蛋白质组学proteomicswxj教学课件

蛋白质组学proteomicswxj幻灯片PPT本课件PPT仅供大家学习使用学习完请自行删除，谢谢！本课件PPT仅供大家学习使用学习完请自行删除，谢谢！本课件PPT仅供大家学习使用学习完请自行删除，谢谢！本课件PPT仅供大家学习使用学习完请自行删除，谢谢！蛋白质组学proteomicswxj幻灯片PPT本课Proteome&Proteomics定义Proteome：1994年，由澳大利亚Macguarie大学的Wilkins等首先提出：“蛋白质组指由一个细胞或一个组织的基因组所表达的全部蛋白质”“proteome”是由蛋白质一词的前几个字母“prote”和基因组一词的后几个字母“ome”拼接而成Proteome&Proteomics定义ProteoProteome&Proteomics定义Proteomics：蛋白质组学是从整体水平细胞内蛋白质的组成、结构、功能及其动态变化规律的科学。研究内容包括分析蛋白质组所有组分及它们的表达水平，确定各种组分的空间定位、修饰方法、互作机制、生物活性及相应特定功能等。由此获得蛋白质水平上的关于疾病发生，细胞代谢等过程的整体而全面的认识Proteome&Proteomics定义ProteoGenome&ProteomeGenome&ProteomeGenomicsTranscriptomics&ProteomicsGenomicsTranscriptomics&ProProteomics&StructuralGenomicsProteomics&StructuralGenomiProteomics&FunctionalGenomicsProteomics&FunctionalGenomi特点之一∶整体性特点之一∶整体性特点之二∶系统性特点之二∶系统性特点之三∶动态性特点之三∶动态性StructuralProteomics结构蛋白质组学FunctionalProteomics功能蛋白质组学分类StructuralProteomics分类StructuralProteomicsSeparationIdentificationPTM(post-translationalmodification)IdentificationComparison&SubtractionAnalysisStructuralProteomicsSeparatioFunctionalProteomicsLocalizationProteinComplexDeterminationProtein-ProteinInteraction/InteractionNetworkFunctionofProtein(MetabolicandRegulatoryPathway;SignalTransductionPathway)FunctionalProteomicsLocaliza蛋白质鉴定：可以利用一维电泳和二维电泳并结合生物质谱、Western印迹、蛋白质芯片等技术，对蛋白质进行全面的鉴定研究。翻译后修饰的鉴定：如磷酸化、糖基化、酶原激活等过程。蛋白质功能确定：包括蛋白质定位研究，蛋白质活性，蛋白质相互作用，酶活性和确定酶底物，细胞因子的生物分析，配基-受体结合分析等。蛋白质组学的主要任务蛋白质组学的主要任务蛋白质组学研究思路与方法策略、技术、工具蛋白质组学研究思路与方法策略、技术、工具主要专业术语及其英文对照和缩写IPG-IEF：固相pH梯度等电聚焦（immobilizedpHgradientsisoelectricfocusing）SDS-PAGE：十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（Sodiumdodecylsulfate-polyacrylamidegelelectrophoresis）2-DE：双向电泳(TwoDimensionalElectrophoresis)HPLC：高效液相色谱（HighperformanceLiquidChromatography）MALDI-TOFMS：基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MatrixAssistedLaserDesorption/IonizationTime-of-FlightMassSpectrometry)主要专业术语及其英文对照和缩写IPG-IEF：固相pH梯度等蛋白序列数据库（SWISS-PROT/TrEMBL；http://www.expasy.ch）基因序列数据库（Genbank，/EMBL；http://www.ebi.ac.uk/）蛋白模式数据库（Prosite；http://www.expasy.ch/sprot/prosite.html）蛋白质二维凝胶电泳数据库、蛋白三维结构数据库（PDB，/；FSSP，http://www.embl-ebi.ac.uk）蛋白翻译后修饰数据库（O-GLYCBASE，http://www.cbs.dtu.dk/databases/OGLYCBASE）蛋白质组学研究相关数据库蛋白序列数据库（SWISS-PROT/TrEMBL；http研究策略两条互补的实验流程基于凝胶的工作流程 （Gel-basedworkflow）基于液相色谱的工作流程 （LC-basedworkflow）研究策略两条互补的实验流程ClassicalGE&LCtoProteinIDGapelo(2010)JProteomicsHPLC-MSClassicalGE&LCtoProteinI蛋白质组学proteomicswxj教学课件蛋白质组研究的主要手段双向电泳（twodimensionalgelelectrophoresis,2D-GE）差示电泳（differentialgelelectrophoresis,DIGE

）毛细管电泳

(capillaryelectrophoresis,CE)高效液相色谱

(highperformanceliquidchromatography,HPLC)分子筛柱层析反向柱层析质谱分析(massspectrometryMS)

基质辅助激光解吸离子化-飞行时间串联质谱(matrix-assistedlaserdisorptionionization-timeofflight/tandemMS,MALDI-TOF/MS/MS)

电喷雾离子化串联质谱（electrosprayionizationESI-MS）生物信息学蛋白质组研究的主要手段双向电泳（twodimensiona蛋白质组学实验室所需的条件蛋白质组学实验室所需的条件蛋白质组学研究的基本技术路线蛋白质样品的制备双向电泳或HPLC图像分析凝胶中的蛋白溶液中的蛋白混合肽蛋白质质量N端测序肽序列质谱数据肽指纹图数据搜索新的或已知蛋白翻译后修饰的鉴定酶解蛋白质组学研究的基本技术路线蛋白质样品的制备双向电泳或HPLSampleProteinPreparationUsuallythecomplexityoftheproteinand/orpeptidemixtureliesbeyondthetheoreticalseparationspaceofanyseparationmethod.ProteomeComplexity.

