNaseI或硫酸二甲酯的用量非常关键，要保证每一条DNA链只发生一次磷酸二酯断裂！

④沉淀DNA（包括与DNA相结合的蛋白质）；

⑤进行DNA凝胶分析。

如果某个蛋白质已经与DNA的特定区段相结合，那么，它就会保证该区段DNA免受消化或降解作用。在电泳凝胶的放射自显影图片上，相应于蛋白质结合的部位不产生放射性标记的条带,而是出现了一个空白的区域,形象地称为足迹。b．DNaseI印迹试验（DNaseIfootp7聚合酶链式反应（PCR）技术PCR（polymerasechainreaction）：聚合酶链式反应。1983年由美国科学家KaryMullis提出，1993年因此而获诺贝尔奖。PCR技术是指通过模拟体内DNA复制的方式，在体外选择性地将DNA某个特殊区域扩增出来的技术，它包括变性、退火、延伸三个步骤。7聚合酶链式反应（PCR）技术PCR（polymeraseKaryB.Mullis(1944-)，在Cetus公司工作期间，发明了PCR。他原本是要合成DNA引物来进行测序工作，却常为没有足够多的模板DNA而烦恼。1983年春夏之交的一个晚上，他开车去乡下别墅的路上萌发了用两个引物（而不是一个引物）去扩增模板DNA的想法…...KaryB.Mullis(1944-)，在CetusMullis开车的时候,瞬间感觉两排路灯就是DNA的两条链，自己的车和对面开来的车象是DNA聚合酶，面对面地合成.DNA，……Mullis开车的时候,瞬间感觉两排路灯就是DNA的两条链1983年9月中旬。Mullis在反应体系中加入DNA聚合酶后在37℃一直保温。结果第二天在琼脂糖电泳上没有看到任何条带。于是他认识到有必要用加热来解链，每次解链后再加入DNA聚合酶进行反应，依次循环。1983年12月，他终于看到了被同位素标记的PCR条带。Mullis的第一个PCR实验1983年9月中旬。Mullis在反应体系中加入DNA聚合酶PCR的基本原理

引物

dNTP

耐热DNA聚合酶模板DNA

变性（denaturation）：90～98℃；退火（annealing）：37～

72℃；延伸（extension）：72℃。基本要素扩增步骤PCR的基本原理引物变性（denaturation）：9分子生物学研究方法课件5’-GGTA……TCAT-3’3’-CCAT……AGTA-5’5’GGTA-OH（引物1）5’ATGA-OH（引物2）90~98℃3’-CCAT…………AGTA-5’5’-GGTA…………TCAT-3’37~72℃3’-CCAT…………AGTA-5’5’-GGTA…………TCAT-3’5’GGTA-OHOH-AGTA5’70~75℃5’-GGTA……TCAT-3’3’-CCAT……AGTA-5’5’-GGTA……TCAT-3’3’-CCAT……AGTA-5’90~98℃37~72℃3’-CCAT……AGTA-5’5’-GGTA……TCAT-3’5’GGTA-OHOH-AGTA5’70~75℃5’-GGTA……TCAT-3’3’-CCAT……AGTA-5’5’-GGTA……TCAT-3’3’-CCAT……AGTA-5’3’-CCAT……AGTA-5’5’-GGTA……TCAT-3’(略)(底物DNA)(略)(略)PCR扩增特异性DNA片段全过程5’-GGTA……TCAT-3’5’GGTA-OH（引物1分子生物学研究方法课件PCR反应体系1、脱氧核苷三磷酸（dNTP）dATP、dGTP、dCTP、dTTP是PCR的原材料，通过PCR过程聚合成互补链DNA。贮存浓度：2.5mM使用浓度：200μM使用浓度不当会影响扩增的产量、特异性和保真度。PCR反应体系1、脱氧核苷三磷酸（dNTP）dATP、dG2、缓冲液（buffer）标准10×：140mMTris-HCl（pH8.8）

4~8mMMgCl240mM(NH4)2SO430μg/mlBSA16mMDTT不同厂家生产的DNA聚合酶所用到的buffer不同。2、缓冲液（buffer）标准10×：140mMTris3、引物（primer）

最佳引物使用浓度为0.1μM~1.0μM之间。引物浓度太低，扩增产物太少；引物浓度太高，易出现非特异性扩增反应。一般贮存浓度：10μM

使用浓度：0.4μM引物设计要求:

