神秘果种子超低温保存技术规程

T/CSMAXXXX－2018神秘果种子超低温保存技术规程范围本标准规定了神秘果[Synsepalumdulcificum（Schumach.&Thonn.）Daniell]种子超低温保存过程中的术语和定义、种子的选择、种子前处理、种子保存量、种子冷冻方式、恢复培养等技术要求。本标准适用于神秘果种子的超低温长期贮藏。规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T3543.6农作物种子检验规程水分测定GB/T3543.7农作物种子检验规程其他项目检验术语和定义下列术语和定义适用于本文件。神秘果Synsepalumdulcificum（Schumach.&Thonn.）Daniell为山榄科（Sapotaceae）神秘果属（Synsepalum）常绿灌木植物。果肉中含有称为神秘果素（Miraculin）的糖蛋白，能催化苹果酸、柠檬酸类物质转化为果糖，改变人的味觉，使酸的食物变甜。在加纳、刚果等西非热带地区常用来调节食物味道。20世纪60年代，周恩来总理到西非访问时，加纳共和国把神秘果作为国礼送给周总理；此后，神秘果开始在我国栽培。神秘果是一种集趣味性、观赏性和食用性于一体的珍贵植物。收载于《世界药用植物速查辞典（2015）》。神秘果果实Synsepalumdulcificum（Schumach.&Thonn.）Daniellfruits果实为浆果，椭圆形，长1.5~2cm，果肉近果皮处有厚壁组织而成薄革质至骨质外皮。果皮成熟前绿色，成熟后鲜红色，果肉较薄。神秘果种子Synsepalumdulcificum（Schumach.&Thonn.）Daniellseeds神秘果的播种材料为完整种子，贮藏特性判断为顽拗性种子。种子种皮褐色，具1至数枚，通常具油质胚乳或没有，硬而光亮，富含单宁，有各种各样的疤痕，子叶薄或厚，有时叶状。种子超低温保存seedofcryopreservation指将经过前处理的神秘果种子置于液氮（-196℃）中保存。种子的选择果实采收6月至7月以及11月至12月，当果皮变为鲜红色，果肉变软后，即可采收，去除果皮和果肉，取出种子。种子选择挑选发育饱满、结实、健康的种子，置于4℃冰箱中保存备用（存放时间不超过1个月）。种子前处理生活力检测参照GB/T3543.7中的2，3，5-三苯基氯化四氮唑（TTC）法检测种子生活力。随机抽取30粒种子，沿种脊小心将种子分成2瓣，放培养皿内，内侧面向下，滴入TTC溶液浸没种子，室温（25℃）避光放置4h后观察染色结果。生活力计算直接用肉眼对染色结果进行观察鉴定。凡胚及胚乳全部染成有XX的鲜红色，且组织状态正常的，为有活力的种子；否则为无生活力的种子。计算：生活力=有活力的种子数/总的种子数×100%待保存的神秘果种子生活力应≥90%。含水量范围用尼龙网袋包裹神秘果种子，置于盛有变色硅胶的干燥器内，硅胶与种子的体积比为5000:1，室温条件下干燥处理0~40h，在干燥过程中定期测定种子含水量，将种子含水量由35%~40%降至23%~35%。参照GB/T3543.6中的高恒温烘干法（130℃烘干1h）测定种子含水量（W0），W0=（鲜重-绝干重）/鲜重×100%。种子保存量神秘果种子保存量不少于240粒，以便后期的活力检测使用。种子冷冻方式神秘果种子超低温保存的冷冻方式为玻璃化冷冻法，即将装有种子的15mL冻存管（每管12粒种子）置于装载液（LS）中并于25℃处理种子25min，再用玻璃化保护溶液（PVS2）冰浴处理种子30min，换上预冷新鲜的PVS2后迅速投入液氮中进行超低温保存。恢复培养种子解冻处理液氮中至少冻存24h后，取出2个冻存管，立即放入40℃水浴中快速解冻5min，而后用洗涤液（DS）浸泡15min，并用纯净水洗涤3次。冻后种子生活力检测取出1管解冻后的种子，参照5.1~5.2生活力检测方法，进行超低温保存后的初始生活力检测。当种子生活力≥90%时视为保存成功。恢复培养将剩下1管解冻后的神秘果种子，播种到带有无菌滤纸的带盖发芽盒中，温度25℃~30℃，湿度70%~85%条件下培养，出芽周期大概30天。附录[1]TTC的配制和保存方法精密称取TTC1.00g，溶于100mL磷酸盐缓冲液中，制成浓度为1%的TTC溶液，调pH至6.5~7.5，置棕色瓶内4℃冰箱备用。磷酸缓冲液配置方法：溶液I：9.08g磷酸二氢钾溶于1L无菌水中；溶液II：35.81g磷酸二氢钠溶于1L无菌水中；I:II=2:3的比例混合制成磷酸盐缓冲液）[2]装载液（LS）的配制及保存方法精密称取蔗糖13.7g，称量甘油11.9mL，溶于液体MS培养基中，调pH至5.8后定容至100mL，高温高压灭菌，4℃冷藏。[3]玻璃化溶液（PVS2）的配制及保存方法精密量取甘油23.8mL、乙二醇13.6mL、二甲亚砜13.6mL，称取蔗糖13.7g，溶于MS溶液中，调pH至5.8后定容至100mL，高温高压灭菌，4℃冷藏。注意：配置时需戴手套，并在通风厨内操作。[4]洗涤液（DS）的配制及保存方法精密称取蔗糖41.1g溶于MS溶液中，调pH至5.8后定容至100mL，高温高压灭菌，4℃冷藏。参考文献[1]肖培根，刘昌孝，江纪武等.世界药用植物速查辞典[M].中国医药科技出版社.2015[2]中国科学院中国植物志委员会.中国植物志.[M].科学出版社，2004（1987），60（1）：047.[3]傅家瑞，宋松泉.顽拗性种子生物学[M].中国科学文化出版社，2004:1[4