Q-PCR讲解解读课件

唯我所欲、精准溯源—qPCR实验解析

北京全式金生物技术有限公司唯我所欲、精准溯源北京全式金2qPCR技术绝对定量VS相对定量一步法VS两步法qRT-PCR概述核酸提取cDNA

合成(两步法

qRT-PCR)引物设计方法和原则样品准备必要的对照、内参、标准选择相应的荧光检测方法试剂选择实验设计分析扩增曲线、溶解曲线和标准曲线实验常见问题分析数据分析2qPCR技术概述核酸提取样品准备必要的对照、内参、标准实验3qPCR基本概念3qPCR基本概念4常规PCR与实时荧光定量PCR常规PCR：借助电泳对扩增反应的终产物进行半定量及定性分析实时荧光定量PCR技术：利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，最终对起始模板进行精确的定量分析4常规PCR与实时荧光定量PCR常规PCR：借助电泳对扩增反5荧光定量PCR仪器工作原理激发光发射源接收装置PCR反应模块5荧光定量PCR仪器工作原理激发光发射源qPCR参数:扩增曲线扩增曲线、标准曲线反映qPCR重要指标qPCR参数:扩增曲线扩增曲线、标准曲线反映qPCR重要qPCR参数:溶解曲线溶解曲线(下左):温度和荧光值的关系，在扩增结束后进行处理后溶解曲线

(下右):温度和荧光值的关系，并取其导数，更为常用应用:指示特异性，最为理想的为单峰；如出现多峰证明反应不特异或存在引物二聚体确认反应特异性，增加数据可信度qPCR参数:溶解曲线溶解曲线(下左):温度和荧光值的qPCR的数学原理理想的PCR反应：Xn=X0×2n非理想的PCR反应：Xn=X0(1+Ex)n方程式两边同时取对数得: logXn=log(X0(1+Ex)n) 整理方程式得: logX0=(-log(1+Ex))×n+logXn将C(t)和达到C(t)值时终产物的量Xc(t)带入上式得：

logX0=(-log(1+Ex))×C(t)+

logXc(t)

初始浓度的对数与循环数呈线性关系n：扩增反应的循环次数Xn：第n次循环后的产物量X0：初始模板量Ex：扩增效率qPCR的数学原理理想的PCR反应：n：扩增反应的循环次数9MIQEqPCR国际标准提出发表文章时所要求的最低限度的必要信息标准。对qPCR的术语；概念；研究与临床应用；样本的采集、处理和制备；核酸的质量控制；反转录；qPCR过程；数据分析等方面的操作标准和规范都做了详尽的阐述。9MIQEqPCR国际标准提出发表文章时所要求的最低限度的10qPCR常用定量方式10qPCR常用定量方式qPCR常用实验方法TaqMan®/TaqMan-MGB®

MolecularBeaconSYBRGreenIMGBEclipseTMProbesScorpionsTMOthers...qPCR常用实验方法TaqMan®/TaqMan-MGqPCR常用实验方法简单成本较低适用于多重PCR特异性较好可进行SNP检测特异性非常好qPCR常用实验方法简单适用于多重PCR可进行SNP检测荧光标记方法选择医疗检验TaqMan探针法特异准确科研SYBR方法便宜方便TaqMan探针法要求严格的相对定量荧光标记方法选择医疗检验14常用定量方法——相对定量vs绝对定量14常用定量方法绝对定量微生物检测：病毒拷贝数转基因检测：转基因拷贝数相对定量（差异）基因表达差异绝对定量16qPCR常用试验方法绝对定量标准曲线由已知浓度的RNA、质粒或合成的寡核苷酸链生成；定量未知模板；标准样品和未知样品必须同时反应；相对定量

∆∆CTMethod：使用内参基因定量所研究样品和参照样品的目的基因；参照样品基因与目的基因可以同时反应，也可以单独反应；双标准曲线法：对每个样品的内参基因和目的基因都做绝对定量，求出每个样品中内参基因和目的基因的绝对数量，然后根据相对定量的基本公式来求出目的基因的差异表达；16qPCR常用试验方法绝对定量绝对定量由标准品计算未知样品的拷贝数绝对定量由标准品计算未知样品的拷贝数利用管家基因校正并计算目的基因倍数关系相对定量利用管家基因校正并计算目的基因倍数关系相对定量一步法vs两步法qPCR一步法vs两步法qPCRqRT-PCR

实验条件RNAOneStepRT-PCR(Onetube)TwoStepRT-PCR(Twotubes)AmpliconAmpliconcDNAGeneSpecificprimersOligodTRandomPrimers可进行PCR或qPCR需要基因特异性引物高通量使用同类的RNA(i.e.singlecell)

