第二篇 真菌学

PAGE396PAGE7第二篇真菌学第21章真菌学概述真菌(fungus)是一种真核细胞型微生物。有典型的细胞核和完善的细胞器。不含叶绿素、无根、茎、叶的分化。真菌广泛分布于自然界，种类繁多，有10余万种。大多对人无害，有的甚至有益。如食用蕈类，有的真菌用于生产抗生素和酿酒等。引起人类疾病的约300余种，包括致病、条件致病、产毒以及致癌的真菌。近年来真菌感染明显上升。这与滥用抗生素引起菌群失调和应用激素、抗癌药物导致免疫低下有关，应引起注意。与医学有关的真菌有四个亚门：①接合亚门(Zygomycotina),绝大多数为无隔多核菌丝体，属条件致病性真菌,如毛霉、根霉等。②子囊菌亚门(Ascomycotina)，具有子囊和子囊孢子，如芽生菌属、组织胞浆菌属、小孢子菌属及酵母菌属等。③担子菌亚门(Basidiomycotina)，具有担子和担孢子，如食用菌蘑菇、灵芝以及致病性新生隐球菌等。④半知菌亚门(Deutermycotina或fungusimperfecti)，对此类菌生活史了解不完全，未发现其有性阶段，故称之为半知菌。在医学上有重要意义的真菌绝大部分在半知菌亚门中，如球孢子菌属和假丝酵母菌属。最新的真菌分类是将真菌界分为4个门，即接合菌门(Zycomycota)、担子菌门(Basidomycota)、子囊菌门(Ascomycota)和壶菌门(Chytridiomycota),而将原半知菌亚门中的真菌划分到前3个门中。第一节真菌的生物学性状真菌可分单细胞和多细胞两类。单细胞真菌呈圆形或卵圆形，称酵母菌(yeast)。多细胞真菌大多长出菌丝和孢子，交织成团，称丝状菌(filamentousfungus)，又称霉菌(mold)。有些真菌可因环境条件的改变，而两种形态发生互变，称为二相性(dimorphic),如球孢子菌、组织胞浆菌、芽生菌和孢子丝菌等。这些真菌在体内或在含有动物蛋白的培养基上37℃培养时呈酵母菌型，在普通培养基上25℃培养时则呈丝状菌。形态与结构真菌比细菌大几倍至几十倍。结构比细菌复杂。细胞壁不含肽聚糖，主要由多糖（75%）与蛋白质（25%）组成。多糖主要为几丁质的微原纤维，缺乏肽聚糖，故真菌不受青霉素或头孢菌素的作用。真菌的细胞膜与细菌的区别在于真菌含固醇(sterol)而细菌无。单细胞真菌呈圆形或卵圆形，常见于酵母菌或类酵母菌，对人致病的主要有新生隐球菌和白假丝酵母菌。这类真菌以出芽方式繁殖，芽生孢子成熟后脱落成独立个体。多细胞丝状真菌能长出菌丝，菌丝延伸分枝，有的菌丝上长出孢子。各种丝状菌长出的菌丝和孢子形态不同，是鉴别真菌的重要标志。1.菌丝(hypha)真菌的孢子以出芽方式繁殖。在环境适宜情况下由孢子长出芽管，逐渐延长呈丝状，称菌丝。菌丝又可长出许多分枝，交织成团称菌丝体(mycelium)。有的菌丝伸入培养基中吸取养料，称营养菌丝。有的菌丝向上生长，称气生菌丝。其中产生孢子的称生殖菌丝。有的菌丝内能形成横隔，称隔膜(septum)，将1条菌丝分成几个细胞，是为有隔菌丝(septatehypha)。大多数致病性真菌均有隔膜，隔膜中有小孔，允许胞质流通。皮肤癣菌、组织胞浆菌和曲霉等孔较大，细胞核亦可通过;有些真菌菌丝无横隔，为无隔菌丝(nonseptatehypha)。整条菌丝为1个细胞，在1个细胞内有多个细胞核。菌丝可有多种形态：螺旋状、球拍状、结节状、鹿角状和梳状等。不同种类的真菌可有不同形态的菌丝，故菌丝形态有助于鉴别（图21-1）。图21-12.孢子(spore)是真菌的繁殖结构，真菌的孢子与细菌的芽胞不同，其抵抗力不强，加热60~70℃短时间即可死亡。孢子可分有性孢子和无性孢子两种。有性孢子是由同一菌体或不同菌体上的2个细胞融合经减数分裂形成。