基因工程第三篇分子克隆载体课件

第三章

分子克隆载体（Molecularcloningvectors）

周毅峰2013春第三章

分子克隆载体（Molecularcloning在基因工程中，通常是把外源DNA片断利用运载工具送入生物细胞。携带外源基因进入受体细胞的这种工具叫做载体(Vector)。载体(Vector)载体的本质是DNA。经过人工构建的载体，不但能与外源基因相连接，导入受体细胞，还能利用本身的调控系统，使外源基因在新细胞中复制以致功能的表达。2012年3月基因工程中－GeneEngineering第三章分子克隆载体在基因工程中，通常是把外源DNA片断利用运载工具送入生物2012年3月基因工程中－GeneEngineering第三章分子克隆载体2012年3月基因工程中－GeneEngineering基因工程中常用的主要载体质粒(Plasmid)，主要指人工构建的质粒噬菌体载体

柯斯质粒(cosmid)单链DNA噬菌体M13动物病毒人工染色体(artificialchromosome)2012年3月基因工程中－GeneEngineering第三章分子克隆载体基因工程中常用的主要载体质粒(Plasmid)，主要指人工构载体的功能及特征载体的功能运送外源基因高效转入受体细胞为外源基因提供复制能力或整合能力为外源基因的扩增或表达提供必要的条件2012年3月基因工程中－GeneEngineering第三章分子克隆载体载体的功能及特征载体的功能运送外源基因高效转入受体细胞为外源载体应具备的条件具有针对受体细胞的亲缘性或亲和性（可转移性）

具有合适的筛选标记具有较高的外源DNA的载装能力具有多种单一的核酸内切酶识别切割位点具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点2012年3月基因工程中－GeneEngineering第三章分子克隆载体载体应具备的条件具有针对受体细胞的亲缘性或亲和性（可转移性）pBR3224363bp2012年3月基因工程中－GeneEngineering第三章分子克隆载体pBR3224363bp2012年3月基因工程中－Gene

克隆载体（cloningvector）对目的基因克隆，建立DNA文库和cDNA文库，其上有复制子即可按功能分类表达载体（expressionvector）使目的基因在宿主细胞中表达，既有复制子，又有强启动子穿梭载体（shuttlevector）可以在原核细胞中复制，也可在真核细胞中扩增和表达。2012年3月基因工程中－GeneEngineering第三章分子克隆载体克隆载体对目的基因克隆，建立DNA文库和cDNA文库，其上第一节质粒（Plasmid）质粒是一种独立于染色体外的小分子环状DNA，一般大小约106~108D，可自身复制和表达。2012年3月基因工程中－GeneEngineering第三章分子克隆载体第一节质粒（Plasmid）质粒是一种独立于染色体外2012年3月基因工程中－GeneEngineering第三章分子克隆载体2012年3月基因工程中－GeneEngineering基因克隆载体的质粒DNA分子，必定包括：复制基因、选择性记、克隆位点。

2012年3月基因工程中－GeneEngineering第三章分子克隆载体基因克隆载体的质粒DNA分子，必定包括：复制基因、选择性记、1质粒的基本特性2质粒DNA的分离纯化4重要的大肠杆菌质粒载体

3质粒载体的构建及类型

2012年3月基因工程中－GeneEngineering第三章分子克隆载体1质粒的基本特性2质粒DNA的分离纯化4重要的大肠杆1.1质粒DNA的构型两条多核苷酸链均保持着完整的环形结构，称为共价闭合环形DNA（cccDNA），通常呈现超螺旋的SC构型

只有一条DNA链出现有一至数个缺口，称为开环DNA（ocDNA），此即OC构型

线性分子DNA（IDNA），称为L构型

1质粒的基本特性

2012年3月基因工程中－GeneEngineering第三章分子克隆载体1.1质粒DNA的构型两条多核苷酸链均保持着完整的环形结2012年3月基因工程中－GeneEngineering第三章分子克隆载体2012年3月基因工程中－GeneEngineering1.2质粒DNA分子大小质粒宿主分子大小/kbpPbs蓝藻1.5ColE1大肠杆菌6.4ColV2大肠杆菌140Ti致癌农杆菌330左右PV21三叶草根瘤菌700F大肠杆菌942012年3月基因工程中－GeneEngineering第三章分子克隆载体1.2质粒DNA分子大小质粒宿主分子大小/kbpPbs蓝藻1.3质粒的自主复制性质粒能利用寄主细胞的DNA复制系统进行自主复制质粒DNA上的复制子结构决定了质粒与寄主的对应关系根据在每个细胞中的分子数（拷贝数）的多少，质粒可分为两大复制类型：严紧型质粒（stringentplasmid）

在宿主细胞中拷贝数少的质粒，1－数个拷贝松弛型质粒（relaxedplasmid）在宿主细胞中拷贝数多的质粒，10个拷贝以上2012年3月基因工程中－GeneEngineering第三章分子克隆载体1.3质粒的自主复制性质粒能利用寄主细胞的DNA复制系统进低或单拷贝质粒的复制必需由复制子本身编码一个必不可少的顺式作用蛋白(repA)来对复制起点作正调控作用，如psc101等，同时其复制受宿主蛋白合成的影响。所以这些质粒的拷贝数不能通过诸如氯霉素等蛋白质合成抑制剂来增加拷贝数1）松弛复制型多拷贝质粒（pMB1或ColE1等）的复制不受宿主菌蛋白合成的影响的影响；当蛋白质合成不能进行时，复制依然进行2)严紧型复制2012年3月基因工程中－GeneEngineering第三章分子克隆载体低或单拷贝质粒的复制必需由复制子本身编码一个必不可少的顺式作Howmanycopiescanbereplicated?2012年3月基因工程中－GeneEngineering第三章分子克隆载体HowmanycopiescanbereplicaNegativecontrolpositivecontrol

answers

Repressormodel:copfactorAntisenseRNAmodel:RNAⅠRNAⅡRepproteinpMBl/colEl复制子pSC101复制子2012年3月基因工程中－GeneEngineering第三章分子克隆载体NegativecontrolpositivecontrRNAⅠ和RNAⅡ复制copies的调节RNAⅡ由ori上游的－550到下游的＋200转录出约为750nt的RNARNAⅠ由RNAⅡ基因反义链编码的108nt的RNA，与RNAⅡ互补①控制复制引物与模板的结合2012年3月基因工程中－GeneEngineering第三章分子克隆载体RNAⅠ和RNAⅡ复制copies的调节RNAⅡ由ori上游RNAⅡ在RNaseH的作用下加工成550nt的成熟引物，起始复制RNAⅡ5′端产生一个富含G的环与ori上游20bp处的富含C区互补0-5550

RNA-2

RnaseHOH

RNA-2DNA/RNAprimerforDNAreplication

+1502012年3月基因工程中－GeneEngineering第三章分子克隆载体RNAⅡ在RNaseH的作用下加工成550nt的成熟引物，起此处复杂的RNA二级结构的正确折叠是复制起始的关键2012年3月基因工程中－GeneEngineering第三章分子克隆载体此处复杂的RNA二级结构的正确折叠是复制起始的关键2012年RNA-Ⅰ108bp

