微生物学实验教学大纲

《食品微生物学》实验大纲总学时：24学分：1.5面向专业：食品科学与工程（大类）课程代码：B32100014先开课程：化学、生物化学等课程性质：必修课执笔人：宫春波审定人：宫春波孙庆杰第一部分：实验教学部分一、说明1、本门课程实验的性质任务、目的与要求本实验课是《食品微生物学》的重要组成部分，是《食品微生物学》课程的必修环节。在系统地学习了理论知识的同时，通过课程实验，使学生能掌握一定的基本实验技能；通过分析实验过程出现的各种现象和问题，培养学生分析问题和解决问题的能力；通过实验数据的分析处理以及实验报告的撰写，培养和训练学生的实际应用能力和组织报告的能力。本实验的开设要求实验室具备微生物实验要求的基本设备和相关测试仪器，同时要求学生具备化学、生物化学等基本理论知识。2、本门课程实验项目设置情况序号实验名称学时必开选开实验类型内容提要验证基本操作综合性、设计性1微生物的个体形态观察及群体形态特征的观察2√√微生物涂片、染色的基本技术；显微镜（油镜）的使用方法和无菌操作技术。2培养基的制备、灭菌以及无菌检测4√√微生物培养基的制备；高压蒸汽灭菌技术和微生物接种技术3微生物个体大小测定2√√4微生物直接计数（血球板计数）2√√5微生物营养谱的测定2√√6环境因素对发酵微生物的影响及药敏实验2√√紫外线、化学消毒剂对微生物生长的影响；微生物之间的相互作用。7微生物的选育及其鉴定、分类、命名4√√微生物的纯种分离方法；菌种鉴定；微生物生产特性的测定及其检测。8基于培养介质的微生物消长的测定4√√微生物生长曲线的测定绘制，微生物生长的影响因素及其程度的探索。9微生物遗传物质提取、鉴定实验6√√微生物遗传物质的提取，检测及其测序比较。10原生质体融合技术杂交育种二、各实验项目教学要求实验一微生物的个体形态观察及群体形态特征的观察(一).显微镜的构造、性能和使用方法1.实验目的（1）掌握显微镜的构造、性能和使用方法，重点掌握普通光学显微镜油镜的使用。（2）了解和利用普通光学显微镜油镜对细菌、放线菌进行个体形态观察。（3）观察并比较不同来源的的微生物生长的数量和类型。2.原理显微镜的光学系统中，有两组重要的透镜，这两组透镜虽然结构很复杂，但它们的作用都相当于一个凸透镜。凸镜的成像原理，也就是显微镜放大成像的光学原理。只不过是通过两次放大而已。显微镜的放大效能（分辨率）是由所用光波长短和物镜数值口径决定，缩短使用的光波波长或增加数值口径可以提高分辨率，可见光的光波幅度比较窄，紫外光波长短可以提高分辨率，但不能用肉眼直接观察。所以利用减小光波长来提高光学显微镜分辨率是有限的，提高数值口径是提高分辨率的理想措施。要增加数值口径，可以提高介质折射率，当空气为介质时折射率为1，而香柏油的折射率为1.51，和载片玻璃的折射率（1.52）相近，这样光线可以不发生折射而直接通过载片、香柏油进入物镜，从而提高分辨率。显微镜总的放大倍数是目镜和物镜放大倍数的乘积，而物镜的放大倍数越高，分辨率越高。来自不同场所与不同条件下细菌的数量和类型不同。通过环境中微生物的检测，比较来自不同场所与不同条件下细菌的数量和类型。3.试剂和仪器设备（1）仪器或其他用具：显微镜（带油镜头，每人1台）、擦镜纸、棉签、废物缸等。（2）溶液或试剂：香柏油、二甲苯。（3）菌种：金黄色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）及枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）染色玻片标本；链霉菌（Stretomycessp.）及青霉（Penicillium）的水封片；细菌染色片：单球菌、双球菌、四联球菌、八叠球菌、链球菌、葡萄球菌、无芽孢杆菌、荚膜、鞭毛、弧菌、螺菌）；放线菌染色片：细黄链霉菌（5406放线菌）、弗氏链霉菌。3.实验步骤标本片→低倍镜观察→高倍镜观察→油镜观察=1\*GB3①低倍镜的使用方法：（1）取镜和放置（2）对光（3）放置玻片标本（4）调节焦距=2\*GB3②高倍镜的使用方法：（1）选好目标（2）转动转换器，调换上高倍镜头，转换高倍镜时转动速度要慢，并从侧面进行观察（防止高倍镜头碰撞玻片），如高倍镜头碰到玻片，说明低倍镜的焦距没有调好，应重新操作。（3）调节焦距=3\*GB3③油镜的使用方法：（1）在使用油镜之前，必须先经低、高倍镜观察，然后将需进一步放大的部分移到视野的中心。（2）将集光器上升到最高位置，光圈开到最大。（3）转动转换器，使高倍镜头离开通光孔，在需观察部位的玻片上滴加一滴香柏油，然后慢慢转动油镜，在转换油镜时，从侧面水平注视镜头与玻片的距离，使镜头浸入油中而又不以压破载玻片为宜。（4）用左眼观察目镜，并慢慢转动细调节器至物象清晰为止。（5）油镜使用完毕，先用擦镜纸沾少许二甲苯将镜头上和标本上的香柏油擦去，然后再用干擦镜纸擦干净。5.实验数据及其处理绘出你观察到的经简单染色的细菌菌体形态图。

