基因工程性综合性实验一　龙须菜中半乳糖磷酸尿苷酰转

《基因工程》探索性综合性实验一龙须菜中半乳糖-1-磷酸尿苷酰转移酶(Galactose-1-phosphateuridylyltransferase，GPU）基因拷贝数的确定背景情况介绍

Division:

Rhodophyta

Class:

Rhodophyceae

Sub-class:

Florideae

Order:

Gigartinales

Family:

GracilariaceaeTGTAGCCAAAGCTGTGCGTGGAAAATGTCGCGTTGTCTGCTTCTCCCCGAAGCTCAACCTAACTGTCGCTGAAATGGCCGTCAAGGAGATCAAGGCCGTTGTTGATGCCTGGGTTGAGGAGTATGACACCCTCTCCAAGCTCGATTACATCGGCCACGTGCAGATCTTCGAGAACAAGGGACAGATGATGGGATGCTCCAACCCTCATCCTCACGGTCAGATCTGGGCATCTGAGTTCGTTCCAGAAGAGCCGCGCATCGCACTCGCCAATCTCAAAGCCTATCACACTAAGAAGGGAACCCACATGTTGGAGGACTACGTCAAACTCGAAATGGAAGCAAAGGAACGTATCGTATGTCAGAAT该基因已克隆于pMD18T质粒载体上，长度为364bp，现可提供含有该质粒的甘油菌JM109实验过程要求

根据题目通过网络和杂志查阅文献，提交实验准备报告，内容包括。题目名称、原理、技术路线、具体实验步骤、需要使用的试剂（溶液）名称及其具体配制方案、其它需要使用的消耗材料（需要器皿清单）注意事项：独立完成