RNaseH不能识别RNA-2,不能形成primer的3’-OH-555

-4450RNA-ⅡRNA-ⅠRNA-Ⅱ

108bpD.S.RNARNAⅠ与RNAⅡ互补后，不能起动复制质粒复制依赖于宿主酶活性，一旦开始复制则不能自主控制自制速度和进程，故必须在复制启动前或启动时由RNAⅠ来控制2012年3月基因工程中－GeneEngineering第三章分子克隆载体RNA-Ⅰ108bpRNaseH不能识别RNA-2,RNA-10

WhenRNA-2200-360Nt

Romgeneexpression,RNA-Ⅰ/RNA-ⅡD.S.repression

RNA-Ⅰ/RNA-Ⅱ

不能形成primer的

3’-OH促进

限制

63aaROP(Romprotein)

RNA-Ⅱ只能转录到100-220base,不能到达“0”原点

不能形成primer的3’-OH02012年3月基因工程中－GeneEngineering第三章分子克隆载体RNA-1RNAⅠ和RNAⅡ之间“亲吻复合物”的放大。由RNAI和RNAⅡ形成稳定的复合物通过抑制RNAⅡ与DNA稳定杂交体的形成而阻止DNA合成。与Rom/Rop二聚体蛋白结合，使RNAI与RNAll形成稳定的“亲吻”复合物。Rom－RNAⅠmodulator(调节器)Rop－repressorofprimer2012年3月基因工程中－GeneEngineering第三章分子克隆载体RNAⅠ和RNAⅡ之间“亲吻复合物”的放大。与Rom/RopPcopcopP/OrepreporiCopRep②控制复制起始因子与复制起始位点（ori）的结合2012年3月基因工程中－GeneEngineering第三章分子克隆载体PcopcopP/OrepreporiCopRep②控制复质粒载体及其拷贝数质粒复制子拷贝数pBR322及其衍生质粒pMB115～20pUC系列质粒及其衍生质粒突变的pMB1500～700pACYC及其衍生质粒p15A10～212pSC101及其衍生质粒pSC101～5ColE1ColE115～202012年3月基因工程中－GeneEngineering第三章分子克隆载体质粒载体及其拷贝数质粒复制子拷贝数pBR322及其衍2012年3月基因工程中－GeneEngineering第三章分子克隆载体2012年3月基因工程中－GeneEngineering

两个质粒在同一宿主中不能共存的现象称质粒的不相容性，它是指在第二个质粒导入后，在不涉及DNA限制系统时出现的现象。不相容的质粒一般都利用同一复制系统，从而导致不能共存于同一宿主中。1.4质粒的不相容性2012年3月基因工程中－GeneEngineering第三章分子克隆载体

两个质粒在同一宿主中不能共存的现象称质粒的不相容性不相容性的质粒组成不相容性群以大肠杆菌的质粒为例：ColE1、pMB1拥有相似的复制子结构，彼此不相容pSC101、F、RP4拥有相似的复制子结构，彼此不相容p15A及其衍生质粒拥有相似的复制子结构，彼此不相容2012年3月基因工程中－GeneEngineering第三章分子克隆载体不相容性的质粒组成不相容性群以大肠杆菌的质粒为例：ColE1质粒的不相容性：分子机制两种含有相似复制子结构的不同质粒，在复制时受到同一种拷贝数控制系统的干扰，致使两种质粒的最终拷贝数不同，两种含有不同复制子结构的不同质粒，在复制时各受自己的拷贝数控制系统的调节，致使两种质粒的最终拷贝数恒定，因此在经过若干复制周期和细胞分裂周期后仍能共处于同一细胞内其中拷贝数多的质粒在以后的细胞分裂周期中更具优势2012年3月基因工程中－GeneEngineering第三章分子克隆载体质粒的不相容性：分子机制两种含有相似复制子结构的不同质粒，在1.5质粒DNA的转移G－细菌质粒接合型的质粒（conjugativeplasmid）非接合型的质粒（non-conjugativeplasmid）接合型质粒

能在天然条件下自发地从一个细胞转移到另一个细胞（接合作用），如F、Col、R质粒等如Col、R的其它成员非接合型质粒

不能在天然条件下独立地发生接合作用2012年3月基因工程中－GeneEngineering第三章分子克隆载体1.5质粒DNA的转移G－细菌质粒接合型的质粒（conjF质粒大肠杆菌的某些品系的雄性或供体是被一个致育因子（fertilityfactor）或性因子（sexfactor）决定的F因子，具有这种因子的能育品系记为F＋，相当于雄性。不含这种致育因子F的品系记为F－，相当于雌性。F+细胞的F因子通过接合管向F－细胞转递使F－变成F＋，F因子还可改变细胞表面的构造，以防F＋细胞间的接合。2012年3月基因工程中－GeneEngineering第三章分子克隆载体F质粒大肠杆菌的某些品系的雄性或供体是被一个致育因子（fer

R质粒也称抗药性因子。R质粒编码一种或数种抗菌素抗性基因，此种抗性通常能转移到缺乏该质粒的受体细胞，使后者也获得同样的抗菌素抗性能力2012年3月基因工程中－GeneEngineering第三章分子克隆载体

R质粒2012年3月基因工程中－GeneEnginee

Col质粒：此类质粒编码有控制大肠杆菌素合成的基因，即所谓产生大肠杆菌素因子。大肠杆菌素是一种毒性蛋白，它可以使不带Col质粒的亲缘关系密切的细菌菌株致死。2012年3月基因工程中－GeneEngineering第三章分子克隆载体

Col质粒：2012年3月基因工程中－GeneEngi1.6携带特殊的遗传标记野生型的质粒DNA上往往携带一个或多个遗传标记基因，这使得寄主生物产生正常生长非必需的附加性状，包括：物质抗性抗生素、重金属离子、毒性阴离子、有机物物质合成抗生素、细菌毒素、有机碱这些标记基因对DNA重组分子的筛选具有重要意义2012年3月基因工程中－GeneEngineering第三章分子克隆载体1.6携带特殊的遗传标记野生型的质粒DNA上往往携带一个按其用途可将标记基因分为选择标记基因筛选标记基因用于鉴别目标DNA（载体）的存在，将成功转化了载体的宿主挑选出来可用于将特殊表型的重组子挑选出来。2012年3月基因工程中－GeneEngineering第三章分子克隆载体按其用途可将标记基因分为选择标记基因筛选标记基因用于鉴别目标1.6.1选择标记氨苄青霉素抗性基因（Ampicillinresistancegene,ampr）四环素抗性基因（Tetracyclineresistancegene,tetr）氯霉素抗性基因（chloramphenicolresistancegene,Cmr,cat）卡那霉素和新霉素抗性基因（kanamycin/neomycinresistancegene,kanr,neor）琥珀突变抑制基因supF蔗糖致死基因