设计的引物的核苷酸序列必须与模板链3’端的一段核苷酸序列互补,且3’端必须有游离的-OH基团；引物一般由20~30个核苷酸组成，4种核苷酸尽可能随机分布，GC含量应达40~60%；引物中应尽量避免回纹序列出现；引物中最好含有进一步操作中可利用的限制性核酸内切酶识别序列。3、引物（primer）最佳引物使用浓度为0.Tm（解链温度）值的计算公式：引物长度＜20nt时：Tm=4×（G+C）+2×（A+T）引物长度＞20nt时：Tm=81.5+0.41×（GC）%－600/LPCR过程中选择退火温度时，一般为（Tm－5）℃Tm（解链温度）值的计算公式：引物长度＜20nt时：Tm=44、模板DNA作为PCR的靶DNA一般是一个待扩增的特定双链DNA片段，应知道其两端20~30bp的核苷酸序列，供设计一对引物之用。PCR的模板是一条单链DNA片段，其3’端具有与引物杂交的序列。4、模板DNA作为PCR的靶DNA一般是一个待扩增的特定双5、耐高温DNA聚合酶TaqDNA聚合酶

来自嗜热古细菌Thermusaquaticus。该菌1967年从温泉中分离，最适生长温度70℃。现市场上销售的是该基因在E.coli细胞中的表达产物。特征：相对分子质量为94×103，为单分子酶，具较强的5’→3’DNA聚合酶活性和较弱的5’→3’外切酶活性，缺乏3’→5’外切酶活性。最适pH9.0，最适反应温度75℃。合成出错几率8.9×10-5～1.1×10-4。PwoDNA聚合酶

来自喜温性古细菌Pyrococcuswoesei。现市场上销售的是该基因在E.coli细胞中的表达产物。特征：相对分子质量为90×103，具较强的5’→3’DNA聚合酶活性，兼3’→5’外切酶活性。耐热性更高，保真度比TaqDNA聚合酶高10倍。5、耐高温DNA聚合酶TaqDNA聚合酶

TthDNA聚合酶来自喜温性真细菌ThermusthermophilusHB8。具较强的5’→3’DNA聚合酶活性，缺乏3’→5’外切酶活性。最适pH9.0，最适反应温度75℃。Mg2+存在时，以DNA为模板合成DNA，Mn2+存在时，可以RNA为模板合成cDNA，用于RT-PCR系统。VentDNA聚合酶来自嗜热高温球菌Thermococcuslitoralis

。相对分子质量85×103。100℃时该酶半衰期为1.8hr，具有3’→5’外切酶校对活性。合成的准确度比用TaqDNA聚合酶高5～

15倍。

PfuDNA聚合酶来自激烈热球菌Pyrococcusfariosus。保真度较高。TthDNA聚合酶来自喜温性真细菌Thermusth

KODDNA聚合酶特征：①具有强力的3’→5’核酸外切酶活性，与TaqDNA聚合酶相比，保真度比后者高50倍左右。②合成速度比TaqDNA聚合酶快2倍，比PfuDNA聚合酶快6倍。③耐热性比TaqDNA聚合酶好，在100℃、1小时的热处理后仍可保持约70％的活性，故根据需要可以将热变性步骤的温度设定值提得更高，这对处理GC含量高的模板等具有特异性高级结构的样品非常有利。KODDNA聚合酶特征：①具有强力的3’→5’核酸外PCR反应程序1、常规程序90～98℃预热30sec～5min；90～98℃变性15～30sec；40～60℃退火30sec；72℃延伸1min（1kb）；72℃延伸7～10min；4℃

保存。20～35循环PCR反应程序1、常规程序90～98℃预热30sec～5反应底物和产物在DNA扩增中不断发生变化，最终将会导致聚合反应进入平台期，平台期出现的时间与聚合酶的特性有关。研究表明，利用Klenow片段进行20次扩增后进入平台期，累积产物拷贝数为2×105，当采用TaqDNA聚合酶时，扩增25次后才进入平台期，拷贝数可达4×106。出现平台期的原因可能有：①后期循环酶浓度或聚合时间不足；②引物耗尽；③dNTP耗尽；④产物浓度过高，以致ds-DNA解链后又迅速退火，不能与引物结合。反应底物和产物在DNA扩增中不断发生变化，最终将会导致聚合反

一、基因工程概述

1.概念

基因工程：是指将外源基因经过剪切加工，再插入到一个具有自我复制能力的载体DNA中，就得到重组DNA，再将重组DNA转移到一个寄主细胞中，外源基因就可以随着寄主细胞的分裂进行繁殖，寄主细胞也借此获得外源基因所携带的新特性。