实验原理基因组DNA用多种不同的限制性内切酶酶切，用GPU基因探针杂交，若有多拷贝，则应有多个杂交带，若多数酶切结果显示单一条带则为单拷贝。

技术路线

总DNA提取酶切GPU基因探针杂交显示

SouthernBlot原理探针标记（Random）实验材料和试剂（/组）

红藻2.5g；CTAB缓冲液5ml；酚/氯仿/异戊醇抽提液2ml；10T/1E1ml；10T/0.1E1ml；3M醋酸钠溶液1ml变性液20ml；中和液40ml；转移液100ml；洗膜液I10ml；洗膜液II10ml；缓冲液I100ml；缓冲液II20ml；缓冲液III20ml；显色液10ml；缓冲液IV30ml实验步骤骤1、红藻藻总DNA的提提取称取2.5g藻藻，加1~2ml/gCTAB缓冲液液（勿忘加加巯基乙乙醇），加2gPVPP固固体，在在冰浴中中用力充分研磨磨（大约约半小时时）。然然后转移移于塑料料离心管管中在60-65℃℃温浴浴30min，不不时颠倒倒混合，，加蛋白白酶K(10mg/ml)至至终浓度度100g/ml，50℃3h，不不时颠倒倒混合，，用等体体积酚:氯仿:异戊醇醇（25:24:1））（取下层有有机相）抽提（颠颠倒混合合）10min，12000rpm离离心5min，，取上清清，用氯氯仿抽提提5min，，12000rpm离心心5min。。取上清清液，加加入2/3体体积的的异丙醇醇，颠倒倒混合，，在-20℃℃下沉沉淀15min，，再于室室温12000rpm离离心15min，祛除除上清，，用1ml70%乙乙醇洗洗沉淀，，12000rpm离心心15min，祛祛除上清清，空气气干燥沉沉淀。37℃下下，把把核酸溶溶在100-200lTE1（10mMTris-Hcl，，pH8.0，1mMEDTA）10min，，14000rpm离心心5min。在不不干扰沉淀的情况下下，把上上清液移移到新的的微量管管中，加加RNase(10mg/ml)至至终浓度度100g/ml，37℃消化化30min，酚-氯仿仿抽提后后，加1/10体体积3M醋酸钠钠和2倍体体积的的-20℃无无水乙醇醇，立即即离心使使DNA沉淀，，用70%的的-20℃℃乙醇醇洗涤沉沉淀DNA，空空气干燥燥，把DNA溶溶在50lTE2（10mMTris，pH8.0，，0.1mMEDTA））。2、取5l龙须须菜总DNA制制品加1/10体积载载样缓冲冲液做电电泳检测测，并加加5l分子量量对照，，目测定定量。3、用3~4种种（每组组选择一一种）限限制性内内切酶酶酶切5g/种，，一般20l酶切体体系/1gDNA（见见说明书书）,等等量放放大。完完全酶切切过夜后后于80v1.0%琼脂糖糖凝胶电电泳1h，并加加5l分子子量对对照。。记录录Marker各条条带及及样品品位置置，做做Southern转迹迹。4、探探针的的制备备和标标记对提取取的含含目的的基因因的质质粒，，按试试剂盒盒说明明标记记探针针及检检测标标记率率，按按试剂剂盒操操作说说明P13表准准备标标记探探针和和对照照，管管2~9各各1l点点于膜膜上，，膜自自然晾晾干，，80℃烘烘烤2h，，进行行显色色操作作。探探针稀稀释到到终浓浓度10ng/l。5、SouthernBlot：将凝胶胶放入入培养养皿中中，加加入20ml变性液液（没没过凝凝胶）），摇摇动变变性1h，倾去去变性性液，，用蒸蒸馏水水漂洗洗一次次；换换中和和液20ml，摇动动1h，之间间更换换一次次中和和液；；在电电泳槽槽内加加适量量转移移液20XSSC，中间间支架架放一一滤纸纸条，，滤纸纸两端端浸没没在20XSSC中，滤纸与与支架架间不不能有有气泡泡，取出中中和的的凝胶胶，点样孔孔朝下下倒扣于于滤纸纸上，，用玻玻璃棒棒滚动动去除除胶与与滤纸纸的气气泡，，剪一一张与与胶大大小相相同的的NC膜，放放在无无菌蒸蒸馏水水表面面，使使之自自然吸吸水下下沉，，将膜膜转入入20XSSC中浸泡泡5min，将湿湿润的的膜盖盖在凝凝胶上上面，，膜一一经与与凝胶胶接触触，不不可再再移动动；将将两张张与膜膜大小小相同同的滤滤纸置置2XSSC溶液中湿润润，盖在膜膜上，排除除气泡，滤滤纸上放一一叠与膜大大小相同的的吸水纸（（高8~10cm），吸水纸纸上压0.5~1kg重物，转移移12h。6、转移后后，在膜上上做标记，，紫外检测凝凝胶转移效效果，膜自然晾晾干，80℃烘烤2h。7、膜的预预杂交、杂杂交和显色色。37~42℃预热DigEasyHyb，以1.2ml/12cm2量添加该液液，封膜，，预杂交30min。探针100℃5min变性后迅速置于0℃，倾去去预杂交液液，以0.42ml/12cm2膜量加新预预杂交液，，添加10ng变性性标记探针针，封膜，，42℃杂杂交过夜或或68℃6h水浴浴震荡。杂交完成后后倒出杂交交液，将膜膜放入小烧烧杯中加5ml洗涤涤液液I，rt洗涤涤5min，重重复复一一次次，，倒倒出出洗洗涤涤液液，，加加5ml洗涤涤液液II，68℃洗洗涤涤15min，重重复复一一次次，，取取出出膜膜于于滤滤纸纸上上，，空空气气干干燥燥。。