Genomictranscriptionindiversity;post-transcriptionprocessing;post-translationalmodification;constitutionofcombinatorialcomplex.Itrequiresquitealongtimeforanalysisofproteincomplex.Samplerecoverylowthroughseparation:moresteps,lessoverallrecovery.Theconc.oftheproteinswitharangeof6-ordermagnitude:intissues,proteinconcentrationsspanadynamicrangeofsixordersofmagnitudes(forregulatoryproteinorTFsafewmoleculespercell,forhousekeepingproteinsmillioncopiespercell).So,itisdifficulttodetectverylowconcentratedproteinsinthepresenceofhighlyabundantproteins.Thecomplexproteinsampleswithlimitedstabilityduetoexistenceofenzymesandproteases,enzymeinhibitorscanonlypartlystabilizethesample.SampleProteinPreparationUsuaManyparametersinfluencethecompositionofproteomebetweeninducedandinherentbiologicalvariations,suchasgeneticdifferences,genderandageofpatientsandcellgrowthconditions.Thisrequiressamplereplicates.(statisticianswoulddemandatleastfivereplicates,inmanycasesthreereplicatescandeliverhighlyconfidentresults.Inclinicalthenumberofrequiredproteinsaremuchhigh).Membraneproteinsareverydifficulttosolubilize,andeasytolossduringsamplepreparationandseparationbystickingtoasurfaceoraggregation.Post-translationalmodifications(PTMs)likephosphorylationandglycosylationrequiresophisticatedanalysistoolslikeMSn,wherethepeptideionsgeneratedseveraltimesfragmented.SampleProteinPreparationManyparametersinfluencethe蛋白质组研究的基本技术样品预分离样品的制备（预处理）：组织细胞细胞器（线粒体、叶绿体、细胞核）蛋白质组研究的基本技术样品预分离样品的制备（预处理）蛋白质组研究的基本技术蛋白提取重要性：在制备时丢失的蛋白永远不能在后面实验中弥补原则：使所有待分析的蛋白样品全部处于溶解状态防止样品在聚焦时发生蛋白的聚集和沉淀防止在样品制备过程中发生样品的抽提后化学修饰（如酶性或化学性降解等）完全去除样品中的核酸和某些干扰蛋白蛋白质组研究的基本技术蛋白提取重要性：蛋白质组研究的基本技术蛋白提取步骤：破碎沉淀蛋白去除杂质蛋白质组研究的基本技术蛋白提取步骤：蛋白质组研究的基本技术蛋白提取样品制备流程破碎

尽可能减少蛋白水解/其它形式蛋白降解原则机械法（超声波法、高压法、机械匀浆法）化学法（去污剂法、酶裂解法）物理法（液氮研磨法、反复冻融法、渗透 法、玻璃珠破碎法）蛋白质组研究的基本技术蛋白提取样品制备流程蛋白质组研究的基本技术蛋白提取样品制备流程沉淀蛋白

去杂浓缩后蛋白可溶性是关键

三氯醋酸（TCA）-丙酮沉淀法

TCA沉淀法–引起降解/修饰丙酮沉淀法硫酸铵沉淀法–影响IEF醋酸铵沉淀法–步骤繁琐

蛋白质组研究的基本技术蛋白提取样品制备流程2D电泳结果影响因素分析2D电泳结果影响因素分析蛋白质组研究的基本技术蛋白提取样品制备流程去除杂质

关键是尽量不丢失蛋白和减少蛋白修饰

核酸的清除（DNase/RNase）多糖的清除（超离心、TCA沉淀等）去污剂的清除（丙酮沉淀法等）盐离子和外源带电小分子的清除（透析、TCA-丙酮沉淀法）蛋白质组研究的基本技术蛋白提取样品制备流程2D电泳结果影响因素分析可能原因：样品含高丰度Pr可能原因：TCA残留致使Pr丢失2D电泳结果影响因素分析可能原因：样品含高丰度Pr可能原因：蛋白质组研究的基本技术蛋白提取样品制备注意事项：蛋白质水解蛋白酶抑制剂(PMSF等)特殊样品的制备(低丰度、强碱性蛋白质（核糖体）、极端分子量)样品定量重复性蛋白质组研究的基本技术蛋白提取样品制备注意事项：TwoDimensionalGelElectrophoresis(2D-GE)DifferentialGelElectrophoresis(DIGE)GelElectrophoresisTwoDimensionalGelElectrophoWorkflowforTwo-DimensionalElectrophoresis(2-DE)GE(2004)2-DElectrophoresisWorkflowforTwo-DimensionalEtwodimensionalgelelectrophoresis(2D-GE)twodimensionalgelelectrophoIsoelectricFocusingElectrophoresis(IEF)IEFmainlyappliedforthefollowingpurposes:1stdimensionalfractionationofproteinmixturesinhigh-resolution2-DelectrophoresisPre-fractionationofproteinmixturesaccordingtochargeFortheseparationofveryheterogeneousmixturesoftrypticpeptidesinsteadofstrongcationexchangechromatographyinMDLC-MSIPGimmobilizedpHgradientIPGStripforIEFpH10.0Cathode(-)pH3.0Anode(+)pH10→3IsoelectricFocusingElectrophIEFisperformedinapHgradientgel.ProteinsChargedwithAnion(-)orCation(+)