SacB

2012年3月基因工程中－GeneEngineering第三章分子克隆载体1.6.1选择标记氨苄青霉素抗性基因（Ampicillin①氨苄青霉素抗性基因（Ampicillinresistancegene,ampr）氨苄青霉素抗性基因是基因操作中使用最广泛的选择标记，绝大多数在大肠杆菌中克隆的质粒载体带有该基因。青霉素可抑制细胞壁肽聚糖的合成，与有关的酶结合并抑制其活性，抑制转肽反应。2012年3月基因工程中－GeneEngineering第三章分子克隆载体①氨苄青霉素抗性基因氨苄青霉素抗性基因是基因操作中使用最四环素可与核糖体30S亚基的一种蛋白质结合，从而抑制核糖体的转位。四环素抗性基因编码一个由399个氨基酸组成的膜结合蛋白，可阻止四环素进入细胞。pBR322质粒除了带有氨苄青霉素抗性基因外，还带有四环素抗性基因。②四环素抗性基因（Tetracyclineresistancegene,tetr）2012年3月基因工程中－GeneEngineering第三章分子克隆载体四环素可与核糖体30S亚基的一种蛋白质结合，从而抑制核糖③氯霉素抗性基因（chloramphenicolresistancegene,Cmr,cat）

氯霉素可与核糖体50S亚基结合并抑制蛋白质合成。目前使用的氯霉素抗性基因来源于转导性P1噬菌体（也携带Tn9）。cat基因编码氯霉素乙酰转移酶，一个四聚体细胞质蛋白（每个亚基23kDa）。在乙酰辅酶A存在的条件下，该蛋白催化氯霉素形成氯霉素羟乙酰氧基衍生物，使之不能与核糖体结合。2012年3月基因工程中－GeneEngineering第三章分子克隆载体③氯霉素抗性基因

氯霉素可与核糖体50S亚基结合并抑④卡那霉素和新霉素抗性基因（kanamycin/neomycinresistancegene,kanr,neor）卡那霉素和新霉素是一种脱氧链霉胺氮基糖苷，都可与核糖体结合并抑制蛋白质合成。卡那霉素和新霉素抗性基因实际就是一种编码氨基糖苷磷酸转移酶（APH（3'）-Ⅱ,25kDa）的基因，氨基糖苷磷酸转移酶可使这两种抗生素磷酸化，从而干扰了它们向细胞内的主动转移。在细胞中合成的这种酶可以分泌至外周质腔，保护宿主不受这些抗生素的影响。2012年3月基因工程中－GeneEngineering第三章分子克隆载体④卡那霉素和新霉素抗性基因卡那霉素和新霉素是一种脱氧链霉kanamycin/neomycinresistancegene,kanr,neor2012年3月基因工程中－GeneEngineering第三章分子克隆载体kanamycin/neomycinresistance在基因的编码区中，若某个密码子发生突变后变成终止密码子，则称这样的突变为赭石突变（突变为UAA），或琥珀突变（突变为UAG），或乳白突变（突变为UGA）。

supF基因编码细菌的抑制性tRNA，可在UAG密码子上编译酪氨酸。⑤琥珀突变抑制基因supF如果在某一宿主中含具琥珀突变的tetr基因和ampr基因，只有当宿主含有supF基因时才会对Amp和Tet具有抗性。supE基因在UAG密码子上编译谷氨酰氨。2012年3月基因工程中－GeneEngineering第三章分子克隆载体在基因的编码区中，若某个密码子发生突变后变成终止密码子，则称来自淀粉水解芽胞杆菌（Bacillusamyloliquefa-ciens），编码果聚糖蔗糖酶。在含蔗糖的培养基上sacB基因的表达对大肠杆菌来说是致死的，因此该基因可用于插入失活筛选重组子。⑥蔗糖致死基因SacB2012年3月基因工程中－GeneEngineering第三章分子克隆载体来自淀粉水解芽胞杆菌（Bacillusamyloliqu1.6.2筛选标记基因筛选标记主要用来区别重组质粒与非重组质粒当一个外源DNA片段插入到一个质粒载体上时，可通过该标记来筛选插入了外源片段的质粒，即重组质粒。

2012年3月基因工程中－GeneEngineering第三章分子克隆载体1.6.2筛选标记基因筛选标记主要用来区别重组质粒与非重乳糖操纵子（lacoperon）大肠杆菌的乳糖lac操纵子中的lacZ基因编码β-半乳糖苷酶（β-galactosidase），如果lacZ基因发生突变，则不能合成有活性的β-半乳糖苷酶。①α-互补（α-complementation）2012年3月基因工程中－GeneEngineering第三章分子克隆载体乳糖操纵子（lacoperon）大肠杆菌的乳糖lac操lacZ′：只编码N-端140个氨基酸的lacZ基因，其产物也没有酶学活性。lacZ△M15基因是缺失了编码β-半乳糖苷酶中第11-41个氨基酸的lacZ基因，无酶学活性。当这两个无酶学活性的产物混合在一起时，可恢复β-半乳糖苷酶的活性，实现基因内互补。2012年3月基因工程中－GeneEngineering第三章分子克隆载体lacZ′：只编码N-端140个氨基酸的lacZ基在lacZ′编码区上游插入一小段DNA片段（如51个碱基对的多克隆位点），不影响β-半乳糖苷酶的功能内互补。若在该DNA小片段中再插入一个片段，将几乎不可避免地导致产生无α-互补能力的β-半乳糖苷酶片段。利用这一互补性质，可用于筛选在载体上插入了外源片段的重组质粒。2012年3月基因工程中－GeneEngineering第三章分子克隆载体在lacZ′编码区上游插入一小段DNA片段（如51异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）是乳糖的衍生物，可作为lac操纵子的诱导物，但不能作为反应的底物；2012年3月基因工程中－GeneEngineering第三章分子克隆载体异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）是乳糖的衍生物，可乳糖既是lac操纵子的诱导物，也是作用的底物，乳糖及其衍生物可诱导lacZ表达。2012年3月基因工程中－GeneEngineering第三章分子克隆载体乳糖既是lac操纵子的诱导物，也是作用的底物，乳糖及其衍5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷（X-gal）可作为lac操纵子的底物，但不能作为诱导物。底物X-gal还可充作生色剂，被β-半乳糖苷酶分解后可产生兰色产物，可使菌落或噬菌斑呈兰色。2012年3月基因工程中－GeneEngineering第三章分子克隆载体5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷（X-gal）可α-互补：载体带有一个来自大肠杆菌的lac操纵子的DNA区段，该区段编码β