6.问题讨论（1）显微镜的工作原理是什么？（2）使用显微镜有哪些注意事项？（3）使用油镜观察细菌染色标本片时为何要加香柏油？（二）细菌的染色与形态结构的观察1.实验目的（1）学习微生物涂片、染色的基本技术。（2）初步认识细菌的形态特征。（3）巩固显微镜（油镜）的使用方法和无菌操作技术。（4）学习并初步掌握革兰氏染色法。（5）了解革兰氏染色法的原理及其在细菌分类鉴定中的重要性。（6）观察芽孢的形态特征。2.原理细菌先经碱性染料结晶染色，而经碘液媒染后，用酒精脱色，在一定条件下有的细菌此色不被脱去，有的可被脱去，因此可把细菌分为两大类，前者叫做革兰氏阳性菌（G+），后者为革兰氏阴性菌（G—）。为观察方便，脱色后再用一种红色染料如碱性蕃红等进行复染。阳性菌仍带紫色，阴性菌则被染上红色。革兰氏染色法将细菌分为革兰氏阳性和革兰氏阴性，是由这两类细菌细胞壁的结构和组成不同决定的。实际上，当用结晶紫初染后，像简单染色法一样，所有细菌都被染成初染剂的蓝紫色。碘作为媒染剂，它能与结晶紫结合成结晶紫一碘的复合物，从而增强了染料与细菌的结合力。当用脱色剂处理时，两类细菌的脱色效果是不同的。革兰氏阳性细菌的细胞壁主要由肽聚糖形成的网状结构组成、壁厚、类脂质含量低，用乙醇（或丙酮）脱色时细胞壁脱水、使肽聚糖层的网状结构孔径缩小，透性降低，从而使结晶紫一碘的复合物不易被洗脱而保留在细胞内，经脱色和复染后仍保留初染剂的蓝紫色。革兰氏阴性菌则不同，由于其细胞壁肽聚糖层较薄、类脂含量高，所以当脱色处理时，类脂质被乙醇（或丙酮）溶解，细胞壁透性增大，使结晶紫一碘的复合物比较容易被洗脱出来，用复染剂复染后，细胞被染上复染剂的红色。3.试剂和仪器设备（1）主要仪器设备或其他用具：显微镜（带油镜头，每人1台），酒精灯，载玻片，接种环，双层瓶（内装香柏油和二甲苯），擦镜纸，生理盐水等。（2）试剂：吕氏碱性美蓝染液（或草酸铵结晶紫染液），齐氏石炭酸复红染液；革兰氏染色液。5%孔雀绿水溶液，0.5%番红水溶液。绘图墨水（上海墨水厂的“沪光绘图墨水”效果较好；必要时用滤纸过滤后使用），1%甲基紫水溶液，1%结晶紫水溶液，6%葡萄糖水溶液，20%硫酸铜水溶液，甲醇。（3）菌种：枯草芽孢杆菌12～18h营养琼脂斜面培养物，藤黄微球菌（Ｍicrococcusluteus）约24h营养琼脂斜面培养物。大肠杆菌约24h营养琼脂斜面培养物，金黄色葡萄球菌约24h营养琼脂斜面培养物，蜡样芽孢杆菌（B.cercus）12-20h营养琼脂斜面培养物。革兰氏染色液。蜡样芽孢杆菌约2d营养琼脂余斜面培养物，球形芽孢杆菌（B.Sphaericus）1-2d营养琼脂斜面培养物。4.实验步骤无菌操作挑取菌种→涂片→干燥→固定→染色→水洗→干燥→镜检5.实验数据及其处理记录大肠杆菌和枯草芽孢杆菌染色后的观察结果。6.问题讨论（1）在制作涂片中，为什么要进行固定这一步？（2）革兰氏染色中哪一步关键，为什么？（3）作革兰氏染色涂片为什么不能过于浓厚?其染色成败的关键是什么?

