《鱼类细胞工程基础》教学课件

鱼类细胞工程根底实验指导教师王敏汤蓉辅助研究生尹晓燕童娜1鱼类细胞工程根底实验指导教师王敏汤蓉1课程安排2课程安排23344

动物细胞工程动物细胞工程，是应用细胞生物学和分子生物学的理论和方法，按照人们的设计，进展在细胞水平上的遗传操作,从而获得新型生物。5动物细胞工程动物细胞工程，是应用细胞生物学和分子动物细胞工程常用技术动物细胞培养技术动物细胞融合技术单克隆抗体技术胚胎移植技术细胞核移植技术6动物细胞工程常用技术动物细胞培养技术6动物细胞培养细胞培养是指从动物活体中取出小块组织别离出细胞，在模拟机体内的生理环境条件下，进展培养，使之继续生存、生长、增殖。原代培养传代培养永久细胞系7动物细胞培养细胞培养是指从动物活体中取出小细胞培养在水产业的应用鱼类病毒学：病毒的别离、鉴定以及病毒疫苗的制备鱼类细胞毒理学：评价样品的细胞毒性等水产根底理论鱼类免疫学鱼类遗传学8细胞培养在水产业的应用8本实验课的目的培养实验的思维，提高实验技能，锻炼动手能力。掌握无菌操作，养成标准的实验室工作习惯。为将来适应多种领域的工作打根底。9本实验课的目的9鱼类细胞培养的根本条件温度温度过低时细胞生长缓慢甚至不生长。利用冷冻保藏细胞可保持细胞的原有分裂分化能力。温度过高导致细胞死亡。这主要是由酶和蛋白质所需要的最适温度决定的。适宜的温度：25℃(温带鱼)、30℃(热带鱼)、15℃(寒带鱼)、37℃(水生哺乳动物)。10鱼类细胞培养的根本条件温度102.pH过酸或过碱可导致细胞死亡。这主要与蛋白质的变性和细胞膜的构造受损有关。用NaHCO3和Hepes调节培养液的pH至7.4左右。鱼类细胞培养的根本条件112.pH鱼类细胞培养的根本条件11渗透压细胞膜调节渗透压的能力是有限的。需用平衡盐溶液配制各种试剂。常用的平衡盐溶液：PBS：磷酸盐缓冲溶液〔phosphatebufferedsolution〕D--Hanks鱼类细胞培养的根本条件12渗透压鱼类细胞培养的根本条件12营养物细胞培养基：培养基中含有细胞增殖和生长所需要的各种物质。常用培养基：MEM、M199、L-15等动物细胞离体培养常常需要血清。血清提供生长必需因子，如激素、微量元素、矿物质和脂肪。小牛血清；胎牛血清。鱼类细胞培养的根本条件13营养物鱼类细胞培养的根本条件13支持物大多数动物细胞有贴壁生长的习惯。离体培养常用玻璃或塑料培养瓶等作为支持物。气体交换CO2培养箱,调节CO2的比例为5%。去离子水/三次蒸馏水鱼类细胞培养的根本条件14支持物鱼类细胞培养的根本条件14无菌条件体外细胞培养仅仅是对所需的细胞进展培养，但环境中〔如空气〕有各种其他微生物，必须对所需细胞进展无杂菌的隔离培养。无菌条件是细胞离体培养最根本的条件。

鱼类细胞培养的根本条件超净工作台15无菌条件鱼类细胞培养的根本条件超净工作台15实验室仪器设备实验室条件：枯燥、紫外灯仪器设备：高压灭菌锅:用于高压灭菌枯燥箱:用于枯燥超净工作台:用于无菌操作玻璃三蒸水器:用于制三蒸馏水恒温生化培养箱:用于恒温培养细胞倒置生物显微镜:用于观察细胞生长液氮罐：用于细胞长期保存16实验室仪器设备实验室条件：枯燥、紫外灯16考核方法实验报告〔论文格式〕一.目的与意义二.材料与方法三.实验结果四.讨论〔问题\经历\体会〕要求：多查阅参考文献，实验中胆大心细。17考核方法实验报告〔论文格式〕17修读要求1．无菌操作，严格标准操作；2．