适合从大量的RNA样本中得到少量基因（数目）的信息

先进行cDNA合成再进行PCR高效的第一链合成可为下游实验提供cDNA适合从少量的RNA样本中得到大量基因（数目）的信息根据试验情况进行选择qRT-PCR实验条件RNAOneStepRT-PCR21qPCR技术绝对定量VS相对定量一步法VS两步法qRT-PCR概述核酸提取cDNA合成(两步法

qRT-PCR)引物设计方法和原则样品准备必要的对照、内参、标准选择相应的荧光检测方法试剂选择实验设计分析扩增曲线、溶解曲线和标准曲线实验常见问题分析数据分析21qPCR技术概述核酸提取样品准备必要的对照、内参、标准实22核酸提取RNA提取TransZolTransZolUpTransZolPlantEasyPureRNAKitEasyPureViralDNA/RNAKitEasyPurePlantRNAKitEasyPureBloodRNAKitTransZolUpPlusRNAKitEasyPuremiRNAKit好的qPCR结果来源于高质量的模板DNA提取BloodZolPlantZolEasyPureGenomicDNAKitEasyPurePlantGenomicDNAKitEasyPureBloodGenomicDNAKitEasyPureMarineGenomicDNAKitEasyPureBacteriaDNAKit22核酸提取RNA提取TransZol23cDNA合成(两步法qRT-PCR)好的qPCR结果依赖于成功的cDNA合成反转录cDNA影响qPCR敏感度全长cDNA合成增加qPCR成功率引物Oligo(dT):只识别mRNA，合成cDNA序列靠近3’随机引物:随机合成序列，可能合成非编码RNA，造成定量结果高估两者混合结合两者优点23cDNA合成(两步法qRT-PCR)好的qPCR结果24绝对定量和相对定量实验要求24绝对定量和相对定量实验要求25绝对定量模板尽可能选择与目的基因序列相同以保证扩增效率相同来源质粒DNA纯化PCR产物

ReferenceDNA(genomicDNA)精度每次加样要保证在2μl以上，减少误差梯度至少3个点，最好5个点25绝对定量模板26相对定量内参基因选择内参基因的作用检测样本材料中RNA是否降解纠正样本加样的差异校正cDNA合成速率差异校正PCR抑制剂的影响常用内参基因

GAPDHβ-actin18SrRNA选择

不同的物种选择不同的内参基因，有时候可选择组合内参基因。26相对定量内参基因选择内参基因的作用27引物设计方法和原则27引物设计方法和原则维基百科/google输入待查基因名称选择物种mRNA找出目的mRNA输入要查找的蛋白或是基因名称NCBICOPY名称到NCBI重新检索文献目的mRNA序列或序列号Real-TimePCR引物序列Blast确定引物特异性引物设计维基百科/google输入待查www.ncbi.nlm.ni29网络免费设计软件Primer3（primer3.ut.ee）

引物和双标记水解探针的设计Tm的计算MFold（）

引物和扩增产物二级结构的预测

二级结构的稳定性(deltaG)和融解温度(Tm)BLAST（/）

结构特异性29网络免费设计软件Primer3（primer3.ut.e30SYBR引物设计原则SYBR-Green引物引物长度18-30bps，产物长度范围100~400bpG/C含量:40-60%避免引物内含有互补序列(尤其是3’端)避免3’端错配3’端不能出现连续三个以上的G或C避免3’端出现T碱基设计跨内含子引物30SYBR引物设计原则SYBR-Green引物31TaqMan探针和引物设计TaqMan探针Tm值比引物高10℃没有连续相同的碱基

探针位置尽可能地靠近上游引物C远远多于G5‘端没有GTaqMan引物

Tm(58-60℃)15-30basesinlength

G+C含量30-80%不要有连续4个G3’端不能有连续两个以上的G+C5‘端不要有G(AorCpreferred)引物之间的TM相差避免超过2℃扩增长度50-150bp(max400)引物跨越内含子31TaqMan探针和引物设计TaqMan探针Tm值比引物32qPCR技术绝对定量VS相对定量一步法VS两步法qRT-PCR概述核酸提取cDNA合成(两步法

qRT-PCR)引物设计方法和原则样品准备必要的对照、内参、标准选择相应的荧光检测方法试剂选择实验设计分析扩增曲线、溶解曲线和标准曲线实验常见问题分析数据分析32qPCR技术概述核酸提取样品准备必要的对照、内参、标准实33对照设置33对照设置34对照设置阴性对照Negativecontrol:Notemplate(NTC)Use:检验是否有模板污染Noreversetranscriptase(NRT):Use:检验RNA样品中是否有DNA污染Noamplificationcontrol(NAC):Use:检验是否有聚合酶污染Noprobecontrol(NPC):Use:检验荧光污染Buffer:OnlycontainsbufferUse:检验背景荧光阳性对照Calibrator:可以用带有PCR扩增子的合成的RNA或cDNA寡核苷酸；质粒DNA；克隆到质粒的cDNA；体外反转录的RNA；ReferenceRNApools；来自于特定的生物体样本的RNA或DNA及国际上公认的生物学标准物。Standardcurve34对照设置阴性对照35定量方式选择35定量方式选择36定量方式选择SYBRGreen适用-特异性要求不是特别高的反应，分子数（拷贝数）超过1000的反应-探针实验前，进行预实验-PCR条件非常成熟，无二聚体，无非特异扩增TaqMan适用-特异性要求较高的实验-多重PCR（标记不同的荧光基团）-SNP-灵敏度要求较高的实验36定量方式选择SYBRGreen适用标准曲线法和∆∆Ct法

相对定量方法基因表达差异目的基因，内参基因∆∆Ct只依靠Ct值用于大通量（很多基因，如芯片结果）计算简单估计性的结果要求目的基因和内参基因扩增效率都比较好双标准曲线法结果精确对扩增效率要求不高构建目的基因与内参基因的标准品相当于两个绝对定量每次反应都要作标准曲线标准曲线法和∆∆Ct法相对定量方法双标准曲线法双标准曲线法用目的基因和内参基因的标准品分别获得标准曲线处理与未处理样品同时扩增目的基因和内参基因，获得C(t)值通过标准曲线计算目的基因和内参基因的绝对拷贝数用内参基因对目的基因均一化均一化之后的目的基因值相比得出处理与未处理的样本中目的基因的表达差异双标准曲线法双标准曲线法39实例分析39实例分析相对定量实例实验目的：