–半乳糖苷酶（β-galactosidase，由1024个氨基酸组成）N端的一个片段。IPTG诱导该片段的合成，而该片段能与宿主细胞所编码的缺陷型β

–半乳糖苷酶实现基因内互补（α-互补）。2012年3月基因工程中－GeneEngineering第三章分子克隆载体α-互补：载体带有一个来自大肠杆菌的lac操纵子的DNA区段2012年3月基因工程中－GeneEngineering第三章分子克隆载体2012年3月基因工程中－GeneEngineering2012年3月基因工程中－GeneEngineering第三章分子克隆载体2012年3月基因工程中－GeneEngineering②插入失活(insertionalinactivation)外源DNA的插入而导致基因失活的现象，称为插入失活(insertionalinactivation)。插入失活常被用于检测含有外源DNA的重组体，例如若在质粒pBR322的BamHI的位点插入外源DNA，然后转化大肠杆菌(Tets、Amps)。2012年3月基因工程中－GeneEngineering第三章分子克隆载体②插入失活(insertionalinactivat有重组质粒(即带有外源DNA的质粒)的宿主细胞失去对四环素的抗性，所以不能在含有四环素培养基的平板上生长，但仍能在含有氨苄青霉素培养基的平板上生长。而那些含有不带外源基因的质粒的宿主细胞，则可以在含有四环素或氨苄青霉素培养基的平板上生长，这样就很容易筛选到含有目的基因的细菌，从而淘汰不含目的基因的细菌。

2012年3月基因工程中－GeneEngineering第三章分子克隆载体有重组质粒(即带有外源DNA的质粒)的宿主细胞失去对四环素的2质粒DNA的分离纯化实验室一般使用下列三种方法制备质粒DNA：氯化铯密度梯度离心法质粒DNA纯度高、周期长、设备要求高、溴乙锭污染碱溶法质粒DNA纯度底、快速、操作简便沸水浴法质粒DNA纯度、操作周期介于氯化铯法和碱溶法之间2质粒DNA的分离纯化实验室一般使用下列三种方法制备质粒D质粒DNA的分离纯化氯化铯密度梯度离心法：用含有EDTA的缓冲液悬浮菌体加溶菌酶裂解细菌细胞壁加CsCl和溴乙锭超速离心过夜在紫外灯下吸取cccDNA稀释沉淀cccDNAproteinsocDNAL-DNAcccDNARNAs质粒DNA的分离纯化氯化铯密度梯度离心法：用含有EDTA的质粒DNA的分离纯化碱溶法：用含有EDTA的缓冲液悬浮菌体加溶菌酶裂解细菌细胞壁加NaOH和SDS的混合溶液，去膜释放内含物加高浓度的醋酸钾溶液，沉淀染色体，去除染色体DNA及大部分蛋白质离心取上清液，用苯酚-氯仿萃取，去除痕量的蛋白质乙醇或异丙醇沉淀水相质粒DNA用无DNase的RNase去除残余的RNAcccDNAL-DNAocDNAD-DNAT-DNA质粒DNA的分离纯化碱溶法：用含有EDTA的缓冲液悬浮菌体质粒DNA的分离纯化沸水浴法：用含有EDTA和TritonX-100的缓冲液悬浮菌体加溶菌酶裂解细菌细胞壁沸水浴40秒钟离心，用无菌牙签挑去沉淀物乙醇或异丙醇沉淀质粒DNA质粒DNA的分离纯化沸水浴法：用含有EDTA和Triton3质粒载体的构建及类型3.1天然质粒用作隆载体的局限性

天然质粒：一般是指那些没有经过以基因克隆为目标的体外修饰改造的质粒。在大肠杆菌中，常见的要用于基因克隆的天然质粒有ColE1、RSF2124和pSC101等2012年3月基因工程中－GeneEngineering第三章分子克隆载体3质粒载体的构建及类型3.1天然质粒用作隆载体的局限性

现行通用的基因克隆载体，绝大多数就是以质粒为基础改建而成的。一般说来，一种理想的用作克隆载体的质粒必须满足如下几个方面的条件：(i)具有复制起点(ii)具有抗菌素抗生基因(iii)具若干限制酶单一识别位点(iv)具有较小的分子量和较高的拷贝数3.2质粒载体必须具备的基本条件2012年3月基因工程中－GeneEngineering第三章分子克隆载体现行通用的基因克隆载体，绝大多数就是以质粒为基础改建而成3.3不同类型的质粒载体高拷贝数的质粒载体适于分离大量的高纯度的克隆基因的DNA片段。如ColE1、pMB1或它们的派生质粒。低拷贝数的质粒载体适合于克隆含量过高对寄主代谢有害的DNA。例如，pLG338、pLG339及pHSG415。2012年3月基因工程中－GeneEngineering第三章分子克隆载体3.3不同类型的质粒载体高拷贝数的质粒载体适于分离大量失控的质粒载体失控的质粒载体（runawayplasmidvectors）：是一些低拷贝的质粒，其复制控制是温度敏感型的，也就是说在不同的温度下，拷贝数会有显著的变化。B.E.Uhlin等人（1979）首先发展了失控的质粒载体pBEU1和Pbeu2。2012年3月基因工程中－GeneEngineering第三章分子克隆载体失控的质粒载体失控的质粒载体（runawayplasmi插入失活型的质粒载体选用插入失活型质粒，将外源DNA片段插入在会导致选择记号基因（如tetr、ampr、cmlr等）失活的位点，就有可能通过抗菌素抗性的筛选，大幅度地提高获得阳性克隆的几率。正选择的质粒载体正选择质粒载体（directselectionvectors）：这种质粒载体具有直接选择记号并赋予寄主细胞相应的表型。通过选择具这种表型特征的转化子，便可大大降低需要筛选的转化子的数量，从而减轻了实验的工作量，提高了选择的敏感性。2012年3月基因工程中－GeneEngineering第三章分子克隆载体插入失活型的质粒载体选用插入失活型质粒，将外源DNA片段插表达型的质粒载体

使克隆在大肠杆菌中特定位点的外源真核基因的编码序列置于大肠杆菌的转录-转译信号控制之下，并能在大肠杆菌细胞中正常转录并转译成相应蛋白质的克隆载体特称为表达载体（expressionvectors）。它分为表达型质粒载体和表达型噬菌体载体两种不同的类型。2012年3月基因工程中－GeneEngineering第三章分子克隆载体表达型的质粒载体使克隆在大肠杆菌中特定位点的外源真核基4.1pBR322质粒载体