实验是连续性的，需要每天来观察和处理细胞；3.每天来做实验的时间与教师和研究生协商，各组时间要相对集中和固定。18修读要求1．无菌操作，严格标准操作；18实验一&二思考题培养基过滤后需要加哪些物质？为什么？为什么胰蛋白酶和培养基要过滤灭菌，不能高压灭菌？生长培养基的pH值应为多少？呈什么颜色？为什么？为什么要培养基中需参加L-谷氨酰胺？为什么复苏细胞时，要迅速解冻？19实验一&二思考题培养基过滤后需要加哪些物质？为什么？19实验五染色体制备每一物种的细胞一般都具有一定数目、形状和大小的染色体。在秋水仙素的作用下可使分裂细胞阻断在中期，此时染色体形态最典型，然后通过低渗、固定、染色等步骤，便可在显微镜下呈现出其形态。20实验五染色体制备每一物种的细胞一般都具有一定数目、形状和大一、准备细胞接种细胞：T75cm2瓶子1个培养24h换10mL新鲜medium和0.1mL秋水仙素〔1μg/L〕培养13-15h消化细胞，1000rpm离心，5分钟，收集沉淀细胞加2mLPBS混匀细胞将细胞悬液移到T75cm2的培养瓶内操作步骤21一、准备细胞操作步骤21慢慢加10mL双蒸水〔4℃〕室温孵育10min慢慢加10mL现配的GAA固定液〔冰醋酸：甲醇＝1：3〕室温放置10min移到一个离心管，1000rpm离心，10min弃去上清，留约2mL加3mL新鲜固定液，轻轻混匀细胞1000rpm离心，5min弃去上清，留约0.5mL22慢慢加10mL双蒸水〔4℃〕22加0.5mL新鲜固定液，轻轻混匀细胞，然后加4mL新鲜固定液，轻轻混匀孵育5分钟1000rpm离心，5分钟弃去4.8mL上清，仅留0.2mL加1-1.5mL新鲜固定液，轻轻混匀细胞沉淀二、清洁玻片6-8个干净的玻片，浸泡在95%乙醇里烘干浸泡在冰水里至少30min23加0.5mL新鲜固定液，轻轻混匀细胞，然后加4mL新鲜固定三、准备玻片和染色用滴管吸取来自于步骤1-21的细胞悬液0.2mL滴在湿玻片上火焰上拖动，固定2-3次放在预热的切片烘干机上，15min〔蒸发液体〕把装有1NHCl的染色缸，浸入60℃水浴中加热，把玻片插入培育10min倾去HCl溶液用双蒸水清洗玻片2次空气枯燥24三、准备玻片和染色24将玻片浸入装有Giemsa溶液的染色缸中〔现稀释的1：25〕孵育15min用双蒸水冲洗玻片2-3次，除去残液空气枯燥显微镜下观察计数25将玻片浸入装有Giemsa溶液的染色缸中〔现稀释的1：25〕实验六细胞冻存细胞冻存是细胞保存的主要方法之一。利用冻存技术将细胞置于-196℃液氮中低温保存，可以使细胞暂时脱离生长状态而将其细胞特性保存起来，这样在需要的时候再复苏细胞用于实验。适度地保存一定量的细胞，可以防止因正在培养的细胞被污染或其他意外事件而使细胞丢种，起到了细胞保种的作用。可以利用细胞冻存的形式来购置、寄赠、交换和运送某些细胞。26实验六细胞冻存细胞冻存是细胞保存的主要方法之一。26冻存原理细胞冻存时向培养基中参加保护剂---终浓度5%-15%的二甲基亚砜〔DMSO〕，可使溶液冰点降低，加之在缓慢冻结条件下，细胞内水分透出，减少了冰晶形成，从而防止细胞损伤。采用“慢冻快融〞的方法能较好地保证细胞存活。标准冷冻速度开场为-1--2℃/min，当温度低于-25℃时可加速，到-80℃之后可直接投入液氮内〔-196℃〕。27冻存原理细胞冻存时向培养基中参加保护剂---终浓度5%操作步骤冻存2个75cm2培养瓶里的细胞，取6－8个1.5mL的冻存管。