基因工程中常用的工具酶课件

二、基因工程的基本程序载体质粒外源DNA片段外源DNA插入剪切引入宿主细胞选出含有重组DNA的细胞扩增表达abbAAb二、基因工程的基本程序载体质粒外源DNA片段外源DNA插入剪1第二章

基因工程中常用的工具酶

第一节

限制性核酸内切酶与DNA分子的体外切割第二节

DNA连接酶和DNA分子的体外连接第三节

其他工具酶第二章

基因工程中常用的工具酶

第一节

2第一节

限制性核酸内切酶与DNA分子的体切割限制性核酸内切酶，是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链结构的核酸内切酶。一、寄主控制的限制与修饰作用如图2-1，图2-2二、限制性核酸内切酶的制备方法三、限制性核酸内切酶分类和命名四、Ⅱ型限制性核酸内切酶的基本特性五、影响限制性内切酶活性的因素第一节

限制性核酸内切酶与DNA分子的体切割3分类：ⅠⅡⅢ

Ⅰ：识别和切割位点不固定，随机性。Ⅲ：核酸内切酶活性和甲基化活性是不分开的。Ⅱ：能在识别位点处切割DNA，切割位点固定。核酸内切酶活性和甲基化活性是分开的。常用。分类：ⅠⅡⅢ4四、Ⅱ型限制性核酸内切酶的基本特性识别序列：1.4~7个核苷酸组成的特定核苷酸序列2.回文结构：两个顺序相同的拷贝在DNA链上呈反向排列。EcoRⅠ5’-GAATTC-3’3’-CTTAAG-5’四、Ⅱ型限制性核酸内切酶的基本特性识别序列：1.4~7个核5经限制酶切割后的位点,DNA断裂类型1.粘性末端(1)3’-OH单链延伸的粘性末端.如：PstⅠ5’-CTGCAG-3’5’-CTGCAG-3’3’-GACGTC-5’3’-GACGTC-5’(2)5’-P单链延伸的粘性末端.如：EcoRⅠ5’-GAATTC-3’

5’-GAATTC-3’3’-CTTAAG-5’3’-CTTAAG-5’经限制酶切割后的位点,DNA断裂类型62.平末端如:SmaⅠ5’-CCCGGG-3’3’-GGGCCC-5’两种特殊的限制酶(1)同尾酶

识别位点不同，酶切后产生同样的粘性末段的两种酶。如：BamHⅠ和BglⅡ(2)同裂酶识别序列相同，对甲基化切点敏感性不同的两种酶。如:MboⅠ和Sau3AⅠ共同识别序列GATC，但对GmeATC切点,前者不能切，后者能切。2.平末端如:SmaⅠ7五、影响限制性内切酶活性的因素1.DNA的纯度2.DNA的甲基化（1）基因工程使用失去甲基化酶的大肠杆菌（2）研究基因工程DNA的甲基化程度（3）改变限制酶的识别特性3.温度4.分子结构5.限制酶的缓冲液星号活性EcoRⅠ切GAATTCEcoRⅠ*切pupuATpypy或AATT五、影响限制性内切酶活性的因素8第二节

DNA连接酶和DNA分子的体外连接一、DNA连接酶

DNA连接酶（Ligase）是一种能够催化在双股DNA链的3′-OH和5′-P之间形成磷酸二酯键的酶，可连接互补粘性末端或平端以及缺口修复，不能连接单链DNA或裂口.温度二、DNA分子的体外连接第二节

DNA连接酶和DNA分子的体外连接一、9二、DNA分子的体外连接1．粘性末端DNA片段的连接和单切点的磷酸化2．平末端DNA片段的连接（1）T4DNA连接酶法（2）同聚物加尾法（3）用化学合成的衔接物连接DNA分子二、DNA分子的体外连接1．粘性末端DNA片段的连接和单切点10第三节

其他工具酶一、大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ二、DNA聚合酶Ⅰ大片段（Klenow酶）三、T4DNA聚合酶四、逆转录酶五、末端脱氧核苷酰转移酶六、核酸酶S1七、核酸酶BAL31八、外切核酸酶Ⅲ九、T4多聚核苷酸激酶十、碱性磷酸酶十一、

