《细胞破碎技术》教学课件

细胞破碎技术孙万儒中国科学院微生物研究所细胞破碎技术孙万儒1前言细胞破碎是了解细胞组成和构造,获得细胞内含物的必要手段。胞内的生物活性物质的稳定性差,条件不适极易失活。特别是微生物细胞十分微小,细胞壁构造比较严密,一般方法不易将细胞打破,有些技术虽然可以,但条件严苛,胞内生物活性物质在此条件下很易失活,限制了一些技术的应用。在一定程度上细胞破碎仍是生物技术产业化关键技术。前言细胞破碎是了解细胞组成和构造,获得细胞内含物的必要2破碎细胞的方法和技术

细胞破碎方法┌───────┴───────┐物理法化学法

渗透超声高压球磨研磨碱处酶法有机外表休克波法释放法法理法溶剂活性法法法剂法破碎细胞的方法和技术3细胞壁的组成和构造微生物细胞外膜使细胞具有刚性的外形,由胞质膜和细胞壁组成,其构造影响着细胞破碎。胞质膜保持着细胞内外的物质浓度梯度,主要由蛋白质和脂类组成。没有细胞壁时,膜对渗透休克敏感,对其它破碎方法影响较小。细胞壁是破碎的主要障碍,其组成和构造对细胞破碎有重要影响。细胞壁的组成和构造与遗传和环境因素有关,但在微生物的种属中也存在总构造上的相似性。细胞壁的组成和构造微生物细胞外膜使细胞具有刚性的4

细菌细胞壁的组成

1964年Salton首次利用机械破碎法破碎细菌细胞，对细菌细胞壁组成、构造和功能进展研究。对格兰氏阳性菌和格兰氏阴性菌的细胞壁构造有了较为全面认识。除了菌质和一些L-型和嗜盐菌以外，几乎所有的细菌的壁的较坚硬局部都是由短肽交联的糖原链，即粘肽构成，围绕着细胞形成连续的网状构造，使细胞具有一定的形状和强度。细菌细胞壁的组成1964年Salt5细菌细胞壁的组成

细菌粘肽构造示意图N-乙酰基胞壁酸(M)和N-乙酰基葡萄糖胺(G)交替形成糖原束,由M引出的纵点代表四肽单元的氨基酸残基，横点代表肽交联桥细菌细胞壁的组成6细菌细胞壁的组成不同物种的N-乙酰基胞壁酸在其侧链基团上的取代有变化。但对糖原链的三维构造没有明显影响。N-乙酰基胞壁酸残基的乳酸基与肽链结合，将糖原链联结起来形成网状构造。至少N-乙酰基胞壁酸残基的乳酰基局部可为四肽单元取代，相邻的糖原链由肽桥交联。大肠杆菌大约有50%的四肽单元未交联，其它的仅作为二聚体交联。在嗜酸乳酸菌中，大约有90%的四肽单元交联，约30%的四肽单元作为三聚体交联。细菌细胞壁的组成不同物种的N-乙酰基胞7细菌细胞壁的组成虽然几乎所有的细菌都含有根本的粘肽网构造，但格兰氏阳性和阴性细菌的壁构造有明显不同。格兰氏阳性菌的壁相当厚，约15-50nm，含有40-90%的由根底多糖和磷壁酸质组成的粘肽，一些种属的细胞外表有规律地排列着蛋白质亚基。格兰氏阴性菌细胞壁由薄的粘肽层(1.5-2.0nm)和在电子显微照片上看如同胞质膜一样的外膜组成，粘肽层上还共价结合有脂蛋白，一些种属在外膜上另外还有一层规律排列的蛋白质亚基。细菌细胞壁的组成虽然几乎所有的细菌都含有根本的粘8酵母细胞壁酵母细胞壁构造更难加以说明。总的构造要比格兰氏阳性菌的厚些。面包酵母细胞壁大约为70nm，且随培养时间的增加细胞壁加厚。酵母细胞壁含有大量葡聚糖，甘露聚糖和蛋白质，但不清楚以怎样的方式结合形成根本构造。在葡聚糖链上有β(1,3)和β(1,6)键联结的分支链构造。酵母细胞壁的甘露聚糖主要是由α(1,2)糖苷键和少量的α(1,3)糖苷键联结的甘露糖组成，另外，也有通过α(1,6)糖苷键联结的甘露寡糖侧链，在甘露糖残基上有时也有磷酸二酯键。在酵母细胞壁上发现的蛋白质主要是与甘露糖复合，多数是酶，而不是构造组分。酵母细胞壁酵母细胞壁构造更难加以说明。总的构造要9酵母细胞壁格兰氏阳性(a)和阴性(b)细菌的细胞壁的横断面图CM代表胞质膜;CW为细胞壁构造;SU为有规律排列的亚基;PG为粘肽层;OM为格兰氏阴性菌的外膜；类型不同，亚基可能存在也可能不存在。酵母细胞壁格兰氏阳性(a)和阴性(b)细菌的细胞壁的10酵母细胞壁酵母细胞壁构造示意图

外层甘露聚糖(M)通过磷酸二酯键与蛋白(P)结合，内部蛋白含有交联的糖原(G)酵母细胞壁酵母细胞壁构造示意图11真菌细胞壁

大多数真菌的细胞壁是由多糖和少量的蛋白质及脂类组成，但组成变化很大，只有个别的真菌细胞壁作了较详细研究。正如细菌和酵母一样，多糖是构成细胞形状和耐受破碎的主要构造物。真菌细胞壁组成和构造的多样性，不能将一个种属的结果推广到另一个种属上。从影响细胞破碎的角度看，有其共同点，就是菌丝体生长过程中细胞壁的变化对细胞破碎的影响。

真菌细胞壁大多数真菌的细胞壁是由多糖和少量的蛋12细胞壁组分与真菌分类

关键多糖分类组纤维素，糖原集胞(粘)菌纲(Acrasiomycetes)

纤维素，β-葡聚糖卵菌目(Oomycetes),水霉目(Saprolegnicales)

霜霉目(Peronosporales),水节霉目(Leptomitales)

纤维素，壳多糖，卵菌目(Oomycetes),水节霉目(Leptomitales)β-葡聚糖纤维素，壳多糖丝壶菌目(Hyphochytridiomycetes)

去乙酰基壳多糖，接合菌目(Zygomycetes)

壳多糖壳多糖，β-葡聚糖壶菌目(Chytridiomycetes),

子囊菌目[(Ascomycetes),除了半子囊菌亚纲

(Hemiascomycetidae)],担子菌纲[Basidiomycetes)除了掷孢酵母科(Sporobolomycetaceae)]

甘露糖,β-葡聚糖半子囊菌纲(Hemiascomycetidae)