如果每个冻存管需要装1mL的细胞悬浮液，需要配6－8mL的冻存液。在离心管中依次参加：DMSO0.6mL,生长培养基1.8mL，FBS0.6mL轻吹打混匀，立即放入冰里；另在收集消化好的细胞的离心管里参加培养液3mL,轻轻吹打使细胞均匀悬浮。28操作步骤冻存2个75cm2培养瓶里的细胞，取6－8个1.5吸取细胞悬液，轻轻参加装有冻存液的离心管内。注意从底部向上缓慢拖着滴加，边加边转动离心管，使细胞均匀分布冻存液中。将细胞悬液分装在6个冻存管中，各管加1mL。盖上冻存管盖子，用膜封口，作好标记。在装有异丙醇的降温盒中，放装有细胞的冻存管，加盖后盒子放入-80℃过夜；盒子转移到液氮内，进展登记。29吸取细胞悬液，轻轻参加装有冻存液的离心管内。注意从底部向上缓鱼类细胞工程根底实验指导教师王敏汤蓉辅助研究生尹晓燕童娜30鱼类细胞工程根底实验指导教师王敏汤蓉1课程安排31课程安排2323334

动物细胞工程动物细胞工程，是应用细胞生物学和分子生物学的理论和方法，按照人们的设计，进展在细胞水平上的遗传操作,从而获得新型生物。34动物细胞工程动物细胞工程，是应用细胞生物学和分子动物细胞工程常用技术动物细胞培养技术动物细胞融合技术单克隆抗体技术胚胎移植技术细胞核移植技术35动物细胞工程常用技术动物细胞培养技术6动物细胞培养细胞培养是指从动物活体中取出小块组织别离出细胞，在模拟机体内的生理环境条件下，进展培养，使之继续生存、生长、增殖。原代培养传代培养永久细胞系36动物细胞培养细胞培养是指从动物活体中取出小细胞培养在水产业的应用鱼类病毒学：病毒的别离、鉴定以及病毒疫苗的制备鱼类细胞毒理学：评价样品的细胞毒性等水产根底理论鱼类免疫学鱼类遗传学37细胞培养在水产业的应用8本实验课的目的培养实验的思维，提高实验技能，锻炼动手能力。掌握无菌操作，养成标准的实验室工作习惯。为将来适应多种领域的工作打根底。38本实验课的目的9鱼类细胞培养的根本条件温度温度过低时细胞生长缓慢甚至不生长。利用冷冻保藏细胞可保持细胞的原有分裂分化能力。温度过高导致细胞死亡。这主要是由酶和蛋白质所需要的最适温度决定的。适宜的温度：25℃(温带鱼)、30℃(热带鱼)、15℃(寒带鱼)、37℃(水生哺乳动物)。39鱼类细胞培养的根本条件温度102.pH过酸或过碱可导致细胞死亡。这主要与蛋白质的变性和细胞膜的构造受损有关。用NaHCO3和Hepes调节培养液的pH至7.4左右。鱼类细胞培养的根本条件402.pH鱼类细胞培养的根本条件11渗透压细胞膜调节渗透压的能力是有限的。需用平衡盐溶液配制各种试剂。常用的平衡盐溶液：PBS：磷酸盐缓冲溶液〔phosphatebufferedsolution〕D--Hanks鱼类细胞培养的根本条件41渗透压鱼类细胞培养的根本条件12营养物细胞培养基：培养基中含有细胞增殖和生长所需要的各种物质。常用培养基：MEM、M199、L-15等动物细胞离体培养常常需要血清。血清提供生长必需因子，如激素、微量元素、矿物质和脂肪。小牛血清；胎牛血清。鱼类细胞培养的根本条件42营养物鱼类细胞培养的根本条件13支持物大多数动物细胞有贴壁生长的习惯。离体培养常用玻璃或塑料培养瓶等作为支持物。气体交换CO2培养箱,调节CO2的比例为5%。去离子水/三次蒸馏水鱼类细胞培养的根本条件43支持物鱼类细胞培养的根本条件14无菌条件体外细胞培养仅仅是对所需的细胞进展培养，但环境中〔如空气〕有各种其他微生物，必须对所需细胞进展无杂菌的隔离培养。无菌条件是细胞离体培养最根本的条件。