比较病毒刺激细胞后，细胞抗病毒基因ISG54的表达情况差异。样品：病毒刺激细胞，对照细胞试剂：

TransZolUp、TransStart

TopGreenqPCRSuperMix、

TransScriptTM

IIFirst-StrandcDNASynthesisSuperMix其它材料：

内参引物（GAPDH）

目的基因引物（ISG54）相对定量实例实验目的：对照样品及内参引物确定对照样本（Calibrator）

多个样本比较情况下，其中之一作为对照样本，其它所有样本中目的基因的表达都相对于对照上调或下调。确定内参基因（GAPDH或β-actin）

在所有样本中恒定表达的已知基因，该内参基因可以是一个或多个。内参基因一般是稳定表达的，但在个别物种中可能并非稳定表达，此时需选择多个内参引物。对照样品及内参引物确定对照样本（Calibrator）数据分析扩增曲线溶解曲线GAPDH内参基因数据分析扩增曲线溶解曲线GAPDH内参基因扩增曲线溶解曲线ISG54目的基因数据分析扩增曲线溶解曲线ISG54目的基因数据分析数据分析△△Ct=△Ct(实验)—△Ct(对照)△Ct(实验)=Ct（实验，目的基因）—Ct（实验，内参基因）△Ct(对照)=Ct（对照，目的基因）—Ct（对照，内参基因）2－△△Ct=2－（－3.22）=9.32病毒刺激细胞后，细胞中的ISG54抗病毒基因表达上调了9.32倍。2－△△CtTemplateAssayCt(dRn)对照细胞GAPDH18.20病毒刺激细胞GAPDH18.22对照细胞ISG5426.84病毒刺激细胞ISG5423.64数据分析△△Ct=△Ct(实验)—△Ct(对照)2如何制作标准品以Adeasy腺病毒质粒为例：

一个质粒MW=36820bp×2×330=2.43×1072.43×107g/mol6.023×1023个分子/mol=4.03×10-17g一个质粒(1copy)的质量=拷贝数1031041051061071081091010标准质粒质量4.03x10-144.03x10-134.03x10-124.03x10-114.03x10-104.03x10-94.03x10-84.03x10-7-计算出拷贝数（copies/ul）-梯度稀释制作标准品（大体积稀释10μlto90μl）-定量PCR，检查Ct值差异-产物跑胶鉴定大小如何制作标准品一个质粒(1copy)的质量=拷贝数103如何计算扩增效率使用标准曲线确定引物扩增效率Y=-3.488×logX+55.03R2=0.999E=93.5%E=10(-1/slope)－1如何计算扩增效率使用标准曲线确定引物扩增效率Y=-3.488利用TaqMan法研究ERBB2在正常或乳腺肿瘤组织标本中的表达差异已知在50%的乳腺肿瘤样本中，ERBB2表达异常，因此可以作为一个检测标准选用GAPDH作为内标基因FAM标记的ERBB2探针VIC标记的GAPDH探针构建标准曲线双重PCR反应阴性对照无RNA对照（空白）无逆转录酶对照（基因组）实例分析-2利用TaqMan法研究ERBB2在正常或乳腺肿瘤组织标本中标准曲线Color2-VICdetectionforGAPDHColor1–FAMdetectionforERBB2标准曲线Color2-VICdetectionfo样品扩增：正常vs肿瘤PMT1-FAMdetection-ERBB2PMT2-VICdetection-GAPDH肿瘤正常肿瘤正常样品扩增：正常vs肿瘤PMT1-FAMdetection-实验结果MultiplexReactions:C(t)HealthyRNACarcinoma28.4027.3628.4627.1228.43±0.0427.24±0.17ERBB2表达MultiplexReactions:C(t)HealthyRNACarcinoma23.2722.8123.4122.8623.34±0.1022.83±0.03GAPDH表达实验结果MultiplexReactions:C(t)H实验结果HealthyRNATumorRNAGAPDHERBB210951052213024929550085730136000130800Copiesng/µlTotalRNAERBB2copies/GAPDHcopies1095/95500=0.0111052/85730=0.0122130/136000=0.0172492/130800=0.019HealthyRNATumorRNA0.0110.0180.018/0.011=1.6300.81.82HealthyTissueCarc.TissueRelativeExpression实验结果HealthyTumorGAPDHERBB21095实验结果ΔΔC(t)=4.41-5.18=-0.77±0.182-ΔΔc(t)=1.51-1.93结果与双标准曲线法相近HealthyRNAERBB2GAPDHΔC(t)28.4023.275.3128.4623.415.0528.43±0.0428.34±0.105.18±0.18CarcinomaRNAERBB2GAPDHΔC(t)27.3622.814.5527.1222.864.2626.24±0.1726.83±0.034.41±0.21实验结果ΔΔC(t)=4.41-5.18=-0.77±0.153参照染料（ROX）53参照染料（ROX）参照染料选择标准化荧光信号调整非PCR因素造成的误差，如加样误差提供较稳定的基线部分仪器在使用前会使用标准化荧光信号进行校正参照染料的使用由仪器决定ABIandStratagene使用ROXBio-Rad使用标准化荧光信号Roche,Corbett,Cepheid和