dependon(i)theirmoleculartraitsduetotheiracidicandbasicgroups,and(ii)theenvironmentalpH.EnvironmentalpH:inbasicbuffer,theacidicgroupsofproteinswithnegativecharge;inacidicbuffer,thebasicgroupswithpositivecharge.ProteinIsoelectricPoint(pI):AtapHvalue,thenetchargeofaproteiniszero.39IEFTheoreticalBackground

IEFisperformedinapHgradi40ThePrincipleofIsoelectricFocusingElectrophoresis40ThePrincipleofIsoelectricIEFPrincipleAmpholytestoCreateApHGradient:AHeterogeneousMixtureofIsomersofaliphaticoligoamino-oligocarboxylicacidsunderelectricityfieldcouldalignthemselvesduetoindividualmoleculetrait&createapHgradientalongcathodewithhigh-pHtoanodewithlow-pH.AmpholyteProperties:(i)highbufferingandsolubilityinitspI(ii)goodandregularelectricconductivityatitspI(iii)absenceofbiologicaleffect(iv)lowmolecularweightTheAmpholyte-Gel:theampholyte2%(w/v),thegel4%(T)&3%(C)ImmobilepHGradientStripforProteinsSeparation(IPG):(i)proteinsappliedtoapositionontheIPGstripcouldbechargedwithanion,cationandzero(ii)protein-cationmovesforwardcathodeandstopthesitewherethepHvalueisequaltothepIofprotein-cation;similarityforprotein-aniontomoveforwardanodeandstop;protein-zerotobenaivetomove.41IEFPrincipleAmpholytestoCre42ImmobilizedpHGradientPolyacrylamideTheGeneralStructureofImmobiline(Ampholyte)42ImmobilizedpHGradientPoly蛋白质组学proteomicswxj教学课件双向凝胶电泳（2-DE）是等电聚焦电泳和SDS的组合即先进行等电聚焦电泳（按照pI分离）然后再进行SDS（按照分子大小）凝胶经染色得到二维分布的蛋白质图双向凝胶电泳（2-DE）是等电聚焦电泳和SDS的组蛋白质组研究的基本技术2D-SDS：样品制备第一向IPG-IEF电泳IPG平衡第二向SDS电泳染色（银染）及图谱分析目标蛋白获取及其鉴定（MC分析）蛋白质组研究的基本技术2D-SDS：蛋白质组学proteomicswxj教学课件2-DE第一向IPG-IEF电泳IEF是一种根据样品的等电点不同而使它们在pH梯度中相互分离的一种电泳技术将等电点不同的蛋白质混合物加入有pH梯度的凝胶介质中，在电场内经过一定时间后，各组分将分别聚焦在各自等电点相应的pH位置上，形成分离的蛋白质区带从而得知其等电点信息2-DE第一向IPG-IEF电泳IPG-IEF电泳IPG-IEF电泳2-DE第二向垂直SDS电泳聚丙烯酰胺凝胶形成网状结构，具有浓缩效应、电荷效应、分子筛效应。SDS与蛋白质形成雪茄状带负电荷复合物，从而消除了蛋白间的电荷及形状差异，电泳速度仅与分子量有关

从而得知其分子量信息2-DE第二向垂直SDS电泳第二向垂直SDS电泳凝胶浓度与其对应的分离范围胶浓度分离范围(KD)5%36-2007.5%24-200

10%14-20012.5%14-10015%14-60第二向垂直SDS电泳凝胶浓度与其对应的分离范围第二向垂直SDS电泳EttanDalttwelve电泳系统第二向垂直SDS电泳EttanDalttwel第二向垂直SDS电泳EttanDaltsix电泳系统第二向垂直SDS电泳EttanDaltsix电2-DE凝胶蛋白质斑点的检测染色：

1）考马斯亮兰染色法；

2）银染法；3）负染法；4）荧光染色法；5）放射性同位素标记法等2-DE凝胶蛋白质斑点的检测染色：安全（safety）灵敏（sensitivity）简单（simplicity）特异性（specificity）快速（speed）稳定（stability）兼容性（synergy）理想显色剂的7S理想显色剂的7S有机染料和银染考马斯亮蓝染色灵敏度为30~100ng，线性范围是20倍；硝酸银染色的线性范围是40倍，灵敏度是考染的100倍。胶体考马斯亮蓝染色技术可实现PAGE的无背景染色，其极限灵敏度为8~10ng，但这种染液会对蛋白质进行修饰而影响质谱分析的结果。氨基黑常用于转印至聚偏二氟乙烯（PVDF）和/或硝酸纤维素膜上的蛋白质的染色。银染的缺点是：对某些种类的蛋白质染色效果差，对其后的蛋白质测序和质谱分析造成影响。这两类染色技术都可减少胶内蛋白质产量。