鱼类细胞培养的根本条件超净工作台44无菌条件鱼类细胞培养的根本条件超净工作台15实验室仪器设备实验室条件：枯燥、紫外灯仪器设备：高压灭菌锅:用于高压灭菌枯燥箱:用于枯燥超净工作台:用于无菌操作玻璃三蒸水器:用于制三蒸馏水恒温生化培养箱:用于恒温培养细胞倒置生物显微镜:用于观察细胞生长液氮罐：用于细胞长期保存45实验室仪器设备实验室条件：枯燥、紫外灯16考核方法实验报告〔论文格式〕一.目的与意义二.材料与方法三.实验结果四.讨论〔问题\经历\体会〕要求：多查阅参考文献，实验中胆大心细。46考核方法实验报告〔论文格式〕17修读要求1．无菌操作，严格标准操作；2．实验是连续性的，需要每天来观察和处理细胞；3.每天来做实验的时间与教师和研究生协商，各组时间要相对集中和固定。47修读要求1．无菌操作，严格标准操作；18实验一&二思考题培养基过滤后需要加哪些物质？为什么？为什么胰蛋白酶和培养基要过滤灭菌，不能高压灭菌？生长培养基的pH值应为多少？呈什么颜色？为什么？为什么要培养基中需参加L-谷氨酰胺？为什么复苏细胞时，要迅速解冻？48实验一&二思考题培养基过滤后需要加哪些物质？为什么？19实验五染色体制备每一物种的细胞一般都具有一定数目、形状和大小的染色体。在秋水仙素的作用下可使分裂细胞阻断在中期，此时染色体形态最典型，然后通过低渗、固定、染色等步骤，便可在显微镜下呈现出其形态。49实验五染色体制备每一物种的细胞一般都具有一定数目、形状和大一、准备细胞接种细胞：T75cm2瓶子1个培养24h换10mL新鲜medium和0.1mL秋水仙素〔1μg/L〕培养13-15h消化细胞，1000rpm离心，5分钟，收集沉淀细胞加2mLPBS混匀细胞将细胞悬液移到T75cm2的培养瓶内操作步骤50一、准备细胞操作步骤21慢慢加10mL双蒸水〔4℃〕室温孵育10min慢慢加10mL现配的GAA固定液〔冰醋酸：甲醇＝1：3〕室温放置10min移到一个离心管，1000rpm离心，10min弃去上清，留约2mL加3mL新鲜固定液，轻轻混匀细胞1000rpm离心，5min弃去上清，留约0.5mL51慢慢加10mL双蒸水〔4℃〕22加0.5mL新鲜固定液，轻轻混匀细胞，然后加4mL新鲜固定液，轻轻混匀孵育5分钟1000rpm离心，5分钟弃去4.8mL上清，仅留0.2mL加1-1.5mL新鲜固定液，轻轻混匀细胞沉淀二、清洁玻片6-8个干净的玻片，浸泡在95%乙醇里烘干浸泡在冰水里至少30min52加0.5mL新鲜固定液，轻轻混匀细胞，然后加4mL新鲜固定三、准备玻片和染色用滴管吸取来自于步骤1-21的细胞悬液0.2mL滴在湿玻片上火焰上拖动，固定2-3次放在预热的切片烘干机上，15min〔蒸发液体〕把装有1NHCl的染色缸，浸入60℃水浴中加热，把玻片插入培育10min倾去HCl溶液用双蒸水清洗玻片2次空气枯燥53三、准备玻片和染色24将玻片浸入装有Giemsa溶液的染色缸中〔现稀释的1：25〕孵育15min用双蒸水冲洗玻片2-3次，除去残液空气枯燥显微镜下观察计数54将玻片浸入装有Giemsa溶液的染色缸中〔现稀释的1：25〕实验六细胞冻存细胞冻存是细胞保存的主要方法之一。利用冻存技术将细胞置于-196℃液氮中低温保存，可以使细胞暂时脱离生长状态而将其细胞特性保存起来，这样在需要的时候