MJResearch不使用内参染料使用内参染料使数据更加准确参照染料选择使用内参染料使数据更加准确55qPCR技术绝对定量VS相对定量一步法VS两步法qRT-PCR概述核酸提取cDNA合成(两步法

qRT-PCR)引物设计方法和原则样品准备必要的对照、内参、标准选择相应的荧光检测方法试剂选择实验设计分析扩增曲线、溶解曲线和标准曲线实验常见问题分析数据分析55qPCR技术概述核酸提取样品准备必要的对照、内参、标准实56判断数据有效性56判断数据有效性57用扩增曲线检验qPCR体系用融解曲线检验qPCR体系用标准曲线检验qPCR体系用No-TemplateControl(

NTC)检验qPCR体系（引物）用NoRTControl检验qPCR体系（模板）57用扩增曲线检验qPCR体系扩增曲线平滑起始无扩增起峰时间正常NTC和NRC无扩增或扩增起峰较晚CT值是判断实验成功与否的重要参考扩增曲线CT值是判断实验成功与否的重要参考Ct值的可信范围临床检验小于33科学研究小于38内参基因小于20，样品间差距不超过1复孔不超过0.5CT值是判断实验成功与否的重要参考Ct值的可信范围临床检验CT值是判断实验成功与否的重要参考60溶解曲线分析呈现单峰峰的宽度较小NTC和NRC均无较高的峰出现60溶解曲线分析呈现单峰61扩增效率r2=0.999Slope=-3.364E=10(-1/slope)－1

r2:0.95~1Slope:-3.58~-3.10E:90%~110%61扩增效率r2=0.999Slope=-3.364荧光定量PCR--NTCNTCNTC—反应是否存在污染NTC—引物是否特异，是否会形成引物二聚体NTC的最佳状况NTC的CT值为零，扩增曲线与基线重合NTC的CT值与全管反应物的CT值相差5以上或10以上荧光定量PCR--NTCNTCNTC—反应是否存在污染NT荧光定量PCR--NTC引物二聚体荧光定量PCR--NTC引物二聚体NoRTControlRT反应中的阴性对照，即不加入RT酶的反应目的：检测RNA中是否有基因组DNA的残留将NoRTControl产物与正常cDNA同时进行qPCR观察其结果，判断正常cDNA的扩增结果是否可信、该RNA是否可用NoRTControlRT反应中的阴性对照，即不加入RT荧光定量PCR标准数据参考范围数据名称参考范围Tm>80℃CT18-30cyclesR2>0.95Slope(-3.58)-(-3.10)Efficiency90%-110%NTCCT(NTC)=0CT(NTC)－CT(样品)≥5NRCCT(NTC)=0CT(NTC)－CT(样品)≥5荧光定量PCR标准数据参考范围数据名称参考范围Tm>80℃C66荧光定量PCR问题解析66荧光定量PCR问题解析67扩增曲线分析基线设置是否正确基线校准基线开始值(3-10)基线终止值（指数期之前）阈值设置是否正确设置在指数增长期(可自动或手动设置）67扩增曲线分析基线设置是否正确68扩增曲线分析初始扩增不规则主要由于模板中存在抑制物。样品扩增过早是由于初始模板浓度太高。68扩增曲线分析初始扩增不规则主要由于模板中存在抑制物。69扩增曲线分析曲线不平滑探针或荧光染料品质不好仪器使用过度，荧光收集不稳定仪器未经过校正（包括自动校正或ROX校正)体系中抑制物较多，导致荧光不稳定69扩增曲线分析曲线不平滑探针或荧光染料品质不好扩增曲线问题-精密度差加样误差，体系配置错误，反应液没有混匀。低拷贝基因或模板浓度过高或过低。未引入校正系统。扩增曲线问题-精密度差加样误差，体系配置错误，反应液没有混匀融解曲线分析分析扩增产物的特异性:单峰证明特异检测