甘露糖,壳多糖红酵母科(Rhodotorulaceae)细胞壁组分与真菌分类关键多糖13真菌细胞壁粗糙脉孢菌的细胞壁构造示意图

层次组成：(a)最外层由α-和β-葡聚糖混合组成,(b)葡聚糖组合在蛋白类材料中的糖蛋白网络,(c)主要是蛋白质类物质,(d)内部的壳多糖类物质区，嵌镶在蛋白类物质中的微原纤维壳多糖。真菌细胞壁粗糙脉孢菌的细胞壁构造示意图14真菌细胞壁裂褶菌(Schizophyllumcommune)细胞壁的组分虽然与之不同，但具有一样的层次构造。三种聚合物(R)-葡聚糖，(S)-葡聚糖和壳多糖大约占细胞壁干重的70%，(R)-葡聚糖是一个高分枝聚合物，分支点为β(1,3)和β(1,6)，且与壁的惰性层中的微原纤维壳多糖复合。真菌细胞壁的强度与聚合物的网状构造有关，至少含有的纤维状的壳多糖和纤维素对细胞强度有增强作用。真菌细胞壁裂褶菌(Schizophy15细胞壁构造与破碎微生物细胞壁的形状和强度与壁内构造聚合物的构造和它们彼此之间交联及与其它组分的交联程度有关。为到达破碎细胞目的，必须打破这种共价结合的网状构造。这种构造不仅与其遗传特性有关，也与其生长环境和生长阶段有关，而真菌的细胞壁构造还和发酵时的机械作用有关，因此表现为极其丰富的多样性。利用机械破碎细胞时，细胞的形状和大小，细胞壁构造聚合物的交联程度均是决定破碎难易的重要因素。要预知各种微生物细胞对机械破碎的耐受能力也有困难。细胞壁构造与破碎微生物细胞壁的形状和16细胞壁构造与破碎利用化学法和酶法破碎细胞时，了解细胞壁的组成和构造对选择具体方法显得十分重要。由于在网状构造之上覆盖有保护层，掌握它们的构造组成和非构造组成是选择酶和化学方法的依据。然而，有关这些方面的知识还十分有限，还需使用其它方法对这种精细构造进展更有效的研究。细胞壁构造与破碎利用化学法和酶法破碎细胞时，了解17破碎分析

破碎细胞的目的主要有二，一是获得细胞的内含物，二是获得细胞膜物质。不管是那一种目的，获得最大的破碎率是所有破碎技术追求的目标。为了检测破碎过程和破碎结果，需要快速、简捷的细胞破碎程度的分析技术。细胞破碎率可直接利用完整细胞计数法或质量检测法，也可利用细胞释放出来的特定组分间接测定。直接测定法是标准化法，间接测定法可能更有用，更有价值。可根据具体情况采用不同的测定方法。破碎分析破碎细胞的目的主要有二，一是181.直接测定法使用显微镜或用电子粒子计数器直接进展完整细胞计数,适合细胞破碎过程。然而，破碎释放的物质，如DNA和其它聚合物组分会干扰计数。为进展显微镜计数，可进展染色，以便区分破碎和未破碎细胞。例如破碎的格兰氏阳性细菌会象阴性菌一样染色；如格兰氏染色法时，未破碎酵母细胞显紫色，而破碎细胞显亮红色。对于量大的样品，显微镜计数法耗时，枯燥；电子粒子计数器虽可测定酵母细胞破碎率，但大的细胞破碎物可能有干扰；用于细菌破碎率的测定时,灵敏度较低。1.直接测定法使用显微镜或用电子粒子计数器直接进展完整细胞192.间接测定法

依据破碎过程中破碎的细胞释放的胞内物质量测算，如测定可溶性蛋白量或酶活性等，但需与破碎率到达100%的标准进展比较。在使用酶活性测定法时需注意，由于粗酶提取物的酶动力学与完整细胞或纯化的酶可能有差异而产生误差。当使用较浓的细胞悬浮液时，为获得准确结果，必须进展校正。这是由于破碎细胞释放胞内物质与水混合时会使体积增加。另外，稀释法并不适合在破碎过程中易失活的物质测定。因此需使用新的方法。2.间接测定法依据破碎过程中破碎的细胞释放的胞内物质量测20(1)稀释法如果细胞破碎过程中失活不成为问题，可通过测定破碎样品(Cu)和稀释样品(Cd)的上清液中的可溶性蛋白来测定破碎率。使用公式可获得破碎样品的水相体积百分数(Fd),Fd=(Vd/Vs)[Cd/(Cu-Cd)]Vd为加到体积为Vs的破碎样品中的稀释剂体积。使用Folin-Lowry法或双缩脲法测定蛋白质，通过下式可得破碎悬浮物中单位质量的细胞所含的蛋白质(Rp)，Rp=Fd(Cu/X)(2)X是以干物重为根底的细胞浓度。为计算细胞破碎率，必须测定相当于破碎率为100%的Rp值。(1)稀释法如果细胞破碎过程中失活不成为21(1)稀释法

一般来说，水相体积百分数Fd与样品的稀释量无关。这也说明蛋白质的溶解度不受样品的稀释的影响。但实际上，在多数条件下，稀释会影响蛋白质的溶解度，因此在采用稀释法之前，要检查稀释对蛋白质溶解度的影响。

(1)稀释法一般来说，水相体积百分数F22(2)质量平衡法

破碎样品的水相体积分数(F)与样品破碎前的水相体积分(Fo)及完整细胞内的含水量(质量分数M)的关系为：

F=Fo+(1-Fo)MR(Qc/Qaq)R为细胞破碎率，Qc为细胞密度，而Qaq为水悬浮介质的密度。在上式中假设细胞内水释放会使水相体积分数增加。利用凯氏定氮法测定破碎样品水相(Cn)和未破碎细胞(Cno)的氮含量表示蛋白含量，它们与F和R的关系为：

R=FCn/CnoX(2)质量平衡法破碎样品的水相体积分23(2)质量平衡法

将两式合拚，删去F项，得

R=FoCn/[CnoX-(1-Fo)CnM(Qc/Qaq)]

当细胞浓度(X)高时，用直接测定法测定细胞浓有困难，也可从样品的物理性质和固体质量分数计算得到。

X=QcQaqW(1-M)/[W(Qaq-Qc)+Qc(1-M)]

使用质量平衡法计算细胞破碎率时使用了几个假设，因此该方法的准确度有时比稀释法差。但是，当稀释影响蛋白的溶解度，不能使用稀释法时，可以使用质量平衡法测定细胞破碎率。

(2)质量平衡法将两式合拚，删去F项，得24(3)电导测定法

电导测定法是依据细胞物质释放到水中会改变溶液电导的原理开展的一种快速测定方法。细胞悬浮液电导的增加与细胞破碎率成正比。这种方法需要有其它方法作比照。因为电导与生物类型，保存条件，细胞浓度，温度，悬浮介质中的电解质类型和含量等有关。因此，在利用电导测定法测定细胞破碎率时，为了保证测定的准确，除破碎率以外,必须在保持的其它所有条件恒定的情况下进展。(3)电导测定法电导测定法是依据细胞物质释放到25渗透休克法渗透休克法26原理依靠细胞内外渗透压差突然加大造成细胞壁破裂,使胞内物质释放到溶液中。将收集到的细胞用适当的缓冲液或生理盐水洗涤，除去细胞沾染的培养基或其它杂质，将其悬浮在含10-30%蔗糖的适当缓冲液中，为了防止目的酶或蛋白质失活，假设目的酶或蛋白质需要金属离子时，在缓冲液中参加金属离子；假设金属离子会使目的酶或蛋白质失活，在缓冲液中需参加金属离子螯合剂，如EDTA等。在低温下，使细胞悬浮液混合均匀，放置使细胞内外渗透压到达平衡。在低温下离心，收集细胞；在剧烈的搅拌下将细胞快速加到较大体积的低浓度的缓冲液中，由于细胞外渗透压突然降低，使细胞破碎。原理依靠细胞内外渗透压差突然加大造成细胞壁27应用

