翻译1-黑米中丰富的花色苷提取物对大鼠的慢性酒精性肝损伤的作用

黑米中丰富的花色苷提取物对大鼠的慢性酒精性肝损伤的作用侯召华，裴友秦，桂兴任作物科学*研究所中国北京海淀区100081，中国科学院农业研究所学院南路80号摘要：该研究评估了从黑米中萃取的丰富花青素(AEBR)对用慢性乙醇诱导的雄性Wistar大鼠体内产生的化学变化。对雄性大鼠用乙醇（3.7g/kg/day）诱导45天，观察其对肝脏的损害，伴随着大鼠血清内天门冬氨酸转氨酶（AST），丙氨酸转氨酶（ALT），γ谷氨酰转移酶（GGT）和肝脏丙二醛（MDA）水平的明显增加（P<0.05）。与此相反，在酒精中加入AEBR（500mg/kg），有效降低了血清中肝酶（AST，ALT和GGT）的活力，以及MDA水平及血清浓聚物和肝脏甘油三酯（甘油三酯）和总胆固醇（TCH）。用黑米色素处理大鼠显示了抗氧化系统在正常谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px），超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽-S-转移酶（GST）的活性下更好的一面。所有的这些结果都是、附有肝组织学观察的。结果表明，AEBR能有效减轻酒精的危害。关键词：黑米，大量花色素提取物，肝损伤，大鼠，乙醇引言花青素是一组植物色素，广泛分布于鲜花，水果和谷物中，并促成这些植物鲜艳的颜色成分（绿色，红色和蓝色）。作为一种类黄酮色素，花青素不仅能作为着色剂，而且最重要的是对健康的作用。因为它们无毒性和非诱变性，能抗氧化。因此，花青素已被广泛应用于食品行业和人类健康行业。最近几年，花青素的“健康普及”活动已经引起关注。作为人类饮食中的丰富成分（新鲜水果，果汁，酒，谷物），花青素应经被证明具有消炎作用和抗氧化活性。通过花青素在全身体液中循环能减轻氧化对身体的负担，从根本上降低氧化引起疾病恶化的危险。黑米（水稻粳稻），作为一个特殊的含丰富花青素水稻栽种品种，已被视为促进健康的食品，并在东亚地区广泛食用。以往的研究表明，在两种不同类型动物中，黑米色素的小部分成分能够显著的降低氧化负担，改善和调节血脂动脉粥样硬化的损伤。从黑米中提取的丰富花青素天然抗氧化剂能够帮助减轻酒精引起的肝脏病理变化。一些物质会使肝脏遭严重和潜在的致命伤害，包括鬼笔环肽，四氯化碳（CCl4），半乳糖胺，乙醇等其他化合物。长期食用酒精因为氧化强化剂和抗氧化系统失去平衡而在肝脏中产生氧化压力。肝脏对乙醇毒性的敏感性促使酒精性肝损伤，而保护药物的疗效本质上是依靠其减少有害影响或维持细胞和组织的正常生理的能力。近年来，测试了用各种抗氧化剂和不同的饮食来缓解因滥用酒精引起的氧化压力。本文研究的目的是探讨黑米提取的丰富花青素对大鼠中酒精性肝损伤的作用。材料与方法动物:试验中使用雄性Wistar大鼠（150g±20g）。动物是在动物房间内12h光照-黑夜循环（光7:00-19:00），温度保持22℃±2℃，湿度70％±4％，并自由获取食物和水的标准条件下存放。以下实验，符合欧洲社会对实验动物的使用准则和北京大学委员会对动物护理和使用。黑米中丰富花色素提取的准备工作（AEBR）。黑米是从中国吉林当地市场购买。AEBR的提取过程在实验前描述。简单的说，是把黑米通过压榨机磨碎，并到60目筛网上通过筛选。黑米粉末通过乙醇/水/盐酸（50:50:0.5，v/v/v）按固液比1:10温度50℃下2h提取两次。