（4）当你对一株未知菌进行革兰氏染色时，怎样能确证你的染色技术操作正确，结果可靠？实验二培养基的制备、灭菌以及无菌检测1.实验目的（1）明确培养基的配制原理；通过对基础培养基的配制，掌握配制培养基的一般方法和步骤。（2）了解高压蒸汽灭菌的基本原理及应用范围；学习高压蒸汽灭菌的操作方法。（3）了解干热灭菌的原理和应用范围；学习干热灭菌的操作技术。2.原理培养基是人工配制的适合微生物生长繁殖的营养基质。培养基要具备以下条件：①要有适宜的营养物质和水分；②具有适宜的PH值；③配制后应经灭菌呈无菌状态。培养基按物理状态可分液体培养基、固体培养基、半固体培养基。常用琼脂作凝固剂。3.试剂和仪器设备（1）仪器或其他用具：手提式高压蒸汽灭菌锅，电烘箱，培养皿（6套一包），培养皿，试管，吸管，试管，三角瓶，烧杯，量筒，玻棒，培养基分装器，天平，牛角匙，pH试纸（pH5.5-9.0），棉花，牛皮纸，记号笔，麻绳，纱布等。（2）溶液或试剂：①牛肉膏，蛋白胨，NaCl，琼脂，1mol/LNaOH,1mol/LHCl。②可溶性淀粉，KNO3,NaCl,K2HPO4·3H2O,MgSO4·7H2O,FeSO4·7H2O。4.实验步骤称量→溶化→过滤→定容→分装→包装→灭菌微生物样品→接种→观察5.实验数据及其处理根据你所制作的培养基，简述其制作过程。

6.问题讨论（1）说明制备培养基应注意哪些问题？（2）培养基配好后，为什么必须立即灭菌？如何检查灭菌后的培养基是无菌的？

（3）为什么高压蒸汽灭菌比干热灭菌所需的时间短，温度低 实验三微生物营养谱的测定1.目的要求学习用生长谱法测定微生物营养需要的基本原理和方法。2.基本原理为了使微生物生长、繁殖，必须供给所需要的碳源、氮源、无机盐、微量元素、生长因子等，如果缺少其中一种，微生物便不能生长。根据这一特性，可将微生物接种在一种只缺少某种营养物的完全合适的琼脂培养基中，倒成平板，再将所缺的营养物（例如各种碳源）点植于平板上，经适温培养，该营养物便逐渐扩散于植点周围。该微生物若需要此种营养物，便在这种营养物扩散处生长繁殖，微生物繁殖之处便出现圆形落圈，即生长图形，故称此法为生长谱法。这种方法可以定性、定量的测定微生物对各种营养物质的需要。在微生物育种和营养缺陷型的鉴定中也常用此法。3.