用此法处理大肠杆菌，可使磷酸酯酶、核糖核酸酶I以及脱氧核糖核酸酶等释放到溶液中。释放的蛋白质的量一般仅占细胞蛋白质的4-7%。因此，后序的蛋白质别离纯化比较简单。此法对细胞壁外有着结实的糖蛋白包裹层，使胞内渗透压不受严重影响的格兰氏阳性菌不适用。在高渗透压环境下生长的细菌,如海洋细菌，嗜盐细菌，更适合该法。如可有效的将海洋发光细菌的细菌荧光素酶释放，酶释放率可到达80-90%。应用用此法处理大肠杆菌，可使磷酸酯酶、核糖核酸酶I以及脱氧28超声破碎法超声破碎法29设备和原理

超声破碎器由高频电发生器和产生高强度超声信号的电功率转换器构成，并把超声波传送到与其接触的溶液中。一般在频率15-25KHz下进展操作，由声波的冲击和振荡，在溶液中产生空化作用，空化泡的急剧膨胀压缩和内向爆破产生冲击弹性波，将声能转化为机械能，形成粘性消散涡流，如果液体旋涡小于细胞尺寸，产生不同密度移动，当细胞的动能超过细胞壁强度时，至使细胞破碎。因此，细胞破碎率与输入功率大小，细胞大小，细胞壁强度，细胞形状和破碎时间有关。一般来说，超声破碎对球状或近球状细胞较有效，对丝状菌破碎效果较差。在输入功率为60-195W的条件下，细胞破碎时的蛋白释放与细胞浓度无关，最大细胞浓度可达60mg/ml。设备和原理超声破碎器由高频电发生器和30设备和原理

在破碎输入功率恒定条件下，对面包酵母破碎实验过程的理论分析得出以下关系式:1-Rp=exp-(kt)

这里Rp为蛋白释放率，k为蛋白释放常数，t为破碎时间(min)。在面包酵母浓度为20mg/ml，超声波频率为20KHz，输入功率190瓦的条件下，蛋白释放常数k与输入功率有如下关系:

k=b(p-po)/0.9

其中b为常数，p是输入功率(J/kg.s)，po是空化作用的最低界限输入功率。设备和原理在破碎输入功率恒定条件下，对面包酵母破碎实31应用与局限

最大问题是在超声过程中声波被溶液吸收产生大量热量，不能及时将热量移出，细胞悬浮液的温度急剧升高，导致酶和其它生物活性物质变性失活。因此，在实验室中往往采取连续破碎的方法，即经短时间破碎，冷却降温，再进展破碎，经屡次反复到达破碎目的。因此在细胞破碎过程中，有效冷却是关键。也因大容量容器的声波传递和散热困难，限制了超声破碎的大规模应用。应用与局限最大问题是在超声过程中声波32应用与局限超声破碎在实验室应用比较普遍，处理量小时比较方便。超声波作用产生游离基，超声波会造成蛋白质构造变化均会使之失活。超声破碎法细胞较为彻底，细胞内含物全部释放，破碎细胞悬浮液粘稠，利用简单的过滤法难于回收含有目的产物的上清液，只有通过长时间离心回收上清液，使后序工艺复杂。超声噪音污染环境，影响人们安康，应对操作人员加以保护。应用与局限超声破碎在实验室应用比较普遍33应用与局限在超声破碎细胞时，正确的方法是探头的下外表处于菌悬液外表下0.3-1.0cm处最好，深浅以不会使菌悬液产生大量泡沫为准。超声破碎细胞的破碎率一般可到达80-90%，如要进一步提高破碎率，需增加更多的破碎时间。因后期破碎率提高并不明显，且增加时间和能耗，更重要的是目的产物会因失活而使产物收率反而下降。从回收目的产物的角度看是不经济的。因此有必要通过破碎时间与破碎率和生物活性产物收率关系曲线确定最正确破碎时间。应用与局限在超声破碎细胞时，正确的方34大规模应用的对策

大规模连续破碎细胞的超声破碎系统示意图

A超声波转换器，B细胞破碎腔，C细胞悬浮液储存器，D冷冻系统，E高频电发生器

关键是破碎腔的设计。腔的大小及深度要能够被超声波覆盖，且料液无流动死角。操作要求严格控制细胞悬浮液和冷冻液的流速，以保证破碎流出物料的温度不超过控制水平。采用批式屡次单循环或连续混合循环方式均可到达破碎细胞的目的。大规模应用的对策大规模连续破碎细胞的超声破碎系统示意图35高压释放匀浆法

高压释放匀浆法36设备与机理高压释放匀浆法是一种有效的大规模破碎细胞技术。有各种类型的工业产品可供选择，主要由高压泵和释放阀两局部组成。高压泵一般是一级或二级的正向柱塞泵，细胞悬浮液在40-350Mpa的高压下通过阀座中心孔高速喷出，因针状调节阀的阻挡而改变方向，喷射在碰撞环上，细胞在高速喷射，湍流碰撞和急剧降压中，由于各种剪切力的作用致使细胞破碎。高压释放阀示意图A.控制卸压的手柄,B.控制杆,C.针阀,D.阀座,E.碰撞环设备与机理高压释放匀浆法是一种有效的37设备与机理释放阀的构造，特别是阀座的形状对细胞破碎率有明显影响。在一样的操作压力下破碎啤酒母细胞时，刃式构造要比平式构造的破碎率高20-25%。.两种阀座构造的示意图a.平式构造,b.刃式构造设备与机理释放阀的构造，特别是阀座的38设备与机理高压释放破碎细胞机理的研究说明，致使细胞破碎的原因比较复杂。对产元假丝酵母和啤酒酵母细胞破碎机理的研究发现由于高速流动造成的碰撞是细胞破碎的主要原因，而一般的应力切变造成的细胞破碎约只占总破碎力的20%，其它的作用力较难估计。碰撞和一般应力对细胞破碎的影响○碰撞,△一般应力设备与机理高压释放破碎细胞机理的研究39影响破碎的因素所有微生物细胞只有施加的压力到达某一水平时才开场破碎，继之细胞破碎率随着压力的增加而迅速增加。破碎为一级动力学过程：ln[1/(1-R)]=kNPaN为通过匀浆器阀门的次数，P为操作压力，k为与温度有关的速度常数，a为功率值，它与细胞破碎时需要抑制的压力范围有关。利用高压匀浆器破碎面包酵母的破碎曲线