①pBR322质粒载体的构建(p93)由F.Bliver和R.L.Rodriguez构建4重要的大肠杆菌质粒载体

2012年3月基因工程中－GeneEngineering第三章分子克隆载体4.1pBR322质粒载体①pBR322质粒载体的构建2012年3月基因工程中－GeneEngineering第三章分子克隆载体2012年3月基因工程中－GeneEngineeringpBR322质粒的三个不同来源的组成部分②pBR322质粒载体的优点pSF2124质粒易位子Tn3的氨苄青霉素抗性基因（ampr）pSC101质粒的四环素抗性基因（tetr）ColE1的派生质粒pMB1的DNA复制起点（ori）2012年3月基因工程中－GeneEngineering第三章分子克隆载体pBR322质粒的三个不同来源的组成部分②pBR322质粒pBR322质粒载体优点主要表现在以下几个方面：具有较小的分子量，pBR322质粒DNA分子为4363bp。具有两种抗菌素抗性基因可供作转化子的选择记号。具有较高的拷贝数，而且经过氯霉素扩增之后，每个细胞中可累积1000～3000个拷贝。2012年3月基因工程中－GeneEngineering第三章分子克隆载体pBR322质粒载体优点主要表现在以下几个方面：具有较小的2012年3月基因工程中－GeneEngineering第三章分子克隆载体2012年3月基因工程中－GeneEngineering4.2pUC质粒载体pUC载体是在pBR322质粒载体的基础上，组入了一个在其5′-端带有一段多克隆位点的lacZ′基因，而发展成为具有双功能检测特性的新型质粒载体系列。pUC质粒载体的结构包括pUC7、8、9、12、13、18、19、118、119等（i）来自pBR322质粒的复制起点（ori）；2012年3月基因工程中－GeneEngineering第三章分子克隆载体4.2pUC质粒载体pUC载体是在pBR322质粒载体（ii）氨苄青霉素抗性基因（ampr），但它的DNA核苷酸序列已经发生了变化，不再含有原来的核酸内切限制酶的单识别位点；（iii）大肠杆菌β-半乳糖酶基因（lacZ）的启动子及其编码α-肽链的DNA序列，此结构特称为lacZ′基因；（iv）位于lacZ′基因中的靠近5′-端的一段多克隆位点（MCS）区段，但它并不破坏该基因的功能2012年3月基因工程中－GeneEngineering第三章分子克隆载体（ii）氨苄青霉素抗性基因（ampr），但它的DNA核苷酸序2012年3月基因工程中－GeneEngineering第三章分子克隆载体2012年3月基因工程中－GeneEngineering2012年3月基因工程中－GeneEngineering第三章分子克隆载体2012年3月基因工程中－GeneEngineering（2）pUC质粒载体的优点如pUC8为2750bP，pUC18为2686bP。pUC8质粒平均每个细胞即可达500～700个拷贝。①具有更小的分子量和更高的拷贝数重组体pUC8质粒结构中具有来自大肠杆菌lac操纵子的lacZ′基因，所编码的α-肽链可参与α-互补作用。因此，在应用pUC8质粒为载体的重组实验中，可用X-gal显色的组织化学方法一步实现对重组体转化子克隆的鉴定。②适用于组织化学方法检测2012年3月基因工程中－GeneEngineering第三章分子克隆载体（2）pUC质粒载体的优点如pUC8为2750bP，pUpUC8质粒载体具有与M13mp8噬菌体载体相同的多克隆位点MCS区段，它可以在这两类载体系列之间来回“穿梭”。③具有多克隆位点MCS区段因此，克隆在MCS当中的外源DNΑ片段，可以方便地从pUC8质粒载体转移到M13mp8载体上，进行克隆序列的核着酸测序工作。同时，也正是由于具有MCS序列，可以使具两种不同粘性末端（如EcoRI和BamHI）的外源DNA片段，无需借助其它操作而直接克隆到pUC8质粒载体上。2012年3月基因工程中－GeneEngineering第三章分子克隆载体pUC8质粒载体具有与M13mp8噬菌体载体相同的多克隆位点4.3T载体与TA克隆方法TA克隆方法（OriginalTACloningKit）即利用Taq聚合酶同时具有的末端连接酶的功能，在每条PCR扩增产物的3`端自动添加一个3`-A突出端。T载体：一个线性含3`-T突出端的载体用于直接高效地连接PCR产物。Invitrogen公司TA克隆系统和TopoTA克隆系统2012年3月基因工程中－GeneEngineering第三章分子克隆载体4.3T载体与TA克隆方法TA克隆方法（Original2012年3月基因工程中－GeneEngineering第三章分子克隆载体2012年3月基因工程中－GeneEngineering2012年3月基因工程中－GeneEngineering第三章分子克隆载体2012年3月基因工程中－GeneEngineering2012年3月基因工程中－GeneEngineering第三章分子克隆载体2012年3月基因工程中－GeneEngineering第二节病毒（virus）质粒载体携带的外源基因限于以下构建基因组文库时，目的DNA>>10kb，应采用病毒载体。病毒是一类非细胞微生物，能高效率高特异性地侵染宿主细胞（转导）,然后或自主复制繁殖，或整合入宿主基因组中潜伏起来，而且在一定的条件下上述两种状态还会相互转化。2012年3月基因工程中－GeneEngineering第三章分子克隆载体第二节病毒（virus）质粒载体携带的外源基因限于以下病毒的上述特性使得它们的DNA能被开发成为基因工程的有用载体，因为：高效率的感染性能使外源基因高效导入受体细胞自主复制繁殖性能使外源基因在受体细胞中高效扩增2012年3月基因工程中－GeneEngineering第三章分子克隆载体病毒的上述特性使得它们的DNA能被开发成为基因工程的有用载体大肠杆菌的λ噬菌体DNA衍生的载体黏性质粒载体：含有λ噬菌体DNA的某些位点并被包装而获得的载体M13：小分子的丝状单链噬菌体2012年3月基因工程中－GeneEngineering第三章分子克隆载体大肠杆菌的λ噬菌体DNA衍生的载体黏性质粒载体：含有λ噬1λ噬菌体1.1l噬菌体的生物学特性：生物结构l噬菌体是大肠杆菌的温和型噬菌体l噬菌体由外壳包装蛋白和l-DNA组成

l-DNA全长48502个核苷酸l-DNA上至少有61个基因2012年3月基因工程中－GeneEngineering第三章分子克隆载体1λ噬菌体1.1l噬菌体的生物学特性：生物结构l噬1.1.1l噬菌体基因组结构2012年3月基因工程中－GeneEngineering第三章分子克隆载体1.1.1l噬菌体基因组结构2012年3月基因工程中－GThephagecosends：cos位点（cohesive-endsite，粘性末端位点）

在λ噬菌体线性双链DNA分子的两端，各有一条由12个核苷酸组成的彼此完全互补的5′单链突出序列，即通常所说的粘性末端。Circularform

Linearform

3′-GCCCCGCCGCTGGAGC-5′5′-CGGGGCGGCGACCTCG-3′Cleavage(duringpackaging)Ligation(afterinfection)GGGCGGGCGACCTCG-3′GC-5′5′-CG3′-GCCCCGCCGCTGGA2012年3月基因工程中－GeneEngineering第三章分子克隆载体Thephagecosends：cos位点（co占λ噬菌体DNA

40－50%，裂解生长所必须右臂约为8-10kb，从PR启动子到右侧cos位点。

左臂约20kb，从基因A至基因J的区域，含有编码噬菌体头部和尾部蛋白的基因噬菌体基因组至少可编码50个基因，它们的分布和排列与其功能有一定关系。根据执行功能可将基因组分为三个区。RightarmLeftarm2012年3月基因工程中－GeneEngineering第三章分子克隆载体占λ噬菌体DNA40－50%，裂解生长所必须右臂约为噬菌体的可取代区（中间区或非必需区）J基因与Cro基因之间的DNA，占λ噬菌体DNA的1/3，主要包含控制λ噬菌体进入溶源状态的调节基因和功能基因。可被ga1基因或bio基因替换，不影响λ