有机染料和银染考马斯亮蓝染色灵敏度为30~100ng，线性范CoomassieBrilliantBlue&SilverStain

CoomassieBrilliantBlue&Silv负染能专门提高PAGE胶上蛋白质的回收率，但不能用于膜上染色。结果表现为胶面着色而蛋白质点透明。速度快（5~15min），蛋白质的生物活性能保持：一旦用络合剂如EDTA或Tris/甘氨酸转移缓冲液来络合金属离子就可进行提取来转移蛋白质。它主要适用于蛋白质显色、完整蛋白质的胶上被动提取以及质谱分析。该技术主要包括金属盐染料、锌－咪唑染料等的使用。负染能专门提高PAGE胶上蛋白质的回收率，但不能用胶体扩散染料主要用于高灵敏度检出电转印至硝酸纤维素和PVDF膜上的蛋白质，不用于胶内染色。最好的胶体金染色的灵敏度与PAGE胶内的银染类似。这种技术主要包括丽春红、印度墨水染料、胶体金染料等。

胶体扩散染料主要用于高灵敏度检出电转印至硝酸纤维素和PVDF有机荧光团染料包括共价结合和非共价结合的荧光团染料两类。后者最为常用，其典型代表是已经商品化的SYPRORed、Orange、Ruby等荧光染料。这三种染料可对SDS胶内蛋白质进行一步染色，约30~60min完成，灵敏度为2~10ng。染色后的凝胶用标准的实验室300nm紫外透射仪进行照像保存，其线性范围为3个数量级。这三种染料的电泳染色结果与在酵母中通过SAGE所获得的基因表达水平的动态范围相匹配。在Tris/甘氨酸转印缓冲液中染色后，蛋白质可被转印至膜上并进行免疫染色或Edman测序来鉴定蛋白质。有机荧光团染料包括共价结合和非共价结合的荧光团染料两类。后者荧光染色荧光染色金属螯合染料这是一类与现代蛋白质组学研究相兼容的、相对较新的蛋白质显色试剂，其设计专门与常用微量化学表征过程兼容。它们不包含戊二醛、甲醛或Tween-20等，很容易和集成化蛋白质组学平台（包括自动化凝胶染色仪、图像分析工作站、机器人剪切仪器、蛋白质酶解工作站和质谱仪等）相结合。其中SYPRORuby也是一种基于钌的金属发光染料。金属螯合染料这是一类与现代蛋白质组学研究相兼容的、相对较新的同位素标记，放射自显影灵敏度~20pg同位素标记，放射自显影灵敏度~20pg2DE重复性Thesameprotocolandsample,howevernotthesameresultsRec:similar;cir:different2DE重复性ThesameprotocolandsaDIGE&ProteinsLabeledwithCyDyesProteinslabeledwithCyDyes:

withdyescyanine(Cy2blue,Cy3red,Cy5green),thedyescannotinfluenceproteinpropertyaswellasitsmolecularweightmuch.TheMixedRunon2-DE:

themixedratioat1:1,runonthesame2-DE,thesamekindofproteinswithdifferentdyesfromdifferentsamplescanco-migrate.TheMixedGelScanned:

withlaserscannertoscanthemixedrangelatdifferentwavelengthsaccordingtoCyDyeTheResultReadout:thepositionandthecoloroftheproteinspotsonDIGEimage,thepositiontorepresenttheproteinID,thecolor,accordingtostandardcolorcalibratortoinfereachdyetheproportiontothedyemix,torepresenttherelativeamountofthesamekindofproteinamongdifferentsamples.64DIGE&ProteinsLabeledwithC650Cx30minGE(2004)2-DElectrophoresisLysineLabeling(minimallabeling)Inpractice400pmolofdyeisaddedto50ugofprotein.Inthiswayonly3-5%oftheproteinswillreceiveatag(95-97%remainunlabeled)Labelingreaction:noIPGbuffer,noreductant,pH8.5,37℃,30minwithdye,theepsilon-aminosidegroupoflysineislabeledwithdye.650Cx30minGE(2004)2-DEle66CysteineLabeling(saturationlabeling)Thehighsensitivity,downto1000humancells(around2.5ugprotein)couldprovidegood2-DELabelingreaction:noIPGbuffer;TCEPreductantpH8.0,37℃,1h;dyeaddedpH8.0,37℃30min;thethiogroupofcysteinelabeledwithdyes(Cy3orCy5).66CysteineLabeling(saturatio67Workflowfor2-DEofProteinsLabeledwithCyDyes67Workflowfor2-DEofProtein68WorkflowforDIGEofProteinsLabeledwithCyDyesGE(2004)2-DElectrophoresis68WorkflowforDIGEofProtein69ProteinsLabeledwithCyDyesMixLabeledProteins2-DELaserScannerwithDifferentWavelengthsIndividual&OverlapImageAnalysis(ProteinSpotLocation&Color)IdentificationofProteinID&Abundance1stIEF(pI)2ndSDS(Mw)69ProteinsLabeledwithCyDyesExampleforDIGEImagesScannedwithDifferenceWavelength

ProteomicsinPracticep6970ExampleforDIGEImagesScanne2-DE凝胶蛋白质斑点的检测图像扫描和分析——ImageScannerII2-DE凝胶蛋白质斑点的检测图像扫描和分析——Image2-DE凝胶蛋白质斑点的检测全自动斑点切取系统（EttanSpotPicker）