□温度为30℃,○温度为5℃影响破碎的因素所有微生物细胞只有施加40影响破碎的因素破碎过程中，在很宽的范围内破碎与细胞浓度(29-224g/L的干细胞)无关。面包酵母破碎时，不同酶的释放速度不同，集积在细胞壁和胞间质的酶的释放要比可溶性蛋白质快些，而在线粒体上的酶的释放与可溶性蛋白质具有一样的速度，在亚细胞颗粒上的酶的释放速度要慢些。蛋白与酶释放的相互关系

A.酸性磷酸酯酶,B.蔗糖酶,C.葡萄糖-5-磷酸,D.醇脱氢酶,E.碱性磷酸酯酶,F.富马酸酶.影响破碎的因素破碎过程中，在很宽的范围内破碎与细41影响破碎的因素酵母细胞在30℃破碎的破碎率大约比5℃的破碎率高1.5倍。因此,在不影响酶活力回收的前题下，适当提高破碎温度对破碎是有利的。高压消耗的能量大局部转化为热量。在200MPa下压缩1ml菌悬液释放热量47卡，可提高温度47℃。因此，在实际操作时，为防止温度过高，需要冷却控制破碎操作温度。不同微生物细胞因其形态，大小，细胞壁构造不同，在破碎时需要的压力不同。下表列出了不同微生物细胞到达50%破碎率所需要的压力。影响破碎的因素酵母细胞在30℃破碎的破42影响破碎的因素微生物格兰氏菌大小(μm)破碎50%所需压力(Pa)大肠杆菌阴性

2-4×0.51.5×107枯草芽孢杆菌阳性

1.5-3×0.5-0.82.4×107干酪乳杆菌阳性

4×0.4-0.73.1×107粪链球菌阳性

Φ1.021.5×108金黄葡萄球菌阳性

Φ1.01.9×108酿酒酵母阳性

7-12×5-81.5×108破碎不同微生物细胞需要的压力

影响破碎的因素微生物格兰氏菌大小(μm)破碎50%所需压力(43影响破碎的因素

细胞破碎率与培养条件和生长期有关。生长在合成培养基上的大肠杆菌要比生长在复杂培养基上的易破碎；对数生长期中期收获的细胞要比对数生长期后期收获的细胞易破碎。细胞类型和培养条件对破碎的影响

1.批式培养的产元假丝酵母2.连续培养的产元假丝酵母3.好气培养的啤酒酵母4.厌气培养的面包酵母5.连续培养的枯草芽孢杆菌影响破碎的因素细胞破碎率与培养条件和生长44影响破碎的因素高压释放破碎细胞虽然也存在细胞破碎释放原生质物质使破碎物粘度不断增加，改变流变学性质的问题，但因不会发生细胞壁降解而形成更小的碎片和释放细胞壁糖原，防止了破碎物粘度的进一步增加，因此对后序工艺的影响较小。细胞破碎率与细胞悬浮液通过匀浆器的次数成正比，因每次破碎率有限，在实际操作中可以采用批式循环或混合循环方式。为控制破碎温度，需在细胞悬浮液储罐进展冷却降温。在细胞悬浮液中参加细玻璃珠，或冷冻细胞悬浮液形成适当量的冰晶，可提高细胞破碎率。影响破碎的因素高压释放破碎细胞虽然也45冰冻压缩释放破碎法

冰冻压缩释放破碎法46设备与机理

冷冻的细胞悬浮液在低温低压力下不能流动，但提高压力时，水的结晶构造会发生相变，随着压力的增高，水的结晶内聚性降低，从不能流动的固相变成可流动的液相；在高压下发生流动喷射，使细胞破碎。压力与温度对水的相图的影响

设备与机理冷冻的细胞悬浮液在低温低压力47设备与机理冷压释放破碎器构造示意图

1.活塞，2.尼龙壳，3.园桶环，4.柱塞，5.压缩腔内的细胞悬浮液，6.O-型环，7.园盘，8.园盘支架，9.固定栓，10.空气阀，11.螺旋弹簧，12.网.设备与机理冷压释放破碎器构造示意图48设备与机理破碎细胞操作中，物料从小孔喷射由压力控制。只有压力高于相变临界压力时，细胞悬浮液从固相转变为液相，发生喷射。而喷射的结果是压力急剧降低，低于相变临界压力，细胞悬浮液成为固相，喷射停顿，压力再度升高超过相变临界压力，再次喷射，周而复始，完成细胞破碎。在园盘小孔上安装调节控制压力阀，使破碎在更高压力下进展。如将细胞悬浮液冷冻到-20℃，施以200Mpa压力，可将酿酒酵母细胞一次破碎率到达90%。设备与机理破碎细胞操作中，物料从小孔喷49技术适用性

由于在低温下操作，对于热敏感的生物活性物质有利，破碎的活性收率要比其他破碎方法高。利用该破碎技术破碎格兰氏阳性球菌和杆菌，分枝杆菌，放线菌，酵母和真菌提取酶均获得很好结果，说明微生物种类，细胞构造和形状对破碎影响较小。该技术用于破碎原生动物，花粉，甚至动物细胞，也均获得理想结果。破碎兔皮提取透明质酸，不仅可防止与粗构造结合，还可减少产物降解。将粗的动物组织，如皮和健切成几毫米的小块，与等量的水混合冷冻也可破碎。像软组织，如肝，肾等也可直接进展冷冻压缩释放破碎。因此与其它破碎技术相比，其适用范围更宽。技术适用性由于在低温下操作，对于热敏感的生物活50影响破碎的因素

酵母细胞悬浮液在-25℃破碎过程：活塞以0.95cm/秒的速度向前推进，14~15秒后，压力到达200Mpa以上，细胞悬浮物液化在压力下通过释放孔，高速喷射，发出'嘭'的一声，压力降到几乎为零，测定的物料喷射速度高于200m/秒，0.15秒后，压力上升接近原来的200Mpa，再次重复这一过程。因此，脉动的时间间隔为0.15秒，这段时间大局部是用于提高压力。整个破碎过程为不连续脉冲释放过程。酵母细胞破碎过程的压力变化情况影响破碎的因素酵母细胞悬浮液在-251影响破碎的因素将酿酒酵母悬浮参加不同浓度的氯化钾，氯化钠和氯化钙，分别在-15、-25、-35℃下进展压缩破碎，发现在盐存在下，于-25℃和-35℃时破碎率较高；盐的作用主要是改变相变的共熔点，降低释放的临界压力(Po)。氯化钙和氯化钠比氯化钾的作用明显，在破碎中的影响也较大。在-25℃下，使用不同浓度的酵母细胞进展破碎，发现破碎率随细胞浓度的增加而增加，至少细胞浓度可到达270mg/ml(干重)。高浓度的酵母细胞使悬浮液粘度增加，较低的相转移速度和平滑的流动会产生较高的破碎。同时会延长脉冲的间隔时间。影响破碎的因素将酿酒酵母悬浮参加不同浓度52大量破碎微生物细胞的方法为了大量破碎微生物细胞和其它生物材料，建立了半连续的操作方式。首先将细胞悬浮液在冷冻箱内冷冻制成圆柱状，其大小要适合加压圆筒。将预先冷冻成形的物料放入破碎器，利用水泵加压驱动活塞，使之通过小孔进展破碎。一般样品温度为-35℃，加压破碎温度为-20℃，面包酵母以平滑流动方式通过小孔，一次破碎的破碎率可到达90%。每小时可处理20Kg材料，成效可到达20%，能量消耗为1KWh/Kg。如果再增加处理量也是可能的。大量破碎微生物细胞的方法为了大量破53球磨破碎技术