:-基因组污染

(NTC出现与目的条带相同的峰)-非特异扩增(不同的Tm)-引物二聚体(NTC出现比目的基因Tm小的峰),…

融解曲线分析分析扩增产物的特异性:单峰证明特异72标准曲线分析可能的影响因素

1.稀释精度

2.加样精度

3.反应体系的优化

4.模板降解72标准曲线分析可能的影响因素抑制物PCR抑制物-多糖类、有机溶剂、蛋白酶K等样本质量

-A260/A280DNA:1.8

-A260/A280RNA:2.0

RT反应中的抑制物-RNA标准曲线

抑制物PCR抑制物全式金qPCR整体解决方案产品名称目录号TransZolTMET101TransZolTMUpET111TransZolTMPlantET121TransZolTMUpPlusRNAKitER501EasyPure®RNAKitER101EasyPure®PlantRNAKitER301EasyPure®ViralDNA/RNAKitER201EasyPure®BloodRNAKitER401EasyPure®miRNAKitER601全式金qPCR整体解决方案产品名称目录号TransZolTM产品名称目录号EasyScript®ReverseTranscriptaseAE101TransScript®ReverseTranscriptaseAT101TransScript®IIReverseTranscriptaseAH101EasyScript®First-StrandcDNASynthesisSuperMixAE301TransScript®First-StrandcDNASynthesisSuperMixAT301TransScript®One-StepgDNARemovalandcDNASynthesisSuperMixAT311TransScript®All-in-OneFirst-StrandcDNASynthesisSuperMixforPCRAT321TransScript®All-in-OneFirst-StrandcDNASynthesisSuperMixforqPCRAT341TransScript®IIFirst-StrandcDNASynthesisSuperMixAH301全式金qPCR整体解决方案产品名称目录号EasyScript®ReverseTra产品名称目录号TransScript®IIAll-in-OneFirst-StrandcDNASynthesisSuperMixforPCRAH321TransScript®IIAll-in-OneFirst-StrandcDNASynthesisSuperMixforqPCRAH341TransScript®IITwo-StepRT-PCRSuperMixAH401EasyScript®One-StepRT-PCRSuperMixAE411TransScript®One-StepRT-PCRSuperMixAT411TransScript®IIOne-StepRT-PCRSuperMixAH411TransScript®IIOne-StepgDNARemovalandcDNASynthesisSuperMixAH311TransScript®Two-StepRT-PCRSuperMixAT401TransScript-UniOne-StepgDNARemovalandcDNASynthesisSuperMixAU311TransScript®FlyFirst-StrandcDNASynthesisSuperMixAF301全式金qPCR整体解决方案产品名称目录号TransScript®IIAll-in-全式金qPCR整体解决方案产品名称目录号TransStart®GreenqPCRSuperMixAQ101TransStart®GreenqPCRSuperMixUDGAQ111TransStart®TopGreenqPCRSuperMixAQ131TransStart®ProbeqPCRSuperMixAQ401TransScript®Two-StepqRT-PCRSuperMixAQ201TransScript®IITwo-StepqRT-PCRSuperMixAQ301TransScript®One-StepqRT-PCRSuperMixAQ211TransScript®IIOne-StepqRT-PCRSuperMixAQ311TransScript®GreenmiRNATwo-StepqRT-PCRSuperMixAQ202TransScript®ProbeOne-StepqRT-PCRSuperMixAQ221TransScript®IIProbeOne-StepqRT-PCRSuperMixAQ321TransStart®TipGreenqPCRSuperMixAQ141全式金qPCR整体解决方案产品名称目录号TransStart谢谢！北京全式金生物技术有限公司谢谢！唯我所欲、精准溯源—qPCR实验解析

北京全式金生物技术有限公司唯我所欲、精准溯源北京全式金80qPCR技术绝对定量VS相对定量一步法VS两步法qRT-PCR概述核酸提取cDNA

合成(两步法

qRT-PCR)引物设计方法和原则样品准备必要的对照、内参、标准选择相应的荧光检测方法试剂选择实验设计分析扩增曲线、溶解曲线和标准曲线实验常见问题分析数据分析2qPCR技术概述核酸提取样品准备必要的对照、内参、标准实验81qPCR基本概念3qPCR基本概念82常规PCR与实时荧光定量PCR常规PCR：借助电泳对扩增反应的终产物进行半定量及定性分析实时荧光定量PCR技术：利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，最终对起始模板进行精确的定量分析4常规PCR与实时荧光定量PCR常规PCR：借助电泳对扩增反83荧光定量PCR仪器工作原理激发光发射源接收装置PCR反应模块5荧光定量PCR仪器工作原理激发光发射源qPCR参数:扩增曲线扩增曲线、标准曲线反映qPCR重要指标qPCR参数:扩增曲线扩增曲线、标准曲线反映qPCR重要qPCR参数:溶解曲线溶解曲线(下左):温度和荧光值的关系，在扩增结束后进行处理后溶解曲线

(下右):温度和荧光值的关系，并取其导数，更为常用应用:指示特异性，最为理想的为单峰；如出现多峰证明反应不特异或存在引物二聚体确认反应特异性，增加数据可信度qPCR参数:溶解曲线溶解曲线(下左):温度和荧光值的qPCR的数学原理理想的PCR反应：Xn=X0×2n非理想的PCR反应：Xn=X0(1+Ex)n方程式两边同时取对数得: logXn=log(X0(1+Ex)n) 整理方程式得: logX0=(-log(1+Ex))×n+logXn将C(t)和达到C(t)值时终产物的量Xc(t)带入上式得：

logX0=(-log(1+Ex))×C(t)+

logXc(t)

初始浓度的对数与循环数呈线性关系n：扩增反应的循环次数Xn：第n次循环后的产物量X0：初始模板量Ex：扩增效率qPCR的数学原理理想的PCR反应：n：扩增反应的循环次数87MIQEqPCR国际标准提出发表文章时所要求的最低限度的必要信息标准。对qPCR的术语；概念；研究与临床应用；样本的采集、处理和制备；核酸的质量控制；反转录；qPCR过程；数据分析等方面的操作标准和规范都做了详尽的阐述。9MIQEqPCR国际标准提出发表文章时所要求的最低限度的88qPCR常用定量方式10qPCR常用定量方式qPCR常用实验方法TaqMan®/TaqMan-MGB®

MolecularBeaconSYBRGreenIMGBEclipseTMProbesScorpionsTMOthers...qPCR常用实验方法TaqMan®/TaqMan-MGqPCR常用实验方法简单成本较低适用于多重PCR特异性较好可进行SNP检测特异性非常好qPCR常用实验方法简单适用于多重PCR可进行SNP检测荧光标记方法选择医疗检验TaqMan探针法特异准确科研SYBR方法便宜方便TaqMan探针法要求严格的相对定量荧光标记方法选择医疗检验92常用定量方法——相对定量vs绝对定量14常用定量方法绝对定量微生物检测：病毒拷贝数转基因检测：转基因拷贝数相对定量（差异）基因表达差异绝对定量94qPCR常用试验方法绝对定量标准曲线由已知浓度的RNA、质粒或合成的寡核苷酸链生成；定量未知模板；标准样品和未知样品必须同时反应；相对定量