2-DE凝胶蛋白质斑点的检测全自动斑点切取系统（Ettan质谱分析(MS)质谱原理：样本分子离子化后,根据不同离子间质荷比(m/e)差异,分离样本,确定分子量2-DE凝胶蛋白质斑点的检测质谱分析(MS)质谱原理：样本分子离子化后,根据不同离子PrincipleforMassSpectrometry74SchematicofQuadrupoleTOFHybridAnalyzerWestermeier(2008)ProteomicsinPracticePrincipleforMassSpectrometr电喷雾质谱电喷雾质谱样品溶于固定的底物中形成晶体，用激光脉冲使其离子化，离子被加速后通过飞行管时分离，所有离子均可被检测，常用来测蛋白质、多肽、核酸和多糖等生物大分子MALDI-TOFMS样品溶于固定的底物中形成晶体，用激光脉冲使其离子化，离子被加通过质谱分析，可以获得分析样品的分子量、分子式、分子中同位素构成和分子结构等多方面的信息SARS病毒N蛋白整体分子量通过质谱分析，可以获得分析样品的分子量、分子式、分子中同位素蛋白质经过酶解成肽段后，获得所有肽段的分子质量，形成一个特异的肽质量指纹图谱（peptidemassfingerprinting，PMF），通过数据库搜索与比对，便可确定待分析蛋白质分子的性质。PeptideMassFingerprinting(PMF)蛋白质经过酶解成肽段后，获得所有肽段的分子质量，形成一个特异PeptideMassFingerprinting(PMF)PeptideMassFingerprinting(PPeptideMassFingerprinting(PMF)PeptideMassFingerprinting(P用PMF方法未能鉴定的蛋白质可通过质谱技术获得该蛋白质一段或数段多肽的串连质谱信息（氨基酸序列）并通过数据库检索来鉴定该蛋白质。混合蛋白质酶解后的多肽混合物直接通过（多维）液相色谱分离，然后进入质谱进行分析。用串联质谱（MS/MS）鉴定蛋白质用PMF方法未能鉴定的蛋白质可通过质谱技术获得该蛋白质一段或用串联质谱（MS/MS）鉴定蛋白质用串联质谱（MS/MS）鉴定蛋白质多肽氨基酸序列分析串联质谱（Tandem-MS）,第一级质谱得到肽的分子离子,选取目标肽的离子作为母离子，与惰性气体碰撞，使肽链中的肽键断裂，形成一系列离子，即N端碎片离子系列（B系列）和C端碎片离子系列（Y系列），将这些碎片离子系列综合分析，可得出肽段的氨基酸序列。“proteinladdersequencing”的方法，通过对Edman降解法的修改，产生一系列截去N端残基的肽段，用MALDI-MS测得这些肽段的质量，从而推测N端序列。

多肽氨基酸序列分析串联质谱（Tandem-MS）,第一级质谱84Theprotonatedtotalpeptidemassis1410.6.ThepeptidetobeionizedintoN-terminalions(b-ions)andC-terminalions(y-ions).Thealignmentoftheseionsofthepeptidefromsmalltolargeaccordingtotheirm/z,auniquemassspectrumforthepeptide.Thesignalintensity(theheight)ofeachionrepresentstheabundanceofthefragmentioninsystem.Contrastofb-ionstoy-ionscouldinferthepeptidesequence.多肽氨基酸序列分析84Theprotonatedtotalpeptide多肽氨基酸序列分析多肽氨基酸序列分析IsotopeLabelingProteinSamplesviaMetabolism

Campbell(2002)Discoveringp189

86DifferentIsotopestolabeldifferentsamplesviametabolism.Combinethesamplesataratioofonetoonefromdiffsourcesandtosubjecttoseparation,anddigestion.AnalysisbyMStoproducecharacteristicmassspectrum(1)ateverym/zpoint,twopeaksalwaysoccurredincouple,representingthesamemoleculewithdiffmassisotopes:thefrontwithlightisotopeandthefollowingwithheavyone.(2)ateverym/zpoint,theratiooftwopeakstorepresentthesamemoleculerelativeabundancefromdiffsources.IsotopeLabelingProteinSampIsotopeTagICATforLabelingofProteinSamplesinvitro

87ICATconsistsofthreeparts(i)biotinaffinitytag,bindreversiblytoavidin(ii)alinker,contain8stableisotopes(iii)thiolgroup,bindtocysteineofproteinInICATmolecule,ifXgroupspresentwithH(=1),theICATisthelightisotopetag.IfXgroupspresentwithD(deuterium=2),theICATistheheavyisotopetag.ThemassdifferencebetweenHandDinICATcouldbediscriminatedbyMS.IsotopeTagICATforLabeling88WorkflowofProteinTaggedwithICATforLC-MSCampbell(2002)Discovering88WorkflowofProteinTaggedwProteinsLabeledwithICATinvitro,AnalyzedbyMS

Campbell(2002)Discoveringp19189InvitroproteinsfromdiffsourcestobelabeledwithdifferentICAT,lightandheavymass.Combinethesamples(thelightwiththeheavy)anddigestit.WithaffinitypurificationagainstICATtoisolateproteinfragmentslabeledwithICAT.TheICAT-labelfragmentstobeanalyzedbyMS,similartothatoflabeledwithN14andN15.