球磨破碎技术54球磨破碎技术球磨破碎细胞的破碎率可高达95%，用于提取细胞壁，线粒体，核酸，蛋白以及其它细胞器的收率也高。用Dynomill破碎酵母细胞提取线粒体的收率要比其它机械破碎法要高5-8倍。球磨破碎细胞应用范围广，从实验室到大规模生产均可使用，并可控制系统及破碎工艺过程的温度；操作系统密闭，可对系统进展灭菌，防止污染。因此，该技术和设备的开展和应用受到广泛关注。球磨破碎技术球磨破碎细胞的破碎率可高55设备及原理

国际上不同生产厂家分别生产多种球磨破碎细胞的设备，从实验室使用的小型细胞球磨机到大规模生产使用的每小时可破碎100公斤细胞的大型细胞破碎机，多各种类型和规格。但根本原理和机械构造大同小异。这里主要介绍瑞典的Dyno-mill机。设备及原理国际上不同生产厂家分别生产多种球磨破56设备及原理Dyno-mill细胞破碎机构造示意图1为整体构造图，2为破碎室构造图，A破碎室夹套，B搅拌叶，C搅拌轴，D微孔别离器,E物料进口,F温度测试孔,G冷却液进口,H搅拌轴设备及原理Dyno-mill细胞破碎机构造示意图57设备及原理球磨容器驱动马达为三相380V，1.85KW，2900rpm的电动马达。其主动轮通过一个特殊的V型皮带与搅动轴上的被动轮连结，利用安装在操作马达开关板上的手柄，控制皮带在主动轮和被动轮上的位置，改变搅动速度。分别到达2000，3000，4500和6000转/秒，这时的搅拌叶的线速度分别为6.7，10，15和20米/秒。设备及原理球磨容器58设备及原理电动马达的控制控制马达的开关有两个按钮，开和关，安培表，信号灯，在防护罩上有磁性开关，一当防护罩翻开，或在操作时未关上，电动马达不能启动。搅拌叶由聚氨酯或不锈钢制造的直径为64毫米的圆盘，它们是用垫片和别离子按一定间隔距离将其固定在搅动轴上。AB搅拌叶轮构造示意图A聚氨酯叶轮B不锈钢叶轮设备及原理电动马达的控制59设备及原理别离器球磨剂球磨剂为无铅玻璃制造的玻璃珠，直径范围最小的为0.1mm，最大的为1.5mm，可根据破碎的细胞种类进展选择。实验结果说明在球磨容器内的球磨剂装量为研磨容器的容积的80-85%为宜。设备及原理别离器60设备及原理给料泵为了连续破碎，可使用能调速的普通蠕动泵，将细胞悬浮液连续输到破碎器内，其供料速度可由需要的破碎率来控制。冷冻设备由于在细胞破碎过程中高速搅拌，研磨剂与研磨剂，研磨剂与细胞之间的磨擦会产生大量热量，破碎过程温度不断升高，为防止生物活性物质失活，对破碎系统进展冷却是十分必需的。对于Dtno-millKDL可配用DMK15/F型的循环流动式制冷机，对球磨容器和细胞悬浮液储存器进展冷却。冷冻液可采用聚乙二醇/水溶液〔1/1〕。设备及原理给料泵61设备及原理破碎效能设备及原理破碎效能62细胞破碎原理及动力学

在高速细胞破碎球磨机内，高速旋转搅拌叶搅动细胞悬浮液和球磨剂--玻璃珠，由于切力层间的碰撞及球磨剂的旋辗而使细胞破碎。因此，细胞破碎的过程实为一级反响动力学过程。如果以细胞内蛋白质的释放来衡量破碎程度，蛋白质释放速度直接与未释放的蛋白质量成正比。loge[Rm/(Rma-R)]=logeD=ktR为某一时间测定的细胞破碎释放的蛋白质量，Rm为总蛋白质释放量，k为一级反响动力学常数。将上式对时间t积分D=Rm/Rma-R，即为未释放蛋白质的百分数的倒数。假设按细胞破碎率来表示，可写成：loge(Xma/1-X)=kt这里Xma为最大破碎率，X是在时间t时的破碎率。细胞破碎原理及动力学在高速细胞破碎球磨机内，高速旋63细胞破碎原理及动力学按可溶性蛋白质释放的破碎动力学，那么可写为：loge[Rm/(Rma-R)]=logeD=kt假设按实际测定的蛋白质量Ro表示，当Ro=Rma时，那么Ro=Rma+k2/k1.K按细胞破碎率来表示，可写成：loge(Xma/1-X)=kt通过对破碎细胞的球磨机的示踪研究说明，其动力学行为与连续搅拌反响器(CSTR)很相似，因此，对Dyno-millKDL0.6的球磨过程可以认为是由四个串联的搅拌反响器组成，即由四个搅拌叶构成一个反响器，相邻的搅动叶轮距离较小，因此，存在反流现象，而使其效率略有降低。而5L的Dyno-mill，因反流现象可以忽略，因此破碎效率较高。细胞破碎原理及动力学按可溶性蛋白质释放的破碎动力学，那64影响细胞破碎的因素及其相互关系

细胞种类及状态利用Dyno-millKDL进展的细胞破碎试验说明，不同中属的微生物细胞在一样条件下破碎时，其破碎效率有明显差异，如表。

菌种活菌数蛋白质酶

最大破碎率(%)K(min-1)最大释放量(mg/g.dl)K(min-1)最大释放量（IU/g.dl）K(min-1)假单孢菌--66.01.146.21.6阴沟肠杆菌1001.399.01.5570.01.65大肠杆菌1001.7540.51.732.01.4酵母901.4654.01.545.01.3影响细胞破碎的因素及其相互关系细胞种类及状态菌种活65影响细胞破碎的因素及其相互关系上述差异的主要原因是不同种属的微生物细胞的大小和形态，细胞壁或膜的构造不同，另外，因生长条件如培养温度，时间，营养成份不同使上述的细胞形态细胞壁构造等也有差异。因此，即使在一样的破碎条件下其破碎效果也不同。换句话说，不同种属的微生物细胞所需的破碎条件也不一样。从大量文献中可以总结出这样的规律：按细胞破碎的难易程度是细菌＜酵母＜真菌＜藻类。另外，细胞的保存情况也会影响破碎效果，