第二节基因工程

一、基因工程概述

1.概念

基因工程：是2.基因工程的基本程序及技术特点：

①基本程序：

分—切—接—转—筛

2.基因工程的基本程序及技术特点：

①基本程序：

基因工程的基本程序基因工程的基本程序分子生物学研究方法课件②技术特点：

1.可在体外根据需要进行人工的、有目的的基因重组、表达、测序、诱变、修复；

2.方法简便、快速、准确、特异，能保证研究与开发的需要。②技术特点：

1.可在体外根据需要进行人工3.基因工程的主要技术DNA、RNA的分离纯化凝胶电泳技术PCR技术DNA合成技术DNA重组微生物的培养、保存酶切鉴定

DNA测序分子杂交3.基因工程的主要技术DNA、RNA的分离纯化4.1概念4.基因克隆克隆的概念

⑴在多细胞的高等生物个体水平上，是指由具有相同基因型的同一物种的两个或数个个体组成的群体。⑵在细胞水平上，是指由同一个祖细胞分裂而来的一群遗传上同一的子细胞群体。⑶在分子生物学上，是指将外源DNA插入具有复制能力的载体DNA中，使之永久保存和复制的过程。4.1概念4.基因克隆克隆的概念

⑴在多细胞的高等生物个体水亚克隆的概念

是对已经获得的目的DNA片段进行重新克隆，其目的在于对目的DNA进行进一步分析，或者进行重组改造等。亚克隆的概念是对已经获得的目的DNA片段进行重新克隆，其目

基因克隆是指应用酶学的方法，在体外将目的基因与载体DNA结合成一具有自我复制能力的DNA分子（重组体），继而通过转化或转染宿主细胞、筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增、提取获得大量相同的DNA分子拷贝。基因克隆4.2基因克隆示意图4.2基因克隆示意图二.基因工程的要素及实施二.基因工程的要素及实施（一）、工具酶限制性核酸内切酶识别并在特定位点切割DNADNA连接酶通过生成3′,5′-磷酸二酯键,把两个或多个DNA片段连接成一个DNA分子DNA聚合酶Ⅰ探针标记、从3′-OH端补平双链ＤＮＡ中的缺口反转录酶以RNA链为模板，进行cDNA合成多核苷酸激酶5′－ＯＨ磷酸化、探针标记末端转移酶在双链核酸的末端3′－ＯＨ加上多聚单核苷酸碱性磷酸酶切除5′末端磷酸基1.常用的工具酶的功能：酶类名称功能（一）、工具酶限制性核酸内切酶识别并在特定位点切割DNADN

阿尔伯(Arber)、史密斯(Smith)和内森斯(Nathans)，获1978年度诺贝尔生理学和医学奖.2.一把特殊的剪刀

——限制性内切酶的发现阿尔伯(Arber)、史密斯(Smith)和3.限制性核酸内切酶(restrictionenzyme)的分类、作用及命名作用：识别双链DNA内部特异位点并裂解磷酸二酯键分类：Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型命名（举例）EcoRⅠ(E：属名；co：种名；R：株；Ⅰ：发现次序)3.限制性核酸内切酶(restrictionenzyme)3.限制性核酸内切酶(restrictionenzyme)的识别和切割识别和切割位点：回文结构4～6bp出现两种末端：粘性末端（粘端）

平头末端（平端）

产生了平头末端产生了粘性末端3.限制性核酸内切酶(restrictionenzyme)粘性末端与平头末端粘性末端与平头末端4.修饰与限制作用4.修饰与限制作用

活性：①5′→3′聚合酶活性：

②核酸外切酶活性：5′→3′外切酶活性3′→5′外切酶活性

DNApolⅠ经枯草杆菌蛋白酶裂解可得大、小两个片段大片段（Klenow片段）具有5′→3′聚合活性和3′→5′外切活性，是常用的工具酶。5.DNA聚合酶Ⅰ(polⅠ)

活性：①5′→3′聚合酶活性：5.DNA6.DNA连接酶6.DNA连接酶分子生物学研究方法课件7.同工异源酶：来源不同，但能识别和切割同一位点。8.同尾酶：识别序列不同，但产生相同的粘性末端。7.同工异源酶：来源不同，但能识别和切割同一位点。（二）、载体（vector）1.本质：DNA，能在宿主细胞中进行自我复制和表达2.克隆载体的种类：原核载体：质粒(pBR322,pUC…）噬菌体（λ，M13）等真核载体：动物病毒载体pLXSN等（二）、载体（vector）1.本质：DNA，能在宿3.载体的基本要求：

①.复制单位;

②.克隆位点(多个单克隆位点);

③.筛选标记;

④.分子量尽可能小;

⑤.外源DNA插入后不影响载体本身的复制能力.