(以以下下为为显显色色过过程程)膜于于小小烧烧杯杯中中加加5ml缓缓冲冲液液I，，洗洗涤涤1min，，倒倒去去缓缓冲冲液液I，，加加10ml缓缓冲冲液液II，，rt放放置置30min，，倒倒去去缓缓冲冲液液II，，家家5ml缓缓冲冲液液I，，洗洗涤涤30s，，取取出出膜膜置置于于培培养养皿皿内内，，以以5ml含含<Dig>Ap结结合合物物的的缓缓冲冲液液I/50cm2膜量量（（内内含含<Dig>Ap抗抗体体1l））添添加加，，rt30min，，取取出出膜膜置置于于小小烧烧杯杯中中，，加加10ml缓缓冲冲液液I，，洗洗涤涤15min，，重重复复一一次次，，倒倒去去缓缓冲冲液液I，，加加缓缓冲冲液液III1.25ml，，放放置置2min，，（（配制显显色液液）倾去缓缓冲液液III，，加5ml显色色液，，置于于暗中中静止止待显显色，，显色色结束束取出出膜加加3ml缓缓冲液液IV，洗洗涤5min，，空气气干燥燥。实验注注意事事项：：有毒害害物质质及其其处理理（巯基基乙醇醇、EB、、苯酚酚/氯氯仿））设备（紫外外透射射仪、、离心心机））统筹兼兼顾、、提前前设计计实验周周期：：4~5天天实验报报告：：实验验原理理、步步骤、、结果果与讨讨论、、建议议。《基因因工程程》探探索性性综合合性实实验二二龙须菜菜、真真江蓠蓠、扁扁江蓠蓠亲缘缘关系系研究究分布GracilariaverrucosaIndonesiaGracilariaverrucosaItalyGracilariaverrucosaJapanGracilariaverrucosaKorea,NorthGracilariaverrucosaKorea,SouthGracilariaspp.ItalyGracilariaspp.MalaysiaGracilariaspp.PortugalGracilariaspp.ThailandGracilariaspp.VietnamGracilariatenuistipitatavar.liuiChinaGracilariatenuistipitatavar.liuiPhilippinesGracilariatenuistipitatavar.liuiThailandGracilariatenuistipitatavar.liuiVietnamGracilariaverrucosaArgentinaGracilariaverrucosaEgyptGracilariaverrucosaFranceGracilariaheterocladaPhilippinesGracilariaheterocladaVietnamGracilariahoweiPeruGracilarialemaneiformisJapanGracilarialemaneiformisMexicoGracilarialemaneiformisPeruGracilarialongaItalyGracilariapacificaCanadaGracilariaparvisporaUnitedStatesofAmericaGracilariasalicorniaThailandGracilariasalicorniaVietnamGracilariaspp.BurmaGracilariaasisaticaChinaGracilariaasisaticaVietnamGracilariabursa-pastorisJapanGracilariacaudataBrazilGracilariachangiiThailandGracilariachilensisChileGracilariachilensisNewZealandGracilariacorneaBrazilGracilariacorneaCaribbeanGracilariacoronopiferaUnitedStatesofAmericaGracilariacoronopiferaVietnamGracilariacrassissimaCaribbean根据NCBI数数据库库登录录的红红藻基基因序序列，，采用用rDNA转录录间隔隔区ITS1和和ITS2进行行亲源源关系系的研研究。。实验原理技术路线设计引物总DNA提取取或裂解藻藻细胞PCR回收目的片片段TA克隆转化测序分析实验过程要要求同前真核生物rDNA结构单元SSUrDNAandITS*Curdiea/Melanthalia*Gracilariopsis/Gracilariophila:^Atlanticspecies*Gracilaria:^Atlanticcylindricalhenriquesiana/^gracilis/^domingensiscladesITS1:Pacific/Atlantic/cylindricalhenriquesianalineage/gracilislineage/flattedorcompressedAtlanticspecies-lowbootstrapvalueITS2:tikvahiaelineage-compressedtoflattedformswith“textorri””typespermatangiaandsimilarmorphology/cervicornislineage-lowbootstrap/flattedribbon-likespeciesPCR技术术原理循环