保存状态破碎程度(%)5(min)10(min)15(min)喷雾干燥559197新鲜8799100影响细胞破碎的因素及其相互关系上述差异66细胞浓度

在细胞破碎前，需用适当的介质，比方缓冲液按细胞重量配制成一定细胞浓度的悬浮液。悬浮液要均匀，要防止有结块和沉淀。初始的细胞浓度对破碎速率的影响如图。破碎速度常数(K)与酵母浓度的关系

不锈钢搅拌叶，聚氨酯搅拌叶

细胞浓度在细胞破碎前，需用适当的67细胞浓度一级反响动力学的速成常数应当与细胞浓度无关，但在较高细胞浓度下，破碎过程细胞内含物不断释放使系统粘度不断升高，混合速度降低，导致破碎速率下降。在高细胞浓度下，最大蛋白质释放量(Rm)降低，但破碎率高。低细胞浓度下，细胞的总蛋白质释放量高，并受流出速度影响较小；高细胞浓度下，细胞的总蛋白质释放量降低，特别是在高流出速度下，总蛋白质释放量随细胞浓度增加而下降。

酵母浓度对蛋白质释放的影响△▲不锈钢搅拌叶，▲●流速为100×10-6m3/sec○●聚氨酯搅拌叶，△○流速为20×10-6m3/sec细胞浓度一级反响动力学的速成常数应当与细胞68细胞浓度

除了细胞浓度直接影响破碎物的粘度以外，细胞的保存状态也影响着粘度和破碎率。

细胞浓度与保存状态对粘度的影响◆鲜细胞■干细胞细胞浓度除了细胞浓度直接影响破碎物的粘度以外，细69细胞浓度细胞破碎过程中，由于粘度增加，热传导能力降低，即使在一样的冷却条件下，破碎系统的温度也会增高，温度的增高会引起蛋白质和酶变性，使蛋白质和酶的总释放量降低。细胞浓度对破碎温度的影响◆玻璃研磨室■不锈钢研磨室

细胞浓度细胞破碎过程中，由于粘度增加，热传导能力70细胞浓度总之，在Dyno-mill上进展细胞破碎，细胞浓度从20%增加到40%，破碎速度常数仅有很小的变化;细胞浓度增加到50%，破碎速度常数减小，破碎效率降低。高细胞浓度下，还会发生细胞破碎物沉淀和蛋白质沉淀现象．一般来说，破碎细胞浓度以40%为宜。细胞浓度总之，在Dyno-mill上进71球磨剂

最常使用的球磨剂是无铅玻璃珠，其它的还有不锈钢珠，聚酯和聚酰胺珠等。球磨剂颗粒大小的影响一般使用的无铅玻璃珠的直径为0.1~1.5mm，利用大肠杆菌和酵母细胞进展实验发现，细胞破碎率随玻璃珠直径的增加而降低。对于不同的细胞，由于其大小不同，使用的玻璃珠的最适直径也不同。大肠杆菌和阴沟肠杆菌使用0.1mm的玻璃珠进展破碎的效率最高；而酵母细胞使用0.25~0.5mm的研磨剂最宜。球磨剂最常使用的球磨剂是无铅玻璃珠，72球磨剂

细胞内蛋白质和各种酶的释放速度常数与玻璃珠直径的关系如图，说明酵母细胞破碎的最适玻璃珠直径为0.25~0.5mm。玻璃珠直径对破碎速度常数的影响■酶▲蛋白质

球磨剂细胞内蛋白质和各种酶的释放速度常73球磨剂

破碎率与玻璃珠大小和物料流速的关系如图，说明破碎率随使用的玻璃珠直径的增加和物料流速的增加而降低。玻璃珠大小与流速对破碎率的影响球磨剂破碎率与玻璃珠大小和物料流速的关74球磨剂实际操作时，一般不使用0.1mm的球磨剂，即使破碎细菌也使用0.25~0.5mm的玻璃珠。其原因有三：一、用0.1mm的玻璃珠破碎速度虽高，时间短，假设破碎时间控制不严，对酶有破坏作用，破碎物的酶活会下降；二、小珠机械研磨产生热量高；三、选择狭缝别离器时，狭缝的大小应当是使用的研磨剂直径的三分之一，使用0.1mm的玻璃珠，狭缝应选用0.03mm的，这样的狭缝别离很慢，大规模破碎时很困难。玻璃珠作球磨剂，使用100h的损失不超过3%，一年后检查别离器通道无重大变化，说明玻璃珠可以长期反复使用。还发现使用的玻璃珠大小与酶在细胞内的位置及细胞浓度有关。球磨剂实际操作时，一般不使用0.175球磨剂装量的影响使用无铅玻璃珠作球磨剂，一般的装量为研磨容器容积的80~85%。随球磨剂装量的降低，细胞破碎效率也降低，同时研磨过程中产生的热量也减少。因此，如果破碎释放的活性物质不耐热，而且设备冷却又差，需适当减少球磨剂的装量。另外，假设细胞悬浮液或破碎物的粘度很高时，也需适当降低球磨剂的装量。球磨剂装量的影响76球磨剂搅动速度

Dyno-mill的搅动轴有四个转速，即2000，3000，4500和6000r/min，相应的搅拌叶轮的线速度为6.9，10，15和20m/s。在球磨细胞破碎过程中，马达驱动轴带动搅拌叶转动是细胞破碎的维一能量来源。因此，搅拌叶的转速决定着细胞破碎的速度和程度。大多数试验证明，细胞破碎速率随搅拌叶转速的增加而增加，但在很高的转速下细胞破碎速率不会成比例增加，有时还可能下降。球磨剂搅动速度77搅动速度

酵母细胞破碎过程中，酶的释放速度常数随叶轮转动速度的增加而增加。胞间质酶，在细胞破碎过程中容易释放，细胞器结合酶，只有细胞完全破碎才释放出来。液轮搅动速度对蛋白质释放速度常数的影响○蛋白质,△麦芽糖酶,□磷酸酯酶,●MDH,▲G6PDH,■6GPDH.搅动速度酵母细胞破碎过程中，酶的释放速度78搅动速度Dyno-mill的容积及搅动叶轮的材质上的差异，以及操作方式的差异，搅动速度对细胞破碎的影响也有差异。但总的趋势一样，即搅动速率增加，破碎的速度常数也增加。搅动速度、叶轮材质和操作方式对破碎速率的影响△批式，5L破碎室，不锈钢搅拌叶○批式，●连续，0.6L破碎室，聚氨酯搅拌叶，▲连续，▽批式搅动速度Dyno-mill的容积及搅动79搅动速度

实际上，搅拌叶的搅动速度的增加使破碎加快，也使整个系统的温度升高。

搅拌速度(m/s)温度(℃)

开始温度终了温度1013~41517~822.5121是在有冷却的条件下进展的，搅动速度的增加造成温度升高；尽管高速搅动可以获得高的破碎速度，但对某些对热敏感的活性物质来说就受到限制。搅动速度实际上，搅拌叶的搅动速度的增80叶轮构造经常使用的搅动叶轮有两种，一种是由聚氨基甲酸酯材料制造，具有开放式的构造；另一种是用不锈钢制造的，构造上不如聚氨基甲酸酯的开放。在5L破碎容器中不同材质的搅拌叶对破碎效率的影响