Atam/zpoint,therearetwomasspeaks,thesamemolecule,fromdifferentsources,labeledwiththelightandtheheavyICAT.Thepeakratiorepresentsthesamemoleculewithrelativeabundanceaccordingtodiffsources.ProteinsLabeledwithICATin90QuantificationandIdentificationProteinsbyICATCampbell(2002)Discovering90QuantificationandIdentific蛋白质功能研究技术功能蛋白质组学蛋白质功能研究技术功能蛋白质组学TechniquesforStudyofProtein-ProteinInteractionsProteinMicroarrayPulldownImmunoprecipitation（Co-IP）&WesternBlottingY2HSystem(yeasttwo-hybridsystem)FluorescenceResonanceEnergyTransferthroughtheproteincomplex(FRET)TechniquesforStudyofProteiPulldownPulldownCo-IPCo-IPYeasttwo-hybridsystemYeasttwo-hybridsystem蛋白质组在医学研究中

的现状和前景蛋白质组在医学研究中

的现状和前景蛋白质组在医学研究中的现状和前景人类疾病的蛋白质组研究直肠癌： Sanchez等对15例结肠癌和13例正常人的结肠上皮进行2-DE。建立了包括882和861个斑点的结肠癌及正常人结肠粘膜的标准胶图。结果发现在分子量为13kD和pI值为5.6处的蛋白质仅出现在结肠癌的组织中。经鉴定为：钙粒蛋白B（calgranulinB）及钙卫蛋白（calprotectin）

蛋白质组在医学研究中的现状和前景人类疾病的蛋白质组研究蛋白质组在医学研究中的现状和前景致病微生物的蛋白质组研究检测博氏疏螺旋体与免疫有关的蛋白质弓形体抗原的检测白色念珠菌对真菌细胞壁蛋白分析筛选抗药真菌药物蛋白质组在医学研究中的现状和前景致病微生物的蛋白质组研究蛋白质组学研究趋势蛋白质组学研究趋势蛋白质组学研究趋势在应用研究方面 蛋白质组学将成为寻找疾病分子标记和药物靶标最有效的方法之一在技术发展方面研究方法将更强调各种方法间的整合和互补，以适应不同蛋白质的不同特征蛋白质组学与其它学科的交叉互动蛋白质组学研究趋势在应用研究方面 蛋白质组学proteomicswxj幻灯片PPT本课件PPT仅供大家学习使用学习完请自行删除，谢谢！本课件PPT仅供大家学习使用学习完请自行删除，谢谢！本课件PPT仅供大家学习使用学习完请自行删除，谢谢！本课件PPT仅供大家学习使用学习完请自行删除，谢谢！蛋白质组学proteomicswxj幻灯片PPT本课Proteome&Proteomics定义Proteome：1994年，由澳大利亚Macguarie大学的Wilkins等首先提出：“蛋白质组指由一个细胞或一个组织的基因组所表达的全部蛋白质”“proteome”是由蛋白质一词的前几个字母“prote”和基因组一词的后几个字母“ome”拼接而成Proteome&Proteomics定义ProteoProteome&Proteomics定义Proteomics：蛋白质组学是从整体水平细胞内蛋白质的组成、结构、功能及其动态变化规律的科学。研究内容包括分析蛋白质组所有组分及它们的表达水平，确定各种组分的空间定位、修饰方法、互作机制、生物活性及相应特定功能等。由此获得蛋白质水平上的关于疾病发生，细胞代谢等过程的整体而全面的认识Proteome&Proteomics定义ProteoGenome&ProteomeGenome&ProteomeGenomicsTranscriptomics&ProteomicsGenomicsTranscriptomics&ProProteomics&StructuralGenomicsProteomics&StructuralGenomiProteomics&FunctionalGenomicsProteomics&FunctionalGenomi特点之一∶整体性特点之一∶整体性特点之二∶系统性特点之二∶系统性特点之三∶动态性特点之三∶动态性StructuralProteomics结构蛋白质组学FunctionalProteomics功能蛋白质组学分类StructuralProteomics分类StructuralProteomicsSeparationIdentificationPTM(post-translationalmodification)IdentificationComparison&SubtractionAnalysisStructuralProteomicsSeparatioFunctionalProteomicsLocalizationProteinComplexDeterminationProtein-ProteinInteraction/InteractionNetworkFunctionofProtein(MetabolicandRegulatoryPathway;SignalTransductionPathway)FunctionalProteomicsLocaliza蛋白质鉴定：可以利用一维电泳和二维电泳并结合生物质谱、Western印迹、蛋白质芯片等技术，对蛋白质进行全面的鉴定研究。翻译后修饰的鉴定：如磷酸化、糖基化、酶原激活等过程。蛋白质功能确定：包括蛋白质定位研究，蛋白质活性，蛋白质相互作用，酶活性和确定酶底物，细胞因子的生物分析，配基-受体结合分析等。蛋白质组学的主要任务蛋白质组学的主要任务蛋白质组学研究思路与方法策略、技术、工具蛋白质组学研究思路与方法策略、技术、工具主要专业术语及其英文对照和缩写IPG-IEF：固相pH梯度等电聚焦（immobilizedpHgradientsisoelectricfocusing）SDS-PAGE：十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（Sodiumdodecylsulfate-polyacrylamidegelelectrophoresis）2-DE：双向电泳(TwoDimensionalElectrophoresis)HPLC：高效液相色谱（HighperformanceLiquidChromatography）MALDI-TOFMS：基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MatrixAssistedLaserDesorption/IonizationTime-of-FlightMassSpectrometry)主要专业术语及其英文对照和缩写IPG-IEF：固相pH梯度等蛋白序列数据库（SWISS-PROT/TrEMBL；http://www.expasy.ch）基因序列数据库（Genbank，/EMBL；http://www.ebi.ac.uk/）蛋白模式数据库（Prosite；http://www.expasy.ch/sprot/prosite.html）蛋白质二维凝胶电泳数据库、蛋白三维结构数据库（PDB，/；FSSP，http://www.embl-ebi.ac.uk）蛋白翻译后修饰数据库（O-GLYCBASE，http://www.cbs.dtu.dk/databases/OGLYCBASE）蛋白质组学研究相关数据库蛋白序列数据库（SWISS-PROT/TrEMBL；http研究策略两条互补的实验流程基于凝胶的工作流程 （Gel-basedworkflow）基于液相色谱的工作流程 （LC-basedworkflow）研究策略两条互补的实验流程ClassicalGE&LCtoProteinIDGapelo(2010)JProteomicsHPLC-MSClassicalGE&LCtoProteinI蛋白质组学proteomicswxj教学课件蛋白质组研究的主要手段双向电泳（twodimensionalgelelectrophoresis,2D-GE）差示电泳（differentialgelelectrophoresis,DIGE