操作步骤1、24小时的大肠杆菌斜面用无菌水洗下，制成菌悬液。2、将合成培养基约20毫升，溶化后冷到50℃左右加入1毫升大肠杆菌悬液，摇匀，立即倾注于直径为12㎝的无菌培养皿中，待充分凝固后，在平板背面用记号笔划分为六个区，并标明要点植的各种糖类，如图1所。3、将6根无菌牙签，挑取6种糖对号点植，糖粒大小如小米粒。

4、倒置于37℃温室培养18～24小时，观察各种糖周围有无菌落圈。5.思考题营养缺陷性菌株营养谱确定的方法？实验四环境因素对发酵微生物的影响及药敏实验实验七环境因素对微生物的影响1.实验目的了解环境条件的改变对微生物生长影响。2.原理微生物的生长受环境条件的影响，这些环境条件包括物理的、化学的及生物的因素。如温度、氢离子浓度、水分活度、渗透压、氧气（氧化还原电位）、辐射、超声波、无机和有机化学试剂及其他生物生长过程中产生的毒素、抗生素等因素。根据微生物与氧气的关系，可将微生物分为好氧微生物、兼性厌氧微生物、厌氧微生物和微好氧微生物几大类。通常对细菌分类要求进行需氧性的测定。每种微生物都有其生长温度范围，根据其最适生长温度范围，可将微生物分为低温型、中温型和高温型三大类。大多数微生物属于中温型，它们的适宜生长温度在20～40℃之间。微生物对环境氢离子浓度即pH亦有一定的要求，一般细菌、放线菌适于在中性微偏碱的环境生长，而酵母和霉菌适于在微酸性环境中生长。如果pH过酸或过碱都将抑制微生物的生长。（1）常用化学消毒剂对微生物的作用。（2）紫外线灭菌的原理和方法。①紫外线照射。②化学消毒剂与紫外线照射结合使用。（3）微生物之间的拮抗作用。①琼脂移块法。②琼脂平面划线法。3.试剂和仪器设备（1）仪器或其他用具：①恒温培养箱，无菌滤纸片，吸管，三角涂棒。②紫外线灯，无菌平皿，接种环境。（2）溶液或试剂：①2.5%碘酒，0.1%升汞，5%石炭酸，75%乙醇，1%来苏尔，0.25%新洁尔灭，0.005%龙胆紫，0.05%龙胆紫，无菌生理盐水。②3%-5%石炭酸或者1-3%来苏尔溶液。（3）菌种：①大肠杆菌，白色葡萄球菌（Staphylococcusalbus）②试验菌（植物病原菌）、拮抗菌（放线菌）；苏云金杆菌（4）培养基：牛肉膏蛋白胨琼脂培养基。4.实验步骤到平板→接种菌种→物理、化学药剂处理→培养观察5.