滤液合并真空干燥（RotavaporR210;B€uchi,Flawil,瑞典）去除乙醇。浓缩的提取液转移到AB-8树脂。AB-8树脂用蒸馏水洗净，并随后被吸收花青素用80％乙醇洗脱。乙醇洗脱液被喷雾于丰富的花色素粉末。图1。黑米花色苷提取物剖面分析采用高效液相色谱法。进行检测520纳米。峰1，花青素-3,5-葡萄糖苷，峰2，花青素-3-葡萄糖苷;峰3，花青素-3-芸香糖苷，峰4，peonidin-3-葡萄糖苷花色苷的鉴定与定量：ABER中的花色素用高效液相色谱法通过比较与标准品和已公布的保留时间和质谱的数据来鉴定。矢车菊-3-葡萄糖苷（色谱级）购自PolyphenolsLaboratories（桑内斯，挪威）。电喷雾质谱法和Esquire-LC质谱（MS）一起使用（布鲁克道尔顿，比尔里卡，MA），一个仪器设备的离子阱电喷雾接口。质谱记录在阳离子模式下m/z50到1500之间。质谱的主要参数如下：毛细管出口，4000V；毛细管补偿，500V；脱脂1，38.3V；雾化气体，氮气，40psi，干燥气体，氮气，12L/min;干燥温度，300℃。实验条件事先确定。四种花青素被确定如下，矢车菊-3-葡萄糖苷（91.01％），芍药素-3-葡萄糖苷（7.13％），矢车菊素-3，5-葡萄糖苷（0.92％），矢车菊素-3-芸香糖苷（0.94％）（图1）。在ShimadzuLC-20A高效液相色谱上进行分析。图1显示了黑米花色苷高效液相色谱法的轮廓图。黑米色素中的花色苷用ShimadzuLC-20A高效液相色谱法量化并表示矢车菊-3-葡萄糖苷。黑米色素中的总花色苷含量达到22.5%。除了花色苷，黑米色素中还含有水分（6.96％），粗蛋白（8.78％），粗脂肪（4.35％），总糖和其它成分（57.41％）。实验设计：实验动物随机分为5组，每组为8只大鼠。酒精和AEBR在水中溶解并被用来置于胃内的管状器官中45天，根据初步的实验和以前的资料。实验设计如下。第一组：用蒸馏水处理的对照大鼠（3.7g/kg体重）。第2组：正常大鼠口服乙醇（3.7g/kg体重）。第3组：正常大鼠口服乙醇（3.7g/kg体重）含AEBR（500mg/kg体重）。第4组：正常大鼠口服乙醇（3.7克/公斤体重）含AEBR（250mg/kg体重）。第5组：正常大鼠口服乙醇（3.7克/公斤体重）含AEBR（125mg/kg体重）。在实验期结束后，断头处死动物。立即切除肝脏，用冰冷生理盐水溶液（0.9％）处理，洗后干燥，称重。血液和亚细胞的分离制备.血是从颈部血管中提取并在室温下保持30分钟。3000g离心10分钟得到血清，在分析使用前分装并在-80℃存储。肝亚细胞组分（微粒体，​​细胞质，线粒体）中分离如前所述。肝脏样品的每一部分在0.1M的Tris-HCl，0.25M蔗糖，0.1mM乙二胺四乙酸（EDTA，pH7.4）均质，并在4℃，2000g离心15分钟，取细胞核后上清液。该细胞核后上清液离心10000g，4℃进一步离心30min；颗粒状物为线粒体。线粒体后上清液在4℃，100000g条件下继续离心1h获取微粒体（颗粒状）和细胞质（上清液）。线粒体和微粒体在0.1M的Tris-HCl（pH7.4）含10％甘油，0.1mMEDTA终止，并在液氮下速冻。为了准备10％的肝匀浆，肝脏组织织用冰冷的0.9％的氯化钠（1:10）处理均质。肝功能生化参数.