甲基化酶第三节

其他工具酶一、大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ11命名

HindⅢH:Haemophilus嗜血杆菌属in:influenzae流感d:Rd株Ⅲ：该菌株中第三个被分离到的限制酶命名HindⅢ12同尾酶BamHI和BglII

AGATCT

GGATCC

TCTAGA

CCTAGGBglⅡBamHI

AGATCC

TCTAG G

T4连接酶AGATCC

（连接后的切点均不能被上述两种酶切）TCTAGG同尾酶BamHI和BglII13一、大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ1.三种活性（1）5’-3’聚合酶活性（在有dNTP时）（2）3’外切酶活性（无dNTP时大亚基活性）（3）5’外切核酸酶活性（无dNTP时小亚基活性）2.在基因工程中的应用：缺口平移标记技术。一、大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ1.三种活性14二、DNA聚合酶Ⅰ大片段（Klenow酶）1.DNA聚合酶活性（切除小亚基，保留大亚基）2.3’外切酶活性（无dNTP时）3.在基因工程中的应用（1）标记粘性末端.-32P—dNTP

标记平末端-32P—dNTP（2）将5’端伸出的末端填平（3）可用来反转录合成双链cDNA。（4）补平粘性末端。

二、DNA聚合酶Ⅰ大片段（Klenow酶）15三、T4DNA聚合酶具有5’-3’聚合酶活性和3’-5’外切酶活性。其外切酶活性比E.coliDNA聚合酶I的活性高200倍。

取代反应三、T4DNA聚合酶具有5’-3’聚合酶活性和3’-5’外切16四、逆转录酶逆转录酶可以RNA为模板，逆转录成cDNA第一链，又称依赖RNA的DNA聚合酶。1.聚合酶活性RNA或DNA为模板2.3’外切酶活性能使DNA-RNA杂合链中的RNA降解。应用：1.RT-PCR使mRNA逆转录成cDNA2.制备探针。四、逆转录酶逆转录酶可以RNA为模板，逆转17五、末端脱氧核苷酰转移酶可催化DNA片段上的3’-OH端加接脱氧核糖核苷酸。常用于同种碱基多聚体接尾反应核素标记DNA片段的3’端五、末端脱氧核苷酰转移酶可催化DNA片段上的3’-OH端加接18六、核酸酶S1可以降解单链DNA和RNA(1)将DNA切成平末端。有些限制性内切核酸酶可以将DNA切成粘性末端，经过核酸酶S1降解可切除DNA末端的单链。生成平末端DNA。(2)切除cDNA中单链发夹状结构。反转录反应合成的cDNA，可能形成单链发夹状结构，为了得到平末端cDNA可用核酸酶S1分解，生成无发夹结构的cDNA。(3)可用核酸酶S1分析DNA·RNA杂交分子的结构。六、核酸酶S1可以降解单链DNA和RNA19十、碱性磷酸酶该酶的功能是以单链或双链的DNA、RNA为基质，将DNA或RNA片段5’端的磷酸切除，产生5’-OH。应用：(1)用该酶催化切除DNA或RNA5’端的磷酸,然后加上γ-32P-NTP在DNA多聚核苷酸激酶的作用下标记5’端。(2)用于避免单酶切后质粒自我环化。十、碱性磷酸酶该酶的功能是以单链或双链的DNA、RNA为基质20十一、

甲基化酶常见的有dam甲基化酶和dcm甲基化酶，可使相应碱基甲基化。dam可在限制酶识别的5′GATC3′或5′GAAT3′序列的5′腺嘌呤N6位上引入甲基。dcm可在限制识别的5′CCAGG3′或5′CCTGG3′序列的5′胞嘧啶引入甲基。常用于使酶切位点中的碱基甲基化而避免降解，保护酶切位点。十一、