噬菌体裂解生长。Nonessentialregion2012年3月基因工程中－GeneEngineering第三章分子克隆载体噬菌体的可取代区（中间区或非必需区）J基因与CroDNAProteincoatcoscosNonessentialregionLong(left)armshort(right)armExogenousDNA(~20-23kb)12bpλphage2012年3月基因工程中－GeneEngineering第三章分子克隆载体DNAProteincoatcoscosNonessent1.1.2l噬菌体生命周期与溶原状态2012年3月基因工程中－GeneEngineering第三章分子克隆载体1.1.2l噬菌体生命周期与溶原状态2012年3月基因工整合主要由λ-DNA上的cI和int两基因的产物所激活，而这两个基因的开放与关闭又取决于宿主细胞本身的性质。

λ噬菌体感染大肠杆菌后，除能裂解细胞外，也可能将其DNA直接整合到宿主细胞的染色体DNA上，并不产生子代噬菌体颗粒，这种情况为溶原状态。

DNA重组技术一般需要λ噬菌体进入溶菌状态人们可以根据需要改变λ-DNA或宿主细胞的性质，使噬菌体或处于溶菌状态，或处于溶菌状态2012年3月基因工程中－GeneEngineering第三章分子克隆载体整合主要由λ-DNA上的cI和int两基因的产物所激活，而这1.2l噬菌体的选择性标记

lacZ基因也可用于λ噬菌体载体，通过插入或替换载体中的β-半乳糖苷酶基因片段，在IPTG/X-gal平板上可通过噬菌斑的颜色，筛选重组噬菌体。①lacZ基因2012年3月基因工程中－GeneEngineering第三章分子克隆载体1.2l噬菌体的选择性标记

lacZ基因也可用于②cⅠ基因

cⅠ编码的λ抑制子与操纵区OR1和OR2发生亲和作用结合后，激活PRM启动cⅠ表达λ抑制子，结合Cro及下游裂解蛋白基因的表达，抑制裂解生长溶原裂解2012年3月基因工程中－GeneEngineering第三章分子克隆载体②cⅠ基因

cⅠ编码的λ抑制子与操纵区OR1和OR2

hfl-的E.coli中，cⅠ的表达使λ噬菌体进入溶源状态hfl+的E.coli中，λ噬菌体可高效率地进入溶源状态Hfl：高频溶源化，highfrequencyoflysogenization2012年3月基因工程中－GeneEngineering第三章分子克隆载体

hfl-的E.coli中，cⅠ的表达使λ噬

重组子中外源基因插入到cⅠ中，cⅠ不能表达,将高频率地使hfl

-E.coli进入裂解生长状态，长出噬菌斑。在构建基因文库时，可提高排除非重组噬菌体的效率，从而降低对基因文库进行筛选的劳动强度。Someofphageplaque2012年3月基因工程中－GeneEngineering第三章分子克隆载体

重组子中外源基因插入到cⅠ中，cⅠ不能表达,将高频率地使③cⅡ基因在hfl－E.coli中增加基因cⅠ的产物，高效地进入溶源状态cⅡ产物(cⅡ)结合PRE激活cⅠ的表达，生长向溶原方向进行

重组子中外源基因插入到cⅡ中，cⅠ不能表达，将高频率地使hfl

-E.coli进入裂解生长状态，长出噬菌斑。2012年3月基因工程中－GeneEngineering第三章分子克隆载体③cⅡ基因在hfl－E.coli中增加基因cⅠ的产④Spi筛选野生型λ噬菌体在带有P2原噬菌体的溶源性E.coli中的生长会受到限制的表型，称作Spi+，即对P2噬菌体的干扰敏感（sensitivetoP2interference）。Spi+如果λ噬菌体缺少两个参与重组的基因red和gam，同时带有chi位点，并且宿主菌为rec+，则可以在P2溶源性E.coli中生长良好，λ噬菌体的这种表型称作Spi-

。Spi-因此，通过λ噬菌体载体DNA上的red或gam基因的缺失或替换，可在P2噬菌体溶源性细菌中鉴别重组和非重组λ噬菌体。

2012年3月基因工程中－GeneEngineering第三章分子克隆载体④Spi筛选野生型λ噬菌体在带有P2原噬菌体的溶1.3l噬菌体载体构建2012年3月基因工程中－GeneEngineering第三章分子克隆载体1.3l噬菌体载体构建2012年3月基因工程中－Gene野生型λ-DNA包装的上限为51kb，本身长度为48.5kb，只有当插入的外源DNA片段不大于2.5kb时（包装范围为原DNA的75-105%），才能被包装成有感染力的噬菌体颗粒。因此，缩短野生型λ-DNA的长度，可以提高装载量。野生型l-DNA上约有40-50%的片段是复制和裂解所非必需的。根据切除的多少，可将λ-DNA分成两大类载体：插入型载体取代型载体2012年3月基因工程中－GeneEngineering第三章分子克隆载体野生型λ-DNA包装的上限为51kb，本身长度为48.5kb1.3.1插入型载体（insertionvectors）只具有一个可供外源DNA插入的克隆位点。外源的DNA克隆到插入型的λ载体分子上，会使噬菌体的某种生物功能丧失效力，即所谓的插入失活效应。β-半乳糖苷酶失活的（inactlvatlonofE.coliβ-galactosidase）免疫功能失活的（inacti-vatiortofimmunityfunction）2012年3月基因工程中－GeneEngineering第三章分子克隆载体1.3.1插入型载体（insertionvectors）免疫功能失活的（inacti-vatiortofimmunityfunction）基因组中有一段免疫区（cⅠ），有一两种核酸内切限制酶的单切割位点。当外源DNA片段插入到这种位点上，不能进入溶源周期。2012年3月基因工程中－GeneEngineering第三章分子克隆载体免疫功能失活的（inacti-vatiortofimmturbidplaques