○

聚氨基甲酸酯

△

不锈钢

叶轮构造经常使用的搅动叶轮有两种，一种是由聚氨81叶轮构造不同材质和构造的搅动叶轮在操作中因搅动效果的差异，使破碎系统的温度变化也不同。流速(m3/sec)温度升高(℃)

不锈钢叶轮聚氨酯叶轮83×10-616.517.053×10-617.019.542×10-618.022.022×10-620.028.0该结果说明具有开放构造的聚氨酯搅拌叶的搅动效率高，物料球磨效果好，因而升温也比不锈钢叶轮的高些。叶轮构造不同材质和构造的搅动叶轮在操作82叶轮构造在低转速下，较开放的聚氨酯叶轮的破碎效率较低，这是由于反逆作用所造成的。在高转速下，有较高的搅动效率，且能耗也增加。为增加搅动效率，可以使搅拌叶安装成与轴有一定角度，其作用是增加分散能力，但这样会使连续破碎的能力减小；因增加了能量到细胞悬浮液中的传递能力，而有较高的破碎速度，但能量效率降低，特别是在高转速下。叶轮构造在低转速下，较开放的聚氨酯叶轮的破碎效率较低，这是由83叶轮构造叶轮构造和材质上的差异造成功率消耗不同，叶轮形状,转速和验磨腔的容积对功率消耗的影响●聚氨基甲酸酯搅拌叶▲不锈钢搅拌叶具有较开放构造的聚氨酯叶轮的功率消耗高于构造上较封闭的不锈钢叶轮，不管是在容积较大的，还是在容积较小的球磨破碎机上均是如此。叶轮构造叶轮构造和材质上的差异造成功率消耗不同，叶轮84叶轮构造一个球磨机的效率可用以下公式计算:Eff=RYQ/P这里R为每kg细胞释放的蛋白量，Y是细胞浓度，Q为流速，P为动力消耗。在5.0L的Dyno-mill上，使用聚氨基甲酸酯搅拌叶和不锈钢搅拌叶时的动力效率与流速和搅动速度的关系如图。

聚氨基甲酸酯叶轮的操作动力效率不锈钢叶轮的操作动力效率叶轮构造一个球磨机的效率可用以下公式计算:聚氨基甲酸酯叶轮85叶轮构造以上结果说明用聚氨酯搅拌叶操作时，球磨的动力效率随流速和叶轮转速的减小而增加；而用不锈钢搅拌叶时，以转速10m/sec的速度运转操作，破碎的动力效率最高，当流速降低时，动力效率也降低，但总的趋势变化不大。在0.6L的破碎容器上与5.0L的不同。由于纵向分散和反流的增加，使相对的反响器有效数目减少，引起球研磨破碎产率的降低。因此，在低流速和长时间停留的情况下特别有效。显然，引起增加分散的因素不能增加破碎速率。在0.6L的破碎容器中，随流速的增加动力效率会陡然减弱，增加搅拌叶转速会引起破碎速率的增加。但用增加分散来改进产率的效果不明显。叶轮构造以上结果说明用聚氨酯搅拌叶86流速

在连续的细胞破碎过程中，流速决定着细胞在破碎容器中的存留时间，直接影响着破碎系统的温度和破碎程度。

流速(l/h)流出液温度(℃)酶活性(IU/g细胞)蛋白(mg/g细胞)比活(IU/mg蛋白质)72529.450.00.588152629.443.40.6772015.527.742.40.653数据说明随着流速的增加，破碎系统的温度会较低；释放蛋白质量降低，酶量降低，比活增高。流速在连续的细胞破碎过程中，流速决定着细胞在破87流速流速增加，蛋白质的释放速度常数也降低。在不同搅拌速度下细胞悬浮液流速对各种酶释放的影响流速流速增加，蛋白质的释放速度常数也降低。在不同搅拌速度下88流速

细胞破碎与搅动速度有关,在高搅动速度下，流速的变化对细胞破碎率影响较小，而在低的搅动速度下，流速对破碎率的影响较大。细胞悬浮液流速与搅动速度对细胞破碎率的影响流速细胞破碎与搅动速度有关,在高搅动89时间

在批式破碎过程中，破碎时间直接影响着细胞破碎的程度，以及蛋白质和酶的释放。

细胞破碎过程中实测的酶释放曲线细胞破碎时间过长，酶会发生失活。因此，破碎时间要适当掌握。另外，不同酶在细胞中所处的位置有差异，细胞破碎时酶的释放速度不同，细胞器结合的酶释放较慢，而细胞的总蛋白质的释放可能比某些酶的释放要快，为了获得较高的比活，也要控制破碎时间。时间在批式破碎过程中，破碎时间直接90温度

目前还没有温度对破碎过程影响的详细研究报告，由于破碎为产热过程，直接影响破碎物的粘度及酶的活性和蛋白质总量的释放，一般来说，破碎温度越高，细胞蛋白质的释放量越低，

.温度对蛋白质释放的影响

由此可见，破碎过程加强冷却循环，降低破碎系统的温度是必须的。温度目前还没有温度对破碎过程影响的详细91几个典型实例细菌细胞的破碎

(1)批式破碎条件参数细菌大肠杆菌研磨剂玻璃珠1-1.4μm

1.4μm

0.7×0.25μm

破碎容器玻璃260ml260ml260ml

装量150ml细胞悬浮液搅拌叶转速2000r/min相当于10m/sec

进口温度0℃0℃0℃

出口温度2-3℃2-3℃4-5℃

时间14min12min12min

破碎程度活的格兰氏染色细胞减少到0.001%

冷冻液温度-9℃

冷冻液流速150L/h几个典型实例细菌细胞的破碎92几个典型实例

酵母细胞破碎

(1)啤酒酵母(Saccharomycescerevisiae)

批次123

细胞悬浮液组成干物料含量14.2%,水,pH7.0

细胞大小6-8μm同同破碎腔容积0.3L同同操作方式批式同同研磨剂无铅玻璃珠,直径0.25-0.5nm

装量玻璃珠256ml,细胞悬浮液150ml

冷却液温度-8℃,用盐溶液同冷却液流速200升/小时同同料液进口温度2℃2℃2℃

料液出口温度4℃5℃5-6℃

破碎时间(min)123

破碎率(%)819699.5

几个典型实例酵母细胞破碎93几个典型实例真菌(1)青霉菌(penicilliumsp.)细胞悬浮液组成干物料含量5%,水细胞大小纤维状破碎腔容积0.6L操作方式连续研磨剂无铅玻璃珠,直径0.5-0.75nm装量玻璃珠510ml搅动速度4500r/min,相当于15m/sec别离器宽0.1ml冷却液温度自来水料液进口温度16℃料液出口温度36℃料液流速(L/h)3破碎率(%)100几个典型实例真菌94几个典型实例藻类批次123细胞悬浮液很粘,水同同细胞大小10-15μm同同破碎腔容积0.3L同0.6L操作方式批式同连续研磨剂无铅玻璃珠,直径0.25-0.5nm510ml装量玻璃珠260ml,细胞悬浮液150ml搅动速度10m/sec15m/sec75m/sec别离器0.05nm同同冷却液温度自来水,同同冷却液流速200L/h同同料液进口温度16℃16℃18℃料液出口温度18℃21℃24℃料液流速(L/h)6破碎时间(min)11破碎率(%)100100100几个典型实例藻类95研磨法研磨法96原理