甲基化酶常见的有dam甲基化酶和dcm甲基化酶21核酸酶BAL31

从线形DNA分子两端（粘端/平端）以渐进方式切去单核苷酸，以形成寡聚核苷酸或制造末端缺失。此外也有类似于SI酶单链特异降解活性，可除去粘性末端或单链发夹结构。外切核酸酶Ⅲ能从线性DNA的3′-OH末端沿3′→5′方向切去单核苷酸，制造3′端缺失，制备DNA模板或特异DNA探针。T4多聚核苷酸激酶能将ATP上的γ位磷酸转移到单链或双链DNA或RNA的5′-OH上，可将γ-32P-ATP中的32P连接到5′端的5′-OH上，以完成寡聚核苷酸的核素标记。核酸酶BAL3122基因工程中常用的工具酶课件23基因工程中常用的工具酶课件24基因工程中常用的工具酶课件25基因工程中常用的工具酶课件26基因工程中常用的工具酶课件27基因工程中常用的工具酶课件28基因工程中常用的工具酶课件29基因工程中常用的工具酶课件30基因工程中常用的工具酶课件31基因工程中常用的工具酶课件32基因工程中常用的工具酶课件33基因工程中常用的工具酶课件34基因工程中常用的工具酶课件35基因工程中常用的工具酶课件36基因工程中常用的工具酶课件37基因工程中常用的工具酶课件38基因工程中常用的工具酶课件39基因工程中常用的工具酶课件40基因工程中常用的工具酶课件41八、外切核酸酶Ⅲ

它的功能是将带有3’-OH末端的双链DNA从3’到5’端方向切除，产生5’单核苷酸八、外切核酸酶Ⅲ

它的功能是将带有3’-OH末端的双链DN42二、基因工程的基本程序载体质粒外源DNA片段外源DNA插入剪切引入宿主细胞选出含有重组DNA的细胞扩增表达abbAAb二、基因工程的基本程序载体质粒外源DNA片段外源DNA插入剪43第二章

基因工程中常用的工具酶

第一节

限制性核酸内切酶与DNA分子的体外切割第二节

DNA连接酶和DNA分子的体外连接第三节

其他工具酶第二章

基因工程中常用的工具酶

第一节

44第一节

限制性核酸内切酶与DNA分子的体切割限制性核酸内切酶，是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链结构的核酸内切酶。一、寄主控制的限制与修饰作用如图2-1，图2-2二、限制性核酸内切酶的制备方法三、限制性核酸内切酶分类和命名四、Ⅱ型限制性核酸内切酶的基本特性五、影响限制性内切酶活性的因素第一节

限制性核酸内切酶与DNA分子的体切割45分类：ⅠⅡⅢ

Ⅰ：识别和切割位点不固定，随机性。Ⅲ：核酸内切酶活性和甲基化活性是不分开的。Ⅱ：能在识别位点处切割DNA，切割位点固定。核酸内切酶活性和甲基化活性是分开的。常用。分类：ⅠⅡⅢ46四、Ⅱ型限制性核酸内切酶的基本特性识别序列：1.4~7个核苷酸组成的特定核苷酸序列2.回文结构：两个顺序相同的拷贝在DNA链上呈反向排列。EcoRⅠ5’-GAATTC-3’3’-CTTAAG-5’四、Ⅱ型限制性核酸内切酶的基本特性识别序列：1.4~7个核47经限制酶切割后的位点,DNA断裂类型1.粘性末端(1)3’-OH单链延伸的粘性末端.如：PstⅠ5’-CTGCAG-3’5’-CTGCAG-3’3’-GACGTC-5’3’-GACGTC-5’(2)5’-P单链延伸的粘性末端.如：EcoRⅠ5’-GAATTC-3’

5’-GAATTC-3’3’-CTTAAG-5’3’-CTTAAG-5’经限制酶切割后的位点,DNA断裂类型482.平末端如:SmaⅠ5’-CCCGGG-3’3’-GGGCCC-5’两种特殊的限制酶(1)同尾酶

识别位点不同，酶切后产生同样的粘性末段的两种酶。如：BamHⅠ和BglⅡ(2)同裂酶识别序列相同，对甲基化切点敏感性不同的两种酶。如:MboⅠ和Sau3AⅠ共同识别序列GATC，但对GmeATC切点,前者不能切，后者能切。2.平末端如:SmaⅠ49五、影响限制性内切酶活性的因素1.DNA的纯度2.DNA的甲基化（1）基因工程使用失去甲基化酶的大肠杆菌（2）研究基因工程DNA的甲基化程度（3）改变限制酶的识别特性3.温度4.分子结构5.限制酶的缓冲液星号活性EcoRⅠ切GAATTCEcoRⅠ*切pupuATpypy或AATT五、影响限制性内切酶活性的因素50第二节