血清中的天门冬氨酸转氨酶（AST），丙氨酸转氨酶（ALT），γ-谷氨酶（GGT），谷胱甘肽S-转移酶（GST）的活性通过一整套仪器测量[南京建成生物工程研究所（NJBI），中国]。肝脏匀浆和血清中的TC（总胆固醇），TG（甘油三酯）和MDA（丙二醛）的测量.总胆固醇（TC），甘油三酯（TG）和丙二醛（MDA）通过比色法测量。MDA由硫代巴比土酸-反应产物（TBRAS）在532nm水平光谱光度测量方法下分析。结果为nmol/ng蛋白。生化分析.微粒体中的超氧化歧化物（SOD）和线粒体中的组分，去线粒体后组分中谷胱甘肽S-转移酶，血清中的谷胱苷肽过氧化物以及微粒体中的组分由NJBI（中国）提供的一套仪器而定。组织病理学.除去肝脏左叶尾部，用10％中性缓冲甲醛溶液固定。固定后组织用石蜡包埋，切成5-6微米厚的切片放在显微镜载玻片上。切片用苏木精和伊红染色（H＆E），是镶嵌有中性联苯乙烯-邻苯二甲酸二丁酯-二甲苯（DPX）的媒介，用于显微观察。统计分析：所有数据都表示为平均值±标准偏差。数据进行统计分析的单向方差分析（ANOVA），采用SPSS社会科学统计程序（13.0版本软件，SPSS公司，芝加哥，美国）。以P＜0.05值认为有统计学意义。结果与讨论生长性能和肝脏指数.表1显示在控制和实验动物的最初和最终体重。乙醇处理组比对照组明显减少了体重（P<0.01）。肝脏指数在乙醇喂养组明显升高（P<0.01）与对照组相比，但是在AEBR（500mg/kgBW）组增加不显著。用乙醇处理的大鼠表现出明显较小体重（表1），与对照组相比，它类似于以前的报道（21）;其原因可能是由于食物摄入量的损失和吸收不良。AEBR对AST，ALT，GGT活性的影响.乙醇在肝脏中引起病变包括肝脏肿大和血清变化随着天冬氨酸转氨酶（AST），谷丙转氨酶（ALT）和γ谷氨酰转移酶（GGT）的活性增加。表2显示在对照组和实验组大鼠的血清AST，ALT和GGT的活性。乙醇处理组的AST,ALT,GGT的活性显著增加（P＜0.05）。AEBR处理组（500mg/kg），连同乙醇显著逆转了这些功能标记向正常的方向发展。AEBR在剂量为500mg/kg体重当与其它两个剂量（250和125mg/kg体重）相比则更为有效。这是众所周知的，乙醇摄入引起血浆肝细胞酶的渗漏损失是肝损伤的一个标志。酒精诱导的肝细胞氧化应激作用在酒精性肝损伤的形成中起主要作用。ALT和AST是肝功能可靠的保障。血清中的酶如AST和ALT增加的水平表明细胞通透性和破坏的增加和/或细胞坏死。膜上限酶GGT被释放到血液循环中，根据病理现象。在我们的研究，慢性酒精消耗造成了引起AST，ALT和GGT（表2）活性的显著增加，这可导致膜组织的严重破坏。Obi等研究，从rosainensis芙蓉花瓣中提取的花青素显著降低血清中天门冬氨酸和丙氨酸氨基转移酶的活性的水平。在这项研究中，对这些AEBR大鼠处理中酶活性的降低表明了保肝药的作用。AEBR对肝脏和血清中的总胆固醇和甘油三酯的影响：10％的肝匀浆和血清（清液）中的甘油三酯（TG）和总胆固醇的水平列于表3。饮酒导致血清中的TG和TCH的增加（P<0.05）。AEBR改善这些不利的影响。与乙醇组血清和肝组织中的TG水平相比，ABER组则显着降低。脂肪肝已被定义为肝脏细胞中含的脂肪滴超过5%或是总脂肪超过肝脏重量的5%。脂肪的积累是重度酒精吸入最普遍及最初的反应。酒精性脂肪肝通常以肝肿大，血清和肝脏中的甘油三酯水平增加，肝脏部分和大量脂肪滴结合在一起为特征。