最早在实验室用的研磨法是使用氧化铝，也可用细玻璃粉或石英粉作为研磨剂，其颗粒大小为0.1nm。先将细胞和研磨剂按1比5的比例混合均匀，预冷后放入研钵，手持研磨杵进展研磨。依靠在压力下推动固体与细胞的挤压与磨擦使细胞壁破碎。该法简便，但效率低，处理量小。只能在实验室中使用。根据这个原理,设计了细菌磨。细菌磨构造示意图主要由研磨和动力两局部构成。研磨局部包括滚筒和承座。滚筒是长15cm，直径5cm，厚度为2nm以上的硬质磨砂玻璃管；承座是能与玻璃滚筒的半面密切贴合的凹型硬质瓷座。玻璃滚筒两端用橡皮塞密封，一端带有被动轮的钢轴通过橡皮塞中心贯穿玻璃滚筒，滚筒与瓷承座不但要密切吻合，且必须互相贴紧。因此，在瓷承座下必须垫以强有力的弹簧或富有弹性的橡胶。玻璃滚筒内可参加冰块，以便降温；瓷承坐也可制成中空的，接上进出口，可以通入冷却水，以便控制研磨细胞时的温度。动力局部是一小马达，由皮带与被动轮传动，减速后，滚筒转速为120-130r/min。原理最早在实验室用的研磨法是使用氧97操作

将湿菌体与1.3-1.5倍重量的直径在3mm以下的玻璃粉研磨剂共置一研钵内，冷却至5℃以下，迅速将玻璃粉和湿细胞混合均匀，研压成块，用不锈钢勺取5g左右的混合物，自旋转的滚筒前边参加并迅速挤压，使混合物随滚筒进入磨中，随即压挤附着在滚筒外表形成薄层，研磨20-30sec，用一长方形玻璃片横置于滚筒面上，将研磨的混合物自滚筒上刮下。研磨混合物中的水量极为重要，太少时混合物不能附着在滚筒上，太多时研磨破碎效率大幅度降低。因此，研磨混合物制备时的水量应根据细胞的干湿加以控制。破碎率可通过破碎时间加以掌握，一般也可到达95%以上的破碎率。利用该法破碎细胞的效率低，它只适于实验室和小量制备。但其适用范围较广，可破碎细菌，酵母，真菌，甚至动植物组织。操作将湿菌体与1.3-1.5倍重量的直径98枯燥提取法枯燥提取法99该法适合提取酵母中比较稳定的酶。通过枯燥使细胞膜的渗透性改变，从而使细胞内某些物质容易抽提。枯燥的方法包括空气枯燥、真空枯燥、冷冻枯燥和水溶性有机溶剂脱水枯燥等。空气枯燥一般是在25-30℃或高至35-40℃的枯燥气流中吹干，将干细胞再悬浮在3-5倍的水或缓冲液中，室温下搅拌2-3h抽提。抽提的缓冲液pH在8-9时比7.0时抽提的可溶性蛋白质较多；如果目的蛋白质稳定性较高，可在40-45℃下抽提；如果目的蛋白质不稳定，需在较低的温度下处理。一般来说，空气枯燥的细胞提取的蛋白质要比真空枯燥和冷冻枯燥的多，这是由于在空气枯燥时细胞会发生自溶的原故。在有机溶剂脱水枯燥时使用的有机溶剂有丙酮及二氧六环。通常将十倍于细胞悬浮液的有机溶剂预冷至-20℃，在搅拌下将细胞悬浮液缓慢倒入有机溶剂，停顿搅拌，静止使之自然沉降，倾去上清，用布氏漏斗真空过滤，滤饼用冷的有机溶剂洗涤，抽干后，立即放入内放有石蜡真空枯燥器，吸附剩余的有机溶剂。枯燥的细胞可采用上述的抽提方法进展处理。由于有机溶剂将细胞膜上的脂类物质去除，改善了通透性，有利于酶的提取。该法适合提取酵母中比较稳定的酶100冻融法冻融法101此法是利用细胞含有大量水份，在快速冷冻时，细胞内水很快结晶，形成大量晶核，体积增大，将细胞胀破，到达破碎细胞的目的。一般是将40-70%的细胞悬浮液放入低温冰箱使之快速冷冻，冻结后，取出在室温下融化，然后再冷冻，反复进展，通常需三次以上，酶的释放率才可能到达满意。此法主要适用于大肠杆菌和细胞壁较薄的细菌，特别适用于位胞间质的酶的释放。冻融法十分简便，不需特殊设备，在实验室中使用很方便，但耗时，耗能，大规模应用困难。此法是利用细胞含有大量水份，在快速冷102化学法某些有机溶剂、外表活性剂、金属螯合剂、变性剂、抗生素等化学试剂可以改变细胞壁或膜构造的通透性，使胞内物质有选择性的渗透出来，因此，将这种处理方法统称为化学法。化学法某些有机溶103有机溶剂法使用非水溶性的有机溶剂，如醋酸乙酯、苯、甲苯、乙醚或氯仿处理使细胞脱脂，改变其渗透性，或使细胞自溶。例如甲苯能溶解细胞膜的磷脂层，改善膜的通透性。由酵母细胞提取酶经常使用此法，将500g酵母湿细胞与480ml甲苯混合，于40℃下搅拌2h，放置待温度降到10℃以下，参加1L水或缓冲液，搅拌后，放入冷柜过夜，酶即释放到水相中。分出有机相，将水相离心除去细胞和不溶物，即可得粗酶溶液。利用此法可以自溶的菌有无色杆菌、芽胞杆菌、梭菌、假单孢菌等，而自溶能力弱的菌可以参加溶菌酶促使自溶。有机溶剂处理的温度、时间、pH、缓冲液浓度和细胞的生理状态均会影响细胞的自溶，需要通过实验确定。有机溶剂法使用非水溶性的有机溶剂，如醋酸104外表活性剂法膜结合的酶即使在细胞破碎后仍很难溶解下来，它们的提取通常需借助于外表活性剂。在酶提取中经常使用的外表活性剂包括天然的外表活性剂，如胆酸盐和磷脂等，合成的外表活性剂有离子型和非离子型，常用的离子型外表活性剂有十二烷基磺酸纳(SDS，阴离子型)、溴化十六烷基二乙胺(阳离子型)、非离子型的有吐温(Tween)及Triton-X100等。在适当的pH及低离子强度条件下，外表活性剂能与脂蛋白形成微泡使膜的渗透性改变或使之溶解。微泡的形成严格地依赖于pH和温度，一般来说，离子型较非离子型外表活性剂更有效，但也因此导致蛋白