）毛细管电泳

(capillaryelectrophoresis,CE)高效液相色谱

(highperformanceliquidchromatography,HPLC)分子筛柱层析反向柱层析质谱分析(massspectrometryMS)

基质辅助激光解吸离子化-飞行时间串联质谱(matrix-assistedlaserdisorptionionization-timeofflight/tandemMS,MALDI-TOF/MS/MS)

电喷雾离子化串联质谱（electrosprayionizationESI-MS）生物信息学蛋白质组研究的主要手段双向电泳（twodimensiona蛋白质组学实验室所需的条件蛋白质组学实验室所需的条件蛋白质组学研究的基本技术路线蛋白质样品的制备双向电泳或HPLC图像分析凝胶中的蛋白溶液中的蛋白混合肽蛋白质质量N端测序肽序列质谱数据肽指纹图数据搜索新的或已知蛋白翻译后修饰的鉴定酶解蛋白质组学研究的基本技术路线蛋白质样品的制备双向电泳或HPLSampleProteinPreparationUsuallythecomplexityoftheproteinand/orpeptidemixtureliesbeyondthetheoreticalseparationspaceofanyseparationmethod.ProteomeComplexity.

Genomictranscriptionindiversity;post-transcriptionprocessing;post-translationalmodification;constitutionofcombinatorialcomplex.Itrequiresquitealongtimeforanalysisofproteincomplex.Samplerecoverylowthroughseparation:moresteps,lessoverallrecovery.Theconc.oftheproteinswitharangeof6-ordermagnitude:intissues,proteinconcentrationsspanadynamicrangeofsixordersofmagnitudes(forregulatoryproteinorTFsafewmoleculespercell,forhousekeepingproteinsmillioncopiespercell).So,itisdifficulttodetectverylowconcentratedproteinsinthepresenceofhighlyabundantproteins.Thecomplexproteinsampleswithlimitedstabilityduetoexistenceofenzymesandproteases,enzymeinhibitorscanonlypartlystabilizethesample.SampleProteinPreparationUsuaManyparametersinfluencethecompositionofproteomebetweeninducedandinherentbiologicalvariations,suchasgeneticdifferences,genderandageofpatientsandcellgrowthconditions.Thisrequiressamplereplicates.(statisticianswoulddemandatleastfivereplicates,inmanycasesthreereplicatescandeliverhighlyconfidentresults.Inclinicalthenumberofrequiredproteinsaremuchhigh).Membraneproteinsareverydifficulttosolubilize,andeasytolossduringsamplepreparationandseparationbystickingtoasurfaceoraggregation.Post-translationalmodifications(PTMs)likephosphorylationandglycosylationrequiresophisticatedanalysistoolslikeMSn,wherethepeptideionsgeneratedseveraltimesfragmented.SampleProteinPreparationManyparametersinfluencethe蛋白质组研究的基本技术样品预分离样品的制备（预处理）：组织细胞细胞器（线粒体、叶绿体、细胞核）蛋白质组研究的基本技术样品预分离样品的制备（预处理）蛋白质组研究的基本技术蛋白提取重要性：在制备时丢失的蛋白永远不能在后面实验中弥补原则：使所有待分析的蛋白样品全部处于溶解状态防止样品在聚焦时发生蛋白的聚集和沉淀防止在样品制备过程中发生样品的抽提后化学修饰（如酶性或化学性降解等）完全去除样品中的核酸和某些干扰蛋白蛋白质组研究的基本技术蛋白提取重要性：蛋白质组研究的基本技术蛋白提取步骤：破碎沉淀蛋白去除杂质蛋白质组研究的基本技术蛋白提取步骤：蛋白质组研究的基本技术蛋白提取样品制备流程破碎

尽可能减少蛋白水解/其它形式蛋白降解原则机械法（超声波法、高压法、机械匀浆法）化学法（去污剂法、酶裂解法）物理法（液氮研磨法、反复冻融法、渗透 法、玻璃珠破碎法）蛋白质组研究的基本技术蛋白提取样品制备流程蛋白质组研究的基本技术蛋白提取样品制备流程沉淀蛋白