在目前的研究中，酒精处理组会引起肝脏指数相当大的增加，血清和肝脏中甘油三酯水平的提升，表明乙醇处理会引起典型的脂肪肝。与这些变化相对应的，在病理检查乙醇处理的大鼠肝脏中出现大量脂肪滴。AEBR对谷胱甘肽、丙二醛浓度和SOD（超氧化物歧化酶），GST（谷胱甘肽巯基转移酶）、GSH–Px（谷胱甘肽过氧化物酶）活性的影响。被控制和实验的大鼠中血清和肝脏的MDA和GSH水平见表4。乙醇处理引起了血清和肝脏中MDA浓聚物的剧烈增加（P<0.01）。AEBR预处理的大鼠降低了血清和肝脏中MDA的形成。表4表示在组织中非酶抗氧化剂（GSH）的水平。酒精处理的大鼠与对照相比其GSH的水平显著降低（P<0.05）。AEBR（500mg/kg）的处理显着（P<0.05）恢复了在组织非酶抗氧化剂的水平。酒精性肝损伤与氧化应激和自由基介导的组织损伤的联系在大鼠和人体中被广泛证实。自由基或活性氧簇（ROS）是由乙醇诱导的氧化应激造成的。自由基的形成是由于乙醇介导的过程中有很大的电位能快速的与脂类起化学，该反应就会引起脂质过氧化作用（LPO）。丙二醛（MDA）的水平被广泛用作LPO的生物标记已经有很多年了。蒋等人研究表明，黑米花色苷提取物（矢车菊素-3-葡萄糖苷和芍药素-3-葡萄糖苷）通过在体外和体内减少ROS并增加抗氧化酶的活性可能会减弱氧化应激的作用。津田等（1999年）发现，矢车菊-3-葡萄糖苷（C3G），在体内的强抗氧化剂，可降低血清中硫代巴比妥酸反应物质（TBARS）的浓度，提高血清对脂质过氧化作用的抗氧化性。在本研究中，发现AEBR能显著抑制MDA的水平因酒精而升高，表明AEBR的保护作用可能与抗氧化活性有关。在抗氧化系统中，非酶抗氧化剂如GSH在生化物系统中对保护细胞对抗脂质过氧化作用起着重要的作用。对酒精处理的大鼠组补增ABER恢复了其血清和肝脏中的非酶抗氧化剂的水平。我们观察到酒精处理的大鼠其抗氧化剂的水平（表4）接近正常。AEBR起到了氧自由基清除剂和氧化剂链断裂的作用，这使体内抗氧化剂的消耗降到最低并提高了酒精处理的大鼠体内循环的非酶抗氧化剂的水平。抗氧化物的活性包括超氧化物歧化酶（SOD），谷胱甘肽过氧化物酶（GPx），谷胱甘肽巯基转移酶（GST）见表5。酒精处理的大鼠被观察到酶活性的显著增加。对服用AEBR(500mg/kg)酒精处理的大鼠显著（P<0.01）降低了其活性。长期的酒精处理通过加剧肝脂质过氧化作用和抗氧化酶活性的下降引起肝脏的氧化应激作用。自由清除酶包括SOD,GST和GPx是对抗氧化损伤的第一道防线。抗氧化系统的抑制可能会导致ROS或其分解产物的积累。GSTs是多基因家族中促进GSH同亲电子复合物变种结合的同工酶，因此在保护细胞对抗ROS起到关键作用。乙醇或它的代谢产物可能会很明确的以GST同工酶为目标，酶活性或表达的减少可能会对酒精肝毒性有作用。与这些报告一致，我们的研究表明口服增补AEBR的酒精长期处理的大鼠其肝脏中GSH-Px，SOD和GST的活性有恢复（表5）。大鼠肝组织病理学的检查.乙醇可引起严重肝损害。酒精组大鼠肝脏样本显示的肝细胞损伤和变性的焦点（图2B）。据发现，AEBR的处理扭转了对肝脏的损伤。AEBR的一次500mg/kg体重剂量（图2C）与其它两个剂量（250和125mg/kg体重）相比要更有效果（图2D，E）。除AEBR以外的乙醇（500mg/kg体重）处理表明接近正常的表现（图2A）。肝脏接近正常表面上与AEBR（500mg/kg）处理的大鼠的肝脏细胞的轻微变化相同。组织学观察结果表明