clarification

plaques带有外源DNA插入的λ重组体形成清晰的噬菌斑（clarification

plaques）没有外源DNA插入的亲本噬菌体形成混浊的噬菌斑（turbidplaques）2012年3月基因工程中－GeneEngineering第三章分子克隆载体turbidplaquesclarificationpβ-半乳糖苷酶失活的（inactlvatlonofE.coliβ-galactosidase）基因组中lacZ区段，编码着β半乳糖苷酶，由这种载体感染的大肠杆菌lac-指示菌，涂布在补加有IPTG和Xgal的培养基平板上，会形成蓝色的噬菌斑。如果外源DNA插入到lacZ区段上，阻断了β-半乳糖着酶基因lacZ的编码序列，不能合成β-半乳糖昔酶，只能形成无色的噬菌斑。2012年3月基因工程中－GeneEngineering第三章分子克隆载体β-半乳糖苷酶失活的（inactlvatlonofE.c插入型载体只能承受较小分子量（一般在10kb左右）的外源DNA片段的插入，应用于cDNA及小片段DNA的克隆。体外包装插入位点体外包装插入片段载体长度37kb插入片段大小：0-14kb（51–37）2012年3月基因工程中－GeneEngineering第三章分子克隆载体插入型载体只能承受较小分子量（一般在10kb左右）的外源DN具有成对的克隆位点，在这两个位点之间的DNA区段可以被外源插入的DNA片段所取代1.3.2替换型载体（replacementvectors）替换型载体又叫做取代型载体（substitutionvector），是一类在λ噬菌体基础上改建的、在其中央部分有一个可以被外源插入的DNA分子所取代的DNA片段的克隆载体。2012年3月基因工程中－GeneEngineering第三章分子克隆载体具有成对的克隆位点，在这两个位点之间的DNA区段可以被外源插2012年3月基因工程中－GeneEngineering第三章分子克隆载体2012年3月基因工程中－GeneEngineeringλNM781载体中，可取代的EcoRI片段编码有一个supE基因，可抑制寄主细胞lacZ基因的琥珀突变，λNM781感染写宿主后能在乳糖麦康基氏（Macconkey）琼脂培养基上产生出红色的噬菌斑，或是在Xgal琼脂培养基上产生出蓝色的噬菌斑。λNM781如果这个具有supE基因的EcoRI片段被外源DNA取代了，那么所形成的重组体噬菌体，在上述这两种指示培养基上都只能产生出无色的噬菌斑。2012年3月基因工程中－GeneEngineering第三章分子克隆载体λNM781载体中，可取代的EcoRI片段编码有一个supEλNM781感染写宿主后能在乳糖麦康基氏（Macconkey）琼脂培养基上产生红色的噬菌斑重组λNM781感染写宿主后能在乳糖麦康基氏（Macconkey）琼脂培养基上产生无色的噬菌斑2012年3月基因工程中－GeneEngineering第三章分子克隆载体λNM781感染写宿主后能在乳糖麦康基氏（Macconkey对重组体的λDNA分子进行包装和增殖，以得到有感染性的λ重组噬菌体。用替换型载体克隆外源DNA包括三个步骤：应用适当的核酸内切限制酶消化λ载体，除去基因组中可取代的DNA区段DNA臂同外源DNA片段连接。2012年3月基因工程中－GeneEngineering第三章分子克隆载体对重组体的λDNA分子进行包装和增殖，以得到有感染性的λ重替换型载体克隆外源DNA可能出现三种情况2012年3月基因工程中－GeneEngineering第三章分子克隆载体替换型载体克隆外源DNA可能出现三种情况2012年3月基因工替换型载体可承受较大分子量的外源DNA片段的插入，所以适用于克隆高等真核生物的染色体DNA最小装载长度10kb最大装载长度25kb体外包装体外包装插入片段（51–26）载体长度26kb插入片段（36–26）2012年3月基因工程中－GeneEngineering第三章分子克隆载体替换型载体可承受较大分子量的外源DNA片段的插入，所以适用于1.4λ重组体DNA分子的转染作用与体外包装1.4.1λ重组体DNA分子的转染作用用λ重组体DNA分子直接感染大肠杆菌，使之侵入寄主细胞内。这种由寄主细胞捕获裸露的噬菌体DNA的过程叫做转染（transfection）

野生型λDNA典型转染效率为105～106之间体外连接的结果，转染效率便下降到了104～103左右。转染效率：每微克λDNA转染产生的噬菌斑数目λDNA的转染作用，是一种低效的过程。2012年3月基因工程中－GeneEngineering第三章分子克隆载体1.4λ重组体DNA分子的转染作用与体外包装1.4.11.4.2λDNA的体外包装λDNA的体外包装作用，在离体条件下，将重组体DNA包入噬菌体等病毒颗粒中的过程，以形成有功能的病毒载体λ噬菌体的头部和尾部的装配是分开进行的。头部基因发生了突变的噬菌体只能形成尾部，而尾部基因发生了突变的噬菌体则只能形成头部。将这两种不同突变型的噬菌体的提取物混合起来，便能够在体外装配成有生物活性的噬菌体颗粒。2012年3月基因工程中－GeneEngineering第三章分子克隆载体1.4.2λDNA的体外包装λDNA的体外包装作用，在离重组分子尾部基因琥珀突变型Sup-细菌尾部基因提取物头部基因提取物头部基因琥珀突变型完整的噬菌体体外互补作用研究2012年3月基因工程中－GeneEngineering第三章分子克隆载体重组分子尾部基因Sup-细菌尾部基因头部基因头部基因完整的噬1.4.3λ噬菌体DNA的包装限制问题上限不得超过其正常野生型DNA总量的5％左右λ噬菌体头部外壳蛋白质容纳DNA的能力是有一定限度的。下限不得少于正常野生型DNA总量的75％λ噬菌体的包装上限是51kb。编码必要基因的DNA区段占28kb因此，λ载体克隆外源DNA的理论极限值应是23kb按野生型λDNA分子长度为48kb计算2012年3月基因工程中－GeneEngineering第三章分子克隆载体1.4.3λ噬菌体DNA的包装限制问题上限不得超过其正常gateway2012年3月基因工程中－GeneEngineering第三章分子克隆载体gateway2012年3月基因工程中－GeneEngin2012年3月基因工程中－GeneEngineering第三章分子克隆载体2012年3月基因工程中－GeneEngineering1.5l-DNA及其重组分子的分离纯化：将大肠杆菌在含有麦芽糖的培养基中培养至对数生长期

加入l噬菌体或重组l噬菌体的悬浮液，37℃培养1小时

用新鲜培养基稀释，继续培养4-12小时。这时噬菌体颗粒

密度已达1013-1014/L，大肠杆菌细胞已完全裂解

超速离心，沉淀噬菌体苯酚抽提，释放l-DNA

乙醇或异丙醇沉淀l-DNA

1.5l-DNA及其重组分子的分离纯化：将大肠杆菌在含有麦1.5l-DNA作为载体的优点：l-DNA可在体外包装成噬菌体颗粒，能高效转染大肠杆菌

l-DNA载体的装载能力为25kb，远远大于质粒的装载量

重组l-DNA分子的筛选较为方便

重组l-DNA分子的提取较为简便

l-DNA载体适合克隆和扩增外源DNA片段，但不适合表达

外源基因1.5l-DNA作为载体的优点：l-DNA可在体外包装成噬3柯斯质粒载体是一类由人工构建的含有λDNA的cos序列和质粒复制子的特殊类型的质粒载体（cosmidvectors）。柯斯质粒（cosmid）1978年，J．Coffins及B．Hohn等人发展出柯斯质粒载体。“cosmid”一词是由英文“cossite-carryingplasmid”缩写而成的，其原意是指带有粘性末端位点（cos）的质粒。2012年3月基因工程中－GeneEngineering第三章分子克隆载体3柯斯质粒载体是一类由人工构建的含有λDNA由于考斯质粒和噬菌粒不再携带包装蛋白基因，因此重组DNA分子在细胞内不能形成噬菌体颗粒1.8kb的l-DNA片段+pBR322片段装载范围为31-45kb2012年3月基因工程中－GeneEngineering第三章分子克隆载体由于考斯质粒和噬菌粒不再携带包装蛋白基因，因此重组DNA分子考斯质粒载体的特点：能像l-DNA那样进行体外包装，并高效转染受体细胞