去杂浓缩后蛋白可溶性是关键

三氯醋酸（TCA）-丙酮沉淀法

TCA沉淀法–引起降解/修饰丙酮沉淀法硫酸铵沉淀法–影响IEF醋酸铵沉淀法–步骤繁琐

蛋白质组研究的基本技术蛋白提取样品制备流程2D电泳结果影响因素分析2D电泳结果影响因素分析蛋白质组研究的基本技术蛋白提取样品制备流程去除杂质

关键是尽量不丢失蛋白和减少蛋白修饰

核酸的清除（DNase/RNase）多糖的清除（超离心、TCA沉淀等）去污剂的清除（丙酮沉淀法等）盐离子和外源带电小分子的清除（透析、TCA-丙酮沉淀法）蛋白质组研究的基本技术蛋白提取样品制备流程2D电泳结果影响因素分析可能原因：样品含高丰度Pr可能原因：TCA残留致使Pr丢失2D电泳结果影响因素分析可能原因：样品含高丰度Pr可能原因：蛋白质组研究的基本技术蛋白提取样品制备注意事项：蛋白质水解蛋白酶抑制剂(PMSF等)特殊样品的制备(低丰度、强碱性蛋白质（核糖体）、极端分子量)样品定量重复性蛋白质组研究的基本技术蛋白提取样品制备注意事项：TwoDimensionalGelElectrophoresis(2D-GE)DifferentialGelElectrophoresis(DIGE)GelElectrophoresisTwoDimensionalGelElectrophoWorkflowforTwo-DimensionalElectrophoresis(2-DE)GE(2004)2-DElectrophoresisWorkflowforTwo-DimensionalEtwodimensionalgelelectrophoresis(2D-GE)twodimensionalgelelectrophoIsoelectricFocusingElectrophoresis(IEF)IEFmainlyappliedforthefollowingpurposes:1stdimensionalfractionationofproteinmixturesinhigh-resolution2-DelectrophoresisPre-fractionationofproteinmixturesaccordingtochargeFortheseparationofveryheterogeneousmixturesoftrypticpeptidesinsteadofstrongcationexchangechromatographyinMDLC-MSIPGimmobilizedpHgradientIPGStripforIEFpH10.0Cathode(-)pH3.0Anode(+)pH10→3IsoelectricFocusingElectrophIEFisperformedinapHgradientgel.ProteinsChargedwithAnion(-)orCation(+)

dependon(i)theirmoleculartraitsduetotheiracidicandbasicgroups,and(ii)theenvironmentalpH.EnvironmentalpH:inbasicbuffer,theacidicgroupsofproteinswithnegativecharge;inacidicbuffer,thebasicgroupswithpositivecharge.ProteinIsoelectricPoint(pI):AtapHvalue,thenetchargeofaproteiniszero.139IEFTheoreticalBackground

IEFisperformedinapHgradi140ThePrincipleofIsoelectricFocusingElectrophoresis40ThePrincipleofIsoelectricIEFPrincipleAmpholytestoCreateApHGradient:AHeterogeneousMixtureofIsomersofaliphaticoligoamino-oligocarboxylicacidsunderelectricityfieldcouldalignthemselvesduetoindividualmoleculetrait&createapHgradientalongcathodewithhigh-pHtoanodewithlow-pH.AmpholyteProperties:(i)highbufferingandsolubilityinitspI(ii)goodandregularelectricconductivityatitspI(iii)absenceofbiologicaleffect(iv)lowmolecularweightTheAmpholyte-Gel:theampholyte2%(w/v),thegel4%(T)&3%(C)ImmobilepHGradientStripforProteinsSeparation(IPG):(i)proteinsappliedtoapositionontheIPGstripcouldbechargedwithanion,cationandzero(ii)protein-cationmovesforwardcathodeandstopthesitewherethepHvalueisequaltothepIofprotein-cation;similarityforprotein-aniontomoveforwardanodeandstop;protein-zerotobenaivetomove.141IEFPrincipleAmpholytestoCre142ImmobilizedpHGradientPolyacrylamideTheGeneralStructureofImmobiline(Ampholyte)42ImmobilizedpHGradientPoly蛋白质组学proteomicswxj教学课件双向凝胶电泳（2-DE）是等电聚焦电泳和SDS的组合即先进行等电聚焦电泳（按照pI分离）然后再进行SDS（按照分子大小）凝胶经染色得到二维分布的蛋白质图双向凝胶电泳（2-DE）是等电聚焦电泳和SDS的组蛋白质组研究的基本技术2D-SDS：样品制备第一向IPG-IEF电泳IPG平衡第二向SDS电泳染色（银染）及图谱分析目标蛋白获取及其鉴定（MC分析）蛋白质组研究的基本技术2D-SDS：蛋白质组学proteomicswxj教学课件2-DE第一向IPG-IEF电泳IEF是一种根据样品的等电点不同而使它们在pH梯度中相互分离的一种电泳技术将等电点不同的蛋白质混合物加入有pH梯度的凝胶介质中，在电场内经过一定时间后，各组分将分别聚焦在各自等电点相应的pH位置上，形成分离的蛋白质区带从而得知其等电点信息2-DE第一向IPG-I