DNA连接酶和DNA分子的体外连接一、DNA连接酶

DNA连接酶（Ligase）是一种能够催化在双股DNA链的3′-OH和5′-P之间形成磷酸二酯键的酶，可连接互补粘性末端或平端以及缺口修复，不能连接单链DNA或裂口.温度二、DNA分子的体外连接第二节

DNA连接酶和DNA分子的体外连接一、51二、DNA分子的体外连接1．粘性末端DNA片段的连接和单切点的磷酸化2．平末端DNA片段的连接（1）T4DNA连接酶法（2）同聚物加尾法（3）用化学合成的衔接物连接DNA分子二、DNA分子的体外连接1．粘性末端DNA片段的连接和单切点52第三节

其他工具酶一、大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ二、DNA聚合酶Ⅰ大片段（Klenow酶）三、T4DNA聚合酶四、逆转录酶五、末端脱氧核苷酰转移酶六、核酸酶S1七、核酸酶BAL31八、外切核酸酶Ⅲ九、T4多聚核苷酸激酶十、碱性磷酸酶十一、

甲基化酶第三节

其他工具酶一、大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ53命名

HindⅢH:Haemophilus嗜血杆菌属in:influenzae流感d:Rd株Ⅲ：该菌株中第三个被分离到的限制酶命名HindⅢ54同尾酶BamHI和BglII

AGATCT

GGATCC

TCTAGA

CCTAGGBglⅡBamHI

AGATCC

TCTAG G

T4连接酶AGATCC

（连接后的切点均不能被上述两种酶切）TCTAGG同尾酶BamHI和BglII55一、大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ1.三种活性（1）5’-3’聚合酶活性（在有dNTP时）（2）3’外切酶活性（无dNTP时大亚基活性）（3）5’外切核酸酶活性（无dNTP时小亚基活性）2.在基因工程中的应用：缺口平移标记技术。一、大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ1.三种活性56二、DNA聚合酶Ⅰ大片段（Klenow酶）1.DNA聚合酶活性（切除小亚基，保留大亚基）2.3’外切酶活性（无dNTP时）3.在基因工程中的应用（1）标记粘性末端.-32P—dNTP

标记平末端-32P—dNTP（2）将5’端伸出的末端填平（3）可用来反转录合成双链cDNA。（4）补平粘性末端。

二、DNA聚合酶Ⅰ大片段（Klenow酶）57三、T4DNA聚合酶具有5’-3’聚合酶活性和3’-5’外切酶活性。其外切酶活性比E.coliDNA聚合酶I的活性高200倍。

取代反应三、T4DNA聚合酶具有5’-3’聚合酶活性和3’-5’外切58四、逆转录酶逆转录酶可以RNA为模板，逆转录成cDNA第一链，又称依赖RNA的DNA聚合酶。1.聚合酶活性RNA或DNA为模板2.3’外切酶活性能使DNA-RNA杂合链中的RNA降解。应用：1.RT-PCR使mRNA逆转录成cDNA2.制备探针。四、逆转录酶逆转录酶可以RNA为模板，逆转59五、末端脱氧核苷酰转移酶可催化DNA片段上的3’-OH端加接脱氧核糖核苷酸。常用于同种碱基多聚体接尾反应核素标记DNA片段的3’端五、末端脱氧核苷酰转移酶可催化DNA片段上的3’-OH端加接60六、核酸酶S1可以降解单链DNA和RNA(1)将DNA切成平末端。有些限制性内切核酸酶可以将DNA切成粘性末端，经过核酸酶S1降解可切除DNA末端的单链。生成平末端DNA。(2)切除cDNA中单链发夹状结构。反转录反应合成的cDNA，可能形成单链发夹状结构，为了得到平末端cDNA可用核酸酶S1分解，生成无发夹结构的cDNA。(3)可用核酸酶S1分析DNA·RNA杂交分子的结构。六、核酸酶S1可以降解单链DNA和RNA61十、碱性磷酸酶该酶的功能是以单链或双链的DNA、RNA为基质，将DNA或RNA片段5’端的磷酸切除，产生5’-OH。应用：(1)用该酶催化切除DNA或RNA5’端的磷酸,然后加上γ-32P-NTP在DNA多聚核苷酸激酶的作用下标记5’端