装载量大（45kb）且克隆片段具有一定的大小范围能像质粒那样在受体细胞中自主复制重组操作简便，筛选容易不能体内包装，不裂解受体细胞考斯质粒载体的特点：能像l-DNA那样进行体外包装，并高效转2012年3月基因工程中－GeneEngineering第三章分子克隆载体2012年3月基因工程中－GeneEngineering柯斯克隆应用柯斯质粒载体，在大肠杆菌细胞中克隆大片段的真核基因组DNA技术，叫做“柯斯克隆”（cosmidcloning）

线性λ噬菌体DNΑ分子末端cos位点，在λ噬菌体的正常生命周期中，会产生由数百个λDNA拷贝组成的多连体分子。末端酶（terminase）或Ter体系：λ噬菌体具有的一种位点特异的切割体系（site-specificcuttingsystem），叫做末端酶（terminase）或Ter体系，能识别两个相距适宜的cos位点，将多连体分子切割成λ单位长度的片段，并将它们包装到λ噬菌体头部中去。2012年3月基因工程中－GeneEngineering第三章分子克隆载体柯斯克隆应用柯斯质粒载体，在大肠杆菌细胞中克隆大片段的真核λDNA分子具有两个cos位点，Ter体系发生作用的条件两个cos位点之间的距离38～54kb2012年3月基因工程中－GeneEngineering第三章分子克隆载体λDNA分子具有两个cos位点，Ter体系发生作用的条件两个2012年3月基因工程中－GeneEngineering第三章分子克隆载体2012年3月基因工程中－GeneEngineering采用柯斯质粒作载体的困难！！①载体自身只相当于可以插入片段的1/10左右，常出现载体与载体连接用碱性磷酸酶处理，可阻止载体分子自身连接②大小不等的外源片段相互连接后插入同一个载体分子选出30～45kb的外源DNA插入载体DNA，每个载体只可能插入一个外源片段如果二个片段，则将超过包装成噬菌体颗粒的限度2012年3月基因工程中－GeneEngineering第三章分子克隆载体采用柯斯质粒作载体的困难！！①载体自身只相当于可以插入片段③细菌的菌落体积远大于噬菌斑，因此如用柯斯质粒制备基因文库，则筛选所需的含某一DNA片段的菌落很费时间。现虽建立了高密度菌落筛选法，但由于柯斯质粒制成的基因文库常常不太稳定，插入的大片段外源DNA有可能通过同宿主基因组交换而致丢失等，所以最常使用的还是噬菌体载体。2012年3月基因工程中－GeneEngineering第三章分子克隆载体③细菌的菌落体积远大于噬菌斑，因此如用柯斯质粒制备基因文库3单链DNA噬菌体载体(M13)M13噬菌体载体是一种含单键（+）DNA（ssDNA）的丝状大肠杆菌噬菌体，其基因组大小为6.4kb。用来获得大量的单链DNA片段，用于测定DNA序列、基因的定点突变研究、异源双链DNA的分析等。2700个外壳蛋白分子2012年3月基因工程中－GeneEngineering第三章分子克隆载体3单链DNA噬菌体载体(M13)M13噬菌体载体是一种含M13噬菌体载体体形图2012年3月基因工程中－GeneEngineering第三章分子克隆载体M13噬菌体载体体形图2012年3月基因工程中－GeneEM13单链DNA噬菌体的生命周期2012年3月基因工程中－GeneEngineering第三章分子克隆载体M13单链DNA噬菌体的生命周期2012年3月基因工程中－GPhageM13replicationinthehostcell:+RNApolDNApolIII±RFNickedbygene2protein+ss-Rollingcirclereplication,thencutandligateCoatedwithgene5proteinGene5proteinisreplacedbygene8proteinect.LinearM13phagereleasedfromthecell.2012年3月基因工程中－GeneEngineering第三章分子克隆载体PhageM13replicationinthehM13DNA载体的构建：IIIVIIIVIIXVVIIIXVIII野生型M13RF-DNAIIIVIIIVIIXVVIIIXVIIIM13mp系列载体lacZ′polylinkerM13DNA载体的构建：IIIVIIM13克隆载体MCS与分子结构图2012年3月基因工程中－GeneEngineering第三章分子克隆载体M13克隆载体MCS与分子结构图2012年3月基因工程中－GM13DNA载体的特点：使克隆的DNA片段以特定单链的形式输出受体细胞外这在DNA定向突变中非常有用M13重组分子筛选简便被M13噬菌体感染的受体细胞生长缓慢，形成混浊斑，易于辨认挑选。而且重组分子越大，混浊斑的混浊度亦越大但M13-DNA载体的最大缺陷是装载量小，只有1.5kbM13DNA载体的特点：使克隆的DNA片段以特定单链的形式第3节植物基因工程载体Ti质粒YEP培养基上的根瘤农杆菌LB培养基上的大肠杆菌第3节植物基因工程载体Ti质粒YEP培养基上的根瘤农杆菌几乎所有的双子叶植物尤其是豆科类植物的根部常常会形成根瘤，这是由于植物根部被一种革兰氏阴性土壤杆菌农杆根瘤菌（A.tumefaciens）感染所致，其致瘤特性是由该菌细胞内的野生型质粒Ti（Tumor-inducing）介导的。Ti质粒的结构与功能2012年3月基因工程中－GeneEngineering第三章分子克隆载体几乎所有的双子叶植物尤其是豆科类植物的根部常2012年3月基因工程中－GeneEngineering第三章分子克隆载体2012年3月基因工程中－GeneEngineeringTi质粒的结构与功能Ti质粒的图谱整个质粒160-240kb其中T-DNA12-24kbtms的编码产物负责：合成吲哚乙酸tmr的编码产物负责：合成植物分裂素tmt的编码产物负责：合成氨基酸衍生物冠瘿碱Ti质粒的结构与功能Ti质粒的图谱整个质粒160-Ti质粒的结构与功能Ti质粒致瘤的分子机制损伤的植物根部会分泌出乙酰丁香酸和羟基乙酰丁香酸，它们能诱导Ti质粒上的vir基因以及根瘤菌染色体上的一个操纵子表达。vir基因产物将Ti质粒上的T-DNA单链切下，而根瘤菌染色体上的操纵子表达产物则与单链T-DNA结合形成复合物，后者转化植物根部细胞。Ti质粒的结构与功能Ti质粒致瘤的分子机制损伤的植物根部Ti质粒的结构与功能T-DNA的染色体整合机制Ti质粒的结构与功能T-DNA的染色体整合机制2012年3月基因工程中－GeneEngineering第三章分子克隆载体2012年3月基因工程中－GeneEngineeringAgrobacteriumtumefaciens,asoil-borneα-proteobacterium,hasthecapacitytotransferDNAfromaresidenttumorinducing(Ti)plasmidintoeukaryoticcellswheretheoncogenictransferredDNA(T-DNA)isintegratedintothehostgenomeandexpressed.ItistheonlyorganismknowntoroutinelyengageinlateralgenetransferbetweenKingdoms,andthemolecularbasisofthistransformationprocesshashadconsiderableimpactonstudiesoflateralD