没有一个天然的DNA完全符合载体条件,故使用时需进行改造.

3.载体的基本要求：

①.复制单位;

②.克隆位点(多

4.常用的克隆载体Ⅰ：质粒质粒(plasmid)—存在于细菌染色体外的小型环状双链DNA分子。

4.常用的克隆载体Ⅰ：质粒质粒(plas从天然质粒到质粒载体从天然质粒到质粒载体*大小2~10kb；*优点：易于操作、保存；*缺点：转化效率较低；*转化方法：化学法电转移法*应用：a.小基因组的克隆

b.单一序列的克隆(目的基因的克隆)（1）质粒载体的一般特点：*大小2~10kb；（1）质粒载体的一般特点：（2）理想的质粒载体具有如下特点：

①拷贝数多;②两三个遗传标志，如抗药性基因：抗氨苄青霉素基因(ampr)

、抗四环素基因(terr)；β-半乳糖苷酶基因(lacZ)——筛选标志③多个限制酶的单一切点，即多克隆位点(multiplecloningsites,MCS)（2）理想的质粒载体具有如下特点：①pBR系列

来源于Psc101、colE1和RSF2124三个天然质粒改造重组而成。pBR322是应用最多的大肠杆菌质粒载体，用氯霉素扩增法可使质粒DNA占细胞DNA总量的50%，这对制备大量质粒DNA极为有利。（3）质粒载体举例①pBR系列

来源于Psc101、colE1和R分子生物学研究方法课件分子生物学研究方法课件②pUC系列

pUC系列质粒（pUC8、9、12、13、18、19）具有pBR和M13的许多特性，一般2.7kb.含有Ampr基因和LacZ基因的一部分。

②pUC系列

pUC系列质粒（pUC8、9分子生物学研究方法课件5.常用的克隆载体Ⅱ——噬菌体载体5.常用的克隆载体Ⅱ——噬菌体载体（1）λ噬菌体(λphage)的特点：①.一种能感染大肠杆菌的病毒，野生型含有双链线状DNA分子（λDNA），长度48.5kb,分子两端各有一个12bp组成的粘性末端,感染大肠杆菌后,线状DNA通过粘性末端互补连接成环,连接处称COS位点。②.本身有复制体系;③.感染大肠杆菌后要进行环化（1）λ噬菌体(λphage)的特点：λDNA感染大肠杆菌后的环化过程λDNA感染大肠杆菌后的环化过程④.λDNA在体外可包装成病毒颗粒,感染效率高;⑤.载体容量大,可装入大片段外源DNA(20kb);⑥.可人工加入多克隆位点;⑦.筛选容易——噬菌斑筛选;⑧.主要用于DNA文库的构建.④.λDNA在体外可包装成病毒颗粒,感染（2）M13噬菌体

特点：一种丝状单链噬菌体，闭环正链ssDNA，全长6.5kb,感染大肠杆菌后,ssDNA转变为dsDNA,可用作克隆载体。

最大优点：产生单链DNA,可制备单链DNA探针。

（2）M13噬菌体

特点：一种丝状单链噬菌体，闭

柯斯质粒(cosmid)粘性质粒

基本结构特征:是一种人工改造的载体,双链环状DNA

组成:λDNA的cos区+质粒+控制包装作用的序列

克隆容量：31~45kb

常用的克隆载体Ⅲ——柯斯质粒

柯斯质粒(cosmid)粘性质粒

基本结4.cosmid较小,约4–6kb.

5.cosmid重组体可象噬菌体一样进行外壳装配,形成噬菌体颗粒,感染大肠杆菌效率比质粒高得多,进入宿主细胞后,只能象质粒一样扩增,并依赖抗药性被筛选.1.具有λ-DNA的COS位点;

2.具有质粒的复制起点和抗药性标记(Ampr);

3.具有多种单一的酶切位点.

柯斯质粒(cosmid)的特点:

4.cosmid较小,约4–6kb.

5.cosm柯斯质粒的优缺点:

1.克隆效率高;

2.可利用质粒DNA的方式扩增;

3.可克隆较大DNA片段;

主要用于真核基因的克隆,基因组文库构建

4.缺点:产生串联现象。

柯斯质粒的优缺点:

1.克隆效率高;

2.可利用质粒YAC载体

酵母人工染色体，可容纳外源基因片段长达200kb-1000kb，含有酵母第4号染色体的着丝粒和自主复制序列CEN4、ARS1，作为端粒的Tel