实验数据及其处理记录物理、化学因素对微生物生长的影响，分析影响的大小。6.问题讨论（1）在化学因素实验中，影响抑（杀）菌圈大小的因素有哪些？（2）紫外线对微生物的杀灭原理是什么？紫外线灭菌应注意什么问题？实验五微生物的选育及其鉴定、分类、命名1.实验目的本实验为综合性实验。学生应在掌握微生物分离纯化、菌种鉴定知识的基础上，结合微生物菌种分离、鉴定的技能，完成本项实验。本实验目的是使学生掌握倒平板的方法和几种常用的分离纯化接种培养的基本操作技术，了解微生物的保藏原理；掌握微生物的无菌操作技术；产淀粉酶的枯草芽孢杆菌的分离鉴定及产酶特性研究。学习、掌握和区别细菌、霉菌、酵母菌、放线菌、细菌菌落形态的方法。2.原理微生物在自然界中不仅分布广，而且种类多，并多是混杂地生活在一起。要想研究或利用某一微生物，必须把混杂的微生物类群分离开来，以得到只含一种微生物的纯培养。微生物学中将在实验室条件下由一个细胞或一种细胞群繁殖得到的后代称为微生物的纯培养。纯培养技术包括两个基本步骤：①从自然环境中分离培养对象。②在以培养对象为唯一生物种类的隔离环境中培养、增殖，获得这一生物种类的细胞群体。针对不同微生物的特点，有许多分离方法。应用最广的是平板法分离纯培养。微生物的接种技术有：①斜面接种法。②液体接种法。③穿剌接种法。根据枯草芽孢杆菌的生长特性利用纯培养技术进行鉴定，研究枯草芽孢杆菌的产酶特性。3.试剂和仪器设备（1）仪器或其他用具：①净化工作台、恒温培养箱、分光光度计、培养基、分离样品、灭菌培养皿、灭菌１ml吸管、接种环、接种针、酒精灯、火柴、玻棒、试管架、记号笔、牛皮纸、棉绳、废物缸。②放大镜（每1人1个），直尺。（2）溶液或试剂：盛有90ml无菌水三角瓶（内放少量玻璃珠），盛有9ml无菌水试管。（3）菌种：霉菌（根霉、毛霉、青霉、曲霉、木霉、赤霉菌）、酵母菌、放线菌、细菌的菌落。4.实验步骤学生应通过查阅相关资料，采集土样，样品处理――样品稀释――菌种分离――菌落观察――鉴定――特性研究5.实验数据及其处理（1）记录平板菌落计数结果，并分析土壤微生物分布状况。（2）将你所观察到的微生物菌落特征记载入下表菌种名称培养条件菌落特征时间温度培养基形状边缘表面干湿隆起度透明度粘性光泽大小颜色（3）分别描述细菌、放线菌、霉菌、酵母菌的主要特征。