∆∆CTMethod：使用内参基因定量所研究样品和参照样品的目的基因；参照样品基因与目的基因可以同时反应，也可以单独反应；双标准曲线法：对每个样品的内参基因和目的基因都做绝对定量，求出每个样品中内参基因和目的基因的绝对数量，然后根据相对定量的基本公式来求出目的基因的差异表达；16qPCR常用试验方法绝对定量绝对定量由标准品计算未知样品的拷贝数绝对定量由标准品计算未知样品的拷贝数利用管家基因校正并计算目的基因倍数关系相对定量利用管家基因校正并计算目的基因倍数关系相对定量一步法vs两步法qPCR一步法vs两步法qPCRqRT-PCR

实验条件RNAOneStepRT-PCR(Onetube)TwoStepRT-PCR(Twotubes)AmpliconAmpliconcDNAGeneSpecificprimersOligodTRandomPrimers可进行PCR或qPCR需要基因特异性引物高通量使用同类的RNA(i.e.singlecell)

适合从大量的RNA样本中得到少量基因（数目）的信息

先进行cDNA合成再进行PCR高效的第一链合成可为下游实验提供cDNA适合从少量的RNA样本中得到大量基因（数目）的信息根据试验情况进行选择qRT-PCR实验条件RNAOneStepRT-PCR99qPCR技术绝对定量VS相对定量一步法VS两步法qRT-PCR概述核酸提取cDNA合成(两步法

qRT-PCR)引物设计方法和原则样品准备必要的对照、内参、标准选择相应的荧光检测方法试剂选择实验设计分析扩增曲线、溶解曲线和标准曲线实验常见问题分析数据分析21qPCR技术概述核酸提取样品准备必要的对照、内参、标准实100核酸提取RNA提取TransZolTransZolUpTransZolPlantEasyPureRNAKitEasyPureViralDNA/RNAKitEasyPurePlantRNAKitEasyPureBloodRNAKitTransZolUpPlusRNAKitEasyPuremiRNAKit好的qPCR结果来源于高质量的模板DNA提取BloodZolPlantZolEasyPureGenomicDNAKitEasyPurePlantGenomicDNAKitEasyPureBloodGenomicDNAKitEasyPureMarineGenomicDNAKitEasyPureBacteriaDNAKit22核酸提取RNA提取TransZol101cDNA合成(两步法qRT-PCR)好的qPCR结果依赖于成功的cDNA合成反转录cDNA影响qPCR敏感度全长cDNA合成增加qPCR成功率引物Oligo(dT):只识别mRNA，合成cDNA序列靠近3’随机引物:随机合成序列，可能合成非编码RNA，造成定量结果高估两者混合结合两者优点23cDNA合成(两步法qRT-PCR)好的qPCR结果102绝对定量和相对定量实验要求24绝对定量和相对定量实验要求103绝对定量模板尽可能选择与目的基因序列相同以保证扩增效率相同来源质粒DNA纯化PCR产物

ReferenceDNA(genomicDNA)精度每次加样要保证在2μl以上，减少误差梯度至少3个点，最好5个点25绝对定量模板104相对定量内参基因选择内参基因的作用检测样本材料中RNA是否降解纠正样本加样的差异校正cDNA合成速率差异校正PCR抑制剂的影响常用内参基因

GAPDHβ-actin18SrRNA选择

不同的物种选择不同的内参基因，有时候可选择组合内参基因。26相对定量内参基因选择内参基因的作用105引物设计方法和原则27引物设计方法和原则维基百科/google输入待查基因名称选择物种mRNA找出目的mRNA输入要查找的蛋白或是基因名称NCBICOPY名称到NCBI重新检索文献目的mRNA序列或序列号Real-TimePCR引物序列Blast确定引物特异性引物设计维基百科/google输入待查www.ncbi.nlm.ni107网络免费设计软件Primer3（primer3.ut.ee）

引物和双标记水解探针的设计Tm的计算MFold（）

引物和扩增产物二级结构的预测

二级结构的稳定性(deltaG)和融解温度(Tm)BLAST（/）

结构特异性29网络免费设计软件Primer3（primer3.ut.e108SYBR引物设计原则SYBR-Green引物引物长度18-30bps，产物长度范围100~400bpG/C含量:40-60%避免引物内含有互补序列(尤其是3’端)避免3’端错配3’端不能出现连续三个以上的G或C避免3’端出现T碱基设计跨内含子引物30SYBR引物设计原则SYBR-Green引物109TaqMan探针和引物设计TaqMan探针Tm值比引物高10℃没有连续相同的碱基