denature94C30SannealingTm-5C

elongate72C

cycle25-35实验材料和试试剂（/组）红藻2.5g；CTAB缓冲液5ml；LB固体培养基100ml；LB液体培养基50ml；0.75mMCaCl220ml；预先准备冰冰浴，研钵，，60-65℃水浴/50℃水浴实验步骤1、红藻总DNA的提取取-同前2、PCR反反应及感受态态制备准备：：合成引物以ddH2O按说明配制制成50pmol/l。在25l反应体系中中按如下量和和条件进行行PCR反应应：10XPCRBuffer2.5l,10mMdNTP1l,primers0.5leach,25mMMg2+3l,Temp2l,Tag0.1l,以ddH2O补充终体积积，液面加25l石蜡油;94C10min,94C1min1min,50C1min30s,72C2min,30circle。现有两对引物物pair1（SNria和ASria）和pair2（（SNria和ASsis），对龙龙须菜可选用用任何一对引引物，但对另另外两种红藻藻，只能用pair1。。要求5组混合合后分装（下下有PCR反反应时同），，各组分别加加模板。PCR结束后后取5l加1/6体体积载样缓冲冲液，电泳检检测,加分子子量对照。（4人/组））扩增长度与与设计一致（（应为>1500bp）），则相同条条件扩大至3X50l，反应完成成后，汇合，，取5l加1/6体体积载样缓冲冲液，电泳检检测，其余以以150l氯仿抽提，，2倍体积无无水乙醇沉淀淀过夜。固体LB培养养基上划线培培养DH5。挑取单菌落接接种于3mlLB/10ml管中，，370C震荡培养，，12-16h。3、感受态的的制备：过夜培养细菌菌按1%转接接量接种于20mlLB/100ml三角瓶中中X2，370C震荡培养2-3h,至至对数前期，，外观微浊，，00C，冰浴30min，无无菌条件下，，取1.5ml培养物于于Ep管中，，12000rpm离心心2min，去上清清，加750l0.75mMCaCl2悬浮，00C，冰冰浴15min，12000rpm离离心2min，，去上上清，，加100l0.75mMCaCl2悬浮，，00C，冰冰浴1-2h，，为感感受态态细胞胞。4、制制备1.0%琼琼脂糖糖回收收胶（（梳齿齿以胶胶带黏黏附合合并）），前前述2沉淀淀以12000rpm离离心10min,去去上清清，以30lTE溶溶解，，加1/6体积积载样样缓冲冲液电电泳，，按““DNA回回收试试剂盒盒”说说明回回收条条带。。5、按按“pMD18T载载体””试剂剂盒说说明进进行回回收片片段与与载体体的连连接，，其中中pMD18T载体体用0.5l，连连接液液(solutionI)用5l，总总连接接体积积10l。6、转转化：：将连接接产物物加入入上述述感受受态细细胞中中，混混匀，，冰浴浴30min，放放入420C水浴中静置置60s,取出，冰浴浴1min，，加入800lLB培养养基，370C震荡培养养，45min，15,000rpm离心1min,去去700l上清,各取取100l涂布固体LB(Amp终浓度100g/ml)平板，共两两个，370C培养过夜夜。7、重组体检检测：以牙签挑取单单菌落转接加加Amp保存存母板（每大大组准备一个个保存母板，，加Amp，，并在平板背背面划格分割割），同时在在通用引物进进行的PCR检测管中洗洗涤牙签以加加入模板（整整个菌体为模模板），检测测插入片段的的长度，在20l反应体系中中按如下量和和条件进行PCR反应：：10XPCRBuffer2.5l,10mMdNTP0.4l,primers(U1/U2)0.1leach,25mMMg2+2.4l,Tag0.1l,以ddH2O补充终体积积，液面覆盖盖石蜡油;94C10min,94C1min30s,50C1min30s,72C1min30s,30circle。要求5组组混合后分装装，各组分别别加模板。8、电泳检测测插入长度正正确的（1600~1700bp）），在3ml含Amp的LB培养养基中培养过过夜，取0.85ml培培养菌液，加加终浓度15%甘油，混混合后送测序序。9、序列同源性分分析。软件：Clustal/Macaw实验注意事项项：前述PCR反应的的均一性无菌操作实验周期：4~7天实验报告：实实验原理、步步骤、结果与与讨论、建议议。9、静静夜夜四四无无邻邻，，荒荒居居旧旧业业贫贫。。。。12月月-2212月月-22Friday,December23,202210、雨雨中中黄黄叶叶树树，，灯灯下下白白头头人人。。。。05:57:0905:57:0905:5712/23/20225:57:09AM11、以以我我独独沈沈久久，，愧愧君君相相见见频频。。。。12月月-2205:57:0905:57Dec-2223-Dec-2212、故故人人江江海海别别，，几几度度隔隔山山川川。。。。05:57:0905:57:0905:57Friday,December23,202213、乍见见翻疑疑梦，，相悲悲各问问年。。。12月月-2212月月-2205:57:0905:57:09December23,202214、他乡乡生白白发，，旧国国见青青山。。。23十十二二月20225:57:09上上午05:57:0912月月-2215、比不了了得就不不比，得得不到的的就不要要。。。十二月225:57上午午12月-2205:57December23,202216、行动出出成果，，工作出出财富。。。2022/12/235:57:1005:57:1023December202217、做前，能够够环视四周；；做时，你只只能或者最好好沿着以脚为为起点的射线线向前。。5:57:10上午5:57上上午05:57:1012月-229、没有有失败败，只只有暂暂时停停止成成功！！。12月月-2212月月-22Friday,December23,202210、很很多多事事情情努努力力了了未未必必有有结结果果，，但但是是不不努努力力却却什什么么改改变变也也没没有有。。。。05:57:1005:57:1005:5712/23/20225:57:10AM11、成成功功就就是是日日复复一一日日那那一一点点点点小小小小努努力力的的积积累累。。。。12月月-2205:57:1005:57Dec-2223-Dec-2212、世间成事事，不求其其绝对圆满满，留一份份不足，可可得无限完完美。。05:57:1005:57:1005:57Friday,December23,202213、不知知香积积寺，，数里里入云云峰。。。12月月-2212月月-2205:57:1005:57:10December23,202214、意志志坚强强的人人能把把世界界放在在手中中像泥泥块一一样任任意