6.问题讨论（1）枯草芽孢杆菌分离方法是什么？（2）如何初步鉴定其产酶活性的高低？（3）试比较细菌与酵母菌、放线菌与霉菌的菌落形态差异。实验六基于培养介质的微生物消长的测定1.实验目的1.了解大肠杆菌的生长曲线特征和繁殖规律，并学会绘制生长曲线。2.复习光电比浊法测量细菌数量的方法。2.实验原理将一定量的细菌转入新鲜液体培养基中，在适宜的条件下培养细胞要经历延迟期、对数期、稳定期和衰亡期四个阶段。以培养时间为横坐标，以细菌数目的对数或生长速率为纵坐标作图所绘制的曲线称为该细菌的生长曲线。不同的细菌在相同的培养条件下其生长曲线不同，同样的细菌在不同的培养条件下所绘制的生长曲线也不相同。3.试剂与器材1.材料与试剂大肠杆菌、LB液体培养基70ml、分装2支大试管(5ml／支)、剩余60ml装入250ml的三角瓶。2.器材722型分光光度计、恒温振荡摇床、无菌试管、无菌吸管等。4.实验内容编号→接种→培养→比浊测定5.关键步骤及注意事项1.测定OD值时，要求从低浓度到高浓度测定2.严格控制培养时间6.思考题1.根据实验数据画出生长曲线，并说明大肠杆菌生长特征。2.如果用活菌计数法制作生长曲线，你认为会有什么不同?两者各有什么缺点7．3.次生礼谢产物的大量积累在哪个时期?根据细菌生实验七微生物遗传物质提取、测序实验1.目的要求1.了解分光光度计测定DNA含量的原理和方法。2.熟悉质粒的基本特性及质粒DNA提取的基本原理。3.掌握碱变性法提取质粒DNA的基本操作过程。2.实验原理质粒(Plasmid)是独立存在于染色体外、能自主复制并能稳定遗传的一种环状双链DNA分子，分布于细菌、放线菌、真菌以及一些动植物细胞中，但在细菌细胞中含量最多。细菌质粒大小介于1～200Kb之间，是应用最多的质粒类群，在细菌细胞内它们利用宿主细胞的复制机构合成质粒自身的DNA。质粒DNA具特定的形态结构，在特殊的环境条件下，如加热、极端pH值、有机溶剂、尿素、酰胺试剂等会导致质粒DNA变性，去除变性条件又可以使DNA复性。SDS是一种阴离子表面活性剂，它既能裂解细菌细胞，又能使细菌蛋白质变性。所以，SDS处理细菌细胞后会导致细菌细胞壁破裂，从而使质粒DNA及细菌基因组DNA从细胞中同时释放出来。释放出来的DNA遇到强碱性（NaOH）环境就会变性。然后，用酸性乙酸钾中和溶液碱性使溶液处于中性，质粒DNA将迅速复性，而染色体DNA由于分子巨大在短时间内难以复性。离心后，质粒DNA将留在上清中，染色体DNA则与细胞碎片一起沉淀到离心管的底部。通过这种方法即可将质粒DNA从细菌中提取出来。测定DNA浓度的方法有两种：一是利用分光光度计法测定DNA的紫外光吸收值；一是利用溴化乙锭荧光强度法测定样品中溴化乙锭发射的荧光强度来计算核酸的含量。（1）紫外光吸收法：因为组成核酸的碱基在260nm处具有强吸收峰，所以通过测定260nm处的吸收峰即可对DNA进行定量。一般在中性pH环境条件下进行测定，此方法常用于测定比较纯净的DNA样品。（2）溴化乙锭荧光强度法：溴化乙锭能与DNA结合并嵌入双链中，当受紫外光照射时会激发产生荧光，且荧光的强度与DNA含量成正比。3.实验准备一、器材1.电泳仪（包括直流电源整流器和电泳槽两部分）2.台式离心机与高压灭菌锅3.超净工作台、摇床和各式加样枪二、试剂1.溶液Ⅰ50mmol/L葡萄糖10mmol/LEDTA，20mmol/L20mMTris-HClpH8.0100mg/mlRNaseA（抽质粒时现加）溶液Ⅰ可成批配制，每瓶约100ml，在10lbf/in2（6.859×104Pa）高压下蒸汽灭菌15分钟，40C冰箱贮存（注：不能将RNaseA加入溶液Ⅰ中一起灭菌，RNaseA用时现加）。2.溶液Ⅱ0.2mol/LNaOH（临用前用10mol/LNaOH贮存液现用现稀解）1%SDS（临用前用10mol/LSDS贮存液现用现稀解）3.溶液Ⅲ60mL