探针位置尽可能地靠近上游引物C远远多于G5‘端没有GTaqMan引物

Tm(58-60℃)15-30basesinlength

G+C含量30-80%不要有连续4个G3’端不能有连续两个以上的G+C5‘端不要有G(AorCpreferred)引物之间的TM相差避免超过2℃扩增长度50-150bp(max400)引物跨越内含子31TaqMan探针和引物设计TaqMan探针Tm值比引物110qPCR技术绝对定量VS相对定量一步法VS两步法qRT-PCR概述核酸提取cDNA合成(两步法

qRT-PCR)引物设计方法和原则样品准备必要的对照、内参、标准选择相应的荧光检测方法试剂选择实验设计分析扩增曲线、溶解曲线和标准曲线实验常见问题分析数据分析32qPCR技术概述核酸提取样品准备必要的对照、内参、标准实111对照设置33对照设置112对照设置阴性对照Negativecontrol:Notemplate(NTC)Use:检验是否有模板污染Noreversetranscriptase(NRT):Use:检验RNA样品中是否有DNA污染Noamplificationcontrol(NAC):Use:检验是否有聚合酶污染Noprobecontrol(NPC):Use:检验荧光污染Buffer:OnlycontainsbufferUse:检验背景荧光阳性对照Calibrator:可以用带有PCR扩增子的合成的RNA或cDNA寡核苷酸；质粒DNA；克隆到质粒的cDNA；体外反转录的RNA；ReferenceRNApools；来自于特定的生物体样本的RNA或DNA及国际上公认的生物学标准物。Standardcurve34对照设置阴性对照113定量方式选择35定量方式选择114定量方式选择SYBRGreen适用-特异性要求不是特别高的反应，分子数（拷贝数）超过1000的反应-探针实验前，进行预实验-PCR条件非常成熟，无二聚体，无非特异扩增TaqMan适用-特异性要求较高的实验-多重PCR（标记不同的荧光基团）-SNP-灵敏度要求较高的实验36定量方式选择SYBRGreen适用标准曲线法和∆∆Ct法

相对定量方法基因表达差异目的基因，内参基因∆∆Ct只依靠Ct值用于大通量（很多基因，如芯片结果）计算简单估计性的结果要求目的基因和内参基因扩增效率都比较好双标准曲线法结果精确对扩增效率要求不高构建目的基因与内参基因的标准品相当于两个绝对定量每次反应都要作标准曲线标准曲线法和∆∆Ct法相对定量方法双标准曲线法双标准曲线法用目的基因和内参基因的标准品分别获得标准曲线处理与未处理样品同时扩增目的基因和内参基因，获得C(t)值通过标准曲线计算目的基因和内参基因的绝对拷贝数用内参基因对目的基因均一化均一化之后的目的基因值相比得出处理与未处理的样本中目的基因的表达差异双标准曲线法双标准曲线法117实例分析39实例分析相对定量实例实验目的：

比较病毒刺激细胞后，细胞抗病毒基因ISG54的表达情况差异。样品：病毒刺激细胞，对照细胞试剂：

TransZolUp、TransStart

TopGreenqPCRSuperMix、

TransScriptTM

IIFirst-StrandcDNASynthesisSuperMix其它材料：

内参引物（GAPDH）

目的基因引物（ISG54）相对定量实例实验目的：对照样品及内参引物确定对照样本（Calibrator）

多个样本比较情况下，其中之一作为对照样本，其它所有样本中目的基因的表达都相对于对照上调或下调。确定内参基因（GAPDH或β-actin）

在所有样本中恒定表达的已知基因，该内参基因可以是一个或多个。内参基因一般是稳定表达的，但在个别物种中可能并非稳定表达，此时需选择多个内参引物。对照样品及内参引物确定对照样本（Calibrator）数据分析扩增曲线溶解曲线GAPDH内参基因数据分析扩增曲线溶解曲线GAPDH内参基因扩增曲线溶解曲线ISG54目的基因数据分析扩增曲线溶解曲线ISG54目的基因数据分析数据分析△△Ct=△Ct(实验)—△Ct(对照)△Ct(实验)=Ct（实验，目的基因）—Ct（实验，内参基因）△Ct(对照)=Ct（对照，目的基因）—Ct（对照，内参基因）2－△△Ct=2－（－3.22）=9.32病毒刺激细胞后，细胞中的ISG54抗病毒基因表达上调了9.32倍。2－△△CtTemplateAssayCt(dRn)对照细胞GAPDH18.20病毒刺激细胞GAPDH18.22对照细胞ISG5426.84病毒刺激细胞ISG5423.64数据分析△△Ct=△Ct(实验)—△Ct(对照)2如何制作标准品以Adeasy腺病毒质粒为例：