5mol/L醋酸钾，5ml

冰醋酸，28.5mL

H2O4.TE缓冲液10mmol/LTris-HCl,1mmol/LEDTA（pH8.0）5.100%乙醇，70％乙醇6.上样缓冲液(6×)：0.25%溴酚兰，40％(W/V)蔗糖水溶液或30％的甘油7.5×Tris-硼酸（TBE）缓冲液445mmol/LTris碱，445mmol/L硼酸盐，10mmol/LEDTA称取54gTris碱、27.5g硼酸溶于500ml蒸馏水中，加入20ml的0.5mol/LEDTA（pH8.0）混匀，补加蒸馏水至1000ml，40C冰箱贮存。8.5×Tris-乙酸（TAE）缓冲液2mol/LTris碱，1mol/L乙酸，100mmol/LEDTA称取242gTris碱溶于500ml蒸馏水中，加入57.1ml冰乙酸（17.4mol/L）及200ml0.5mol/LEDTA（pH8.0）混匀，补加蒸馏水至1000ml，40C冰箱贮存。

三、材料1.含有质粒大肠杆菌2.琼脂糖【实验操作】一、质粒DNA的提取1.培养细菌：将带有质粒的大肠杆菌接种到液体培养基中，37℃2.取3ml细菌培养液（分2次，每次1.5ml）于Eppendorf管中，10，000×g离心1分钟，弃上清液（尽可能完全）；3.加入100ul冰预冷的溶液Ⅰ，剧烈振荡使细胞完全重悬；4.加入200ul新配制的溶液Ⅱ，快速颠倒4次，轻轻混合，将离心管放置于冰上；5.加入150ul冰预冷的溶液Ⅲ，温和振荡10秒钟使溶液Ⅲ均匀地分散在细菌裂解物中，置冰浴放置3～5分钟；6.12，000×g离心5分钟，将上清液移入另一离心管中；7.加等量酚：氯仿，振荡混匀，用台式高速离心机，10000r/min离心7min，上清移入另一干净离心管；8.加2倍体积的100％乙醇混匀，于室温净置5分钟沉淀双链DNA；9.用台式高速离心机

于40C、12000r/min离心5min；10.小心倒弃上清，将离心管倒置于滤纸上将剩余液体滴尽；11.用1ml70％乙醇于40C洗涤双链DNA沉淀，按步骤11去上清，在空气中使沉淀干燥10分钟；12.取50ul含胰RnaseA（20ug/ml）无Dnase的TE重新溶解质粒DNA，于-200C冰箱贮存备用。二、质粒DNA含量测定1.取2ul提取的质粒DNA，加入98ul蒸馏水对待测DNA样品进行1:50倍(或更高倍数的稀释);1、

蒸馏水作为空白,在波长260nm、280nm处调节紫外分光光度计读数至零。4.加入DNA稀释液，测定260nm及280nm的吸收值。260nm读数用于计算样品中核酸的浓度，OD260值为1相当于约50mg/ml双链DNA，33mg/ml单链。可根据在260nm以及在280nm的读数的比值（OD260/OD280）估计核酸的纯度。一般DNA的纯品，其比值为1.8，低于此值说明有蛋白质或其它杂质的污染5.记录OD值，通过计算确定DNA浓度或纯度，公式如下:2、

dsDNA=50×(OD260)×稀释倍数（注：浓度单位为mg/ml）三、质粒DNA的琼脂糖电泳

1.琼脂糖凝胶的制备:称取05g琼脂糖，置于三角瓶中，加入50mlTBE或TAE工作液，瓶口倒扣一个小烧杯等，将该三角瓶置于微波炉加热至琼脂糖溶解。

2.胶板的制备:取有机玻璃内槽，洗净、晾干；取纸胶条(宽约1cm)，将有机玻璃内槽置于一水平位置模具上，放好梳子。将冷却至65℃左右的琼脂糖凝胶液，小心地倒入有机玻璃内槽，使胶液缓慢地展开，直到在整个有机玻璃板表面形成均匀的胶层。室温下静置30min左右，待凝固完全后，轻轻拔出梳子，在胶板上即形成相互隔开的上样孔。制好胶后将铺胶的有机玻璃内槽放在含有0.5～1×

3.加样:用微量加样器将上述样品分别加入胶板的样品孔内。每加完一个样品，换一个加样头。加样时应防止碰坏样品孔周围的凝胶面以及穿透凝胶底部，本实验样品孔容量约15～20ul。在第一个上样孔或最后一个上样孔内加入6ul的1kbDNAladder（50ng/ul）。

4.电泳（带上手套操作）:加完样后的凝胶板即可通电进行电泳；建议在80～100V的电压下电泳；当溴酚兰移动到距离胶板下沿约1cm处停止电泳；将凝胶放入溴化乙啶（EB）工作液（0.5ug/ml左右）中染色约20min。为了获得电泳分离DNA片段的最大分辨率，电场强度不应高于5V/cm（两电极间的距离）。电泳温度视需要而定，对大分子的分离，以低温较好，也可在室温下进行。在琼脂糖凝胶浓度低于0.5%时，由于胶太稀，最好在4℃

5.观察与拍照:在紫外灯(310nm波长)下观察染色后的凝胶。DNA存在处显示出红色的荧光条带。紫外光激发30s左右，肉眼可观察到清晰的条带。在紫外灯下观察时，应戴上防护眼镜或有机玻璃防护面罩，避免眼睛遭受强紫外光损伤。拍照电泳图