一个质粒MW=36820bp×2×330=2.43×1072.43×107g/mol6.023×1023个分子/mol=4.03×10-17g一个质粒(1copy)的质量=拷贝数1031041051061071081091010标准质粒质量4.03x10-144.03x10-134.03x10-124.03x10-114.03x10-104.03x10-94.03x10-84.03x10-7-计算出拷贝数（copies/ul）-梯度稀释制作标准品（大体积稀释10μlto90μl）-定量PCR，检查Ct值差异-产物跑胶鉴定大小如何制作标准品一个质粒(1copy)的质量=拷贝数103如何计算扩增效率使用标准曲线确定引物扩增效率Y=-3.488×logX+55.03R2=0.999E=93.5%E=10(-1/slope)－1如何计算扩增效率使用标准曲线确定引物扩增效率Y=-3.488利用TaqMan法研究ERBB2在正常或乳腺肿瘤组织标本中的表达差异已知在50%的乳腺肿瘤样本中，ERBB2表达异常，因此可以作为一个检测标准选用GAPDH作为内标基因FAM标记的ERBB2探针VIC标记的GAPDH探针构建标准曲线双重PCR反应阴性对照无RNA对照（空白）无逆转录酶对照（基因组）实例分析-2利用TaqMan法研究ERBB2在正常或乳腺肿瘤组织标本中标准曲线Color2-VICdetectionforGAPDHColor1–FAMdetectionforERBB2标准曲线Color2-VICdetectionfo样品扩增：正常vs肿瘤PMT1-FAMdetection-ERBB2PMT2-VICdetection-GAPDH肿瘤正常肿瘤正常样品扩增：正常vs肿瘤PMT1-FAMdetection-实验结果MultiplexReactions:C(t)HealthyRNACarcinoma28.4027.3628.4627.1228.43±0.0427.24±0.17ERBB2表达MultiplexReactions:C(t)HealthyRNACarcinoma23.2722.8123.4122.8623.34±0.1022.83±0.03GAPDH表达实验结果MultiplexReactions:C(t)H实验结果HealthyRNATumorRNAGAPDHERBB210951052213024929550085730136000130800Copiesng/µlTotalRNAERBB2copies/GAPDHcopies1095/95500=0.0111052/85730=0.0122130/136000=0.0172492/130800=0.019HealthyRNATumorRNA0.0110.0180.018/0.011=1.6300.81.82HealthyTissueCarc.TissueRelativeExpression实验结果HealthyTumorGAPDHERBB21095实验结果ΔΔC(t)=4.41-5.18=-0.77±0.182-ΔΔc(t)=1.51-1.93结果与双标准曲线法相近HealthyRNAERBB2GAPDHΔC(t)28.4023.275.3128.4623.415.0528.43±0.0428.34±0.105.18±0.18CarcinomaRNAERBB2GAPDHΔC(t)27.3622.814.5527.1222.864.2626.24±0.1726.83±0.034.41±0.21实验结果ΔΔC(t)=4.41-5.18=-0.77±0.1131参照染料（ROX）53参照染料（ROX）参照染料选择标准化荧光信号调整非PCR因素造成的误差，如加样误差提供较稳定的基线部分仪器在使用前会使用标准化荧光信号进行校正参照染料的使用由仪器决定ABIandStratagene使用ROXBio-Rad使用标准化荧光信号Roche,Corbett,Cepheid和

MJResearch不使用内参染料使用内参染料使数据更加准确参照染料选择使用内参染料使数据更加准确133qPCR技术绝对定量VS相对定量一步法VS两步法qRT-PCR概述核酸提取cDNA合成(两步法

qRT-PCR)引物设计方法和原则样品准备必要的对照、内参、标准选择相应的荧光检测方法试剂选择实验设计分析扩增曲线、溶解曲线和标准曲线实验常见问题分析数据分析55qPCR技术概述核酸提取样品准备必要的对照、内参、标准实134判断数据有效性56判断数据有效性135用扩增曲线检验qPCR体系用融解曲线检验qPCR体系用标准曲线检验qPCR体系用No-TemplateControl(

NTC)检验qPCR体系（引物）用NoRTControl检验qPCR体系（模板）57用扩增曲线检验qPCR体系扩增曲线平滑起始无扩增起峰时间正常NTC和NRC无扩增或扩增起峰较晚CT值是判断实验成功与否的重要参考扩增曲线CT值是判断实验成功与否的重要参考Ct值的可信范围临床检验小于33科学研究小于38内参基因小于20，样品间差距不超过1复孔不超过0.5CT值是判断实验成功与否的重要参考Ct值的可信范围临床检验CT值是判断实验成功与否的重要参考138溶解曲线分析呈现单峰峰的宽度较小NTC和NRC均无较高的峰出现60溶解曲线分析呈现单峰139扩增效率r2=0.999Slope=-3.364E=10(-1/slope)－1

r2:0.95~1Slope:-3.58~-3.10E:90%~110%61扩增效率r2=0.999Slope=-3.364荧光定量PCR--NTCNTCNTC—反应是否存在污染NTC—引物是否特异，是否会形成引物二聚体NTC的最佳状况NTC的CT值为零，扩增曲线与基线重合NTC的CT值与全管反应物的CT值相差5以上或10以上荧光定量PCR--NTCNTCNTC—反应是否存在污染NT荧光定量PCR--NTC引物二聚体荧光定量PCR--NTC引物二聚体NoRTControlRT反应中的阴性对照，即不加入RT酶的反应目的：检测RNA中是否有基因组DNA的残留将NoRTControl产物与正常cDNA同时进行qPCR观察其结果，判断正常cDNA的扩增结果是否可信、该RNA是否可用NoRTControlRT反应中的阴性对照，即不加入RT荧光定量PCR标准数据参考范围数据名称参考范围Tm>80℃CT18-30cyclesR2>0.95Slope(-3.58)-(-3.10)Efficiency90%-110%NTCCT(NTC)=0CT(NTC)－CT(样品)≥5NRCCT(NTC)=0CT(NTC)－CT(样品)≥5荧光定量PCR标准数据参考范围数据名称参考范围Tm>80℃C144荧光定量PCR问题解析66荧光定量PCR问题解析145扩增曲线分析基线设置是否正确基线校准基线开始值(3-10)基线终止值（指数期之前）阈值设置是否正确设置在指数增长期(可自动或手动设置）67扩增曲线分析基线设置是否正确146扩增曲线分析初始扩增不规则主要由于模板中存在抑制物。样品扩增过早是由于初始模板浓度太高。68扩增曲线分析初始扩增不规则主要由于模板中存在抑制物。147扩增曲线分析曲线不平滑探针或荧光染料品质不好仪器使用过度，荧光收集不稳定仪器未经过校正（包括自动校正或ROX校正)体系中抑制物较多，导致荧光不稳定69扩增曲线分析曲线不平滑探针或荧光染料品质不好扩增曲线问题-精密度差加样误差，体系配置错误，反应液没有混匀。低拷贝基因或模板浓