无性孢子是菌丝上的细胞分化或出芽生成。病原性真菌大多形成无性孢子。无性孢子根据形态分为3种（图21-2）。图21-2（1）分生孢子(conidium)：由生殖菌丝末端的细胞分裂或收缩形成，也可在菌丝侧面出芽形成。按其形态和结构又可分大分生孢子和小分生孢子2种：大分生孢子(macroconidium)体积较大，由多个细胞组成，常呈梭状、棍棒状或梨状。其大小、细胞数和颜色是鉴定的重要依据（图21-3);小分生孢子（microconidium)较小，1个孢子只有1个细胞。真菌都能产生小分生孢子，其诊断价值不大。（2）叶状孢子(thallospore)：由菌丝内细胞直接形成。①芽生孢子(blastospore),由菌丝体细胞出芽生成，常见于假丝酵母菌与隐球菌。一般芽生孢子长到一定大小即与母体脱离，若不脱离则形成假菌丝。②厚膜孢子(cla-mydospore),菌丝内胞浆浓缩，胞壁增厚，在不利环境中形成，抵抗力增大。当环境有利时，厚膜孢子又可出芽繁殖。③关节孢子(arthrospore)，在陈旧的培养物中，菌丝细胞壁变厚，形成长方形的节段，呈链状排列。（3）孢子囊孢子(sporangiospore)：菌丝末端膨大成孢子囊，内含许多孢子，孢子成熟则破囊而出，如毛霉、根霉等。图21-3培养特性真菌的营养要求不高，在一般细菌培养基上能生长。检查时常用沙保(Sabouraud)培养基。此培养基成分简单，主要含有1%蛋白胨、4%葡萄糖和2%琼脂，pH5.5。皮肤癣菌在此培养基上生长较慢，常需1~4周;但腐生性真菌在此培养基上生长迅速。故分离真菌时常在此培养基中加一定量的放线菌酮和氯霉素，前者用以抑制污染真菌，后者用以抑制细菌的生长。有些病原性真菌，如白假丝酵母菌、组织胞浆菌、新生隐球菌等加放线菌酮即不能生长，宜用无抗生素的血琼脂平板，见有生长后移种沙保培养基，并同时做玻片培养以观察自然状态下的形态结构。培养真菌最适宜的酸碱度是pH4.0~6.0，浅部感染真菌的最适温度为22~28℃。但某些深部感染真菌一般在37℃中生长最好。培养真菌需较高的湿度与氧。真菌的菌落有两类：1.酵母型菌落是单细胞真菌的菌落形式，菌落光滑湿润，柔软而致密。形态与一般细菌菌落相似，如隐球菌即属之。有部分单细胞真菌在出芽繁殖后，芽管延长不与母细胞脱离，形成假菌丝。假菌丝由菌落向下生长，伸入培养基中，这种菌落称为类酵母菌落，如假丝酵母菌。2.丝状菌落是多细胞真菌的菌落形式，由许多疏松的菌丝体构成。菌落成棉絮状、绒毛状或粉末状，菌落正背两面呈现不同的颜色。丝状菌落的形态、结构和颜色常作为鉴定真菌的参考。真菌有从中心向四周等距离生长形成圆形菌落的倾向，所以临床体癣、股癣、叠瓦癣等皮损表现为环形或多环形。若要真实地观察菌丝与孢子生长的关系，可作小培养。系切取一小块沙保培养基置玻片上，挑取小片真菌菌落接种在培养基周边，盖上无菌盖玻片。培养1周后用乳酚棉蓝(lactophenolcottonblue)染色。镜检可见菌丝和孢子的结构和排列。真菌容易发生变异。在培养基上人工传代或培养时间过久，其形态、培养特性甚至毒力都可发生改变。抵抗力真菌对干燥、阳光、紫外线及一般消毒剂有较强的抵抗力。实验证明紫外线对丝状真菌与假丝酵母菌在距离1m照射需30min杀死。但不耐热，60℃1h菌丝和孢子均被杀死。对2%石碳酸、2.5%碘酊、0.1%升汞或10%甲醛溶液较敏感。对常用于抗细菌感染的抗生素均不敏感;灰黄霉素、制霉菌素B、二性霉唑、克霉素、酮康唑、伊曲康唑等对多种真菌有抑制作用。第二节真菌的致病性与免疫性真菌引起机体感染同样需要具备一定的毒力，如白假丝酵母菌、烟曲霉、黄曲霉的细胞壁糖蛋白有内毒素样活性，能引起组织化脓性反应和休克，烟曲霉和黄曲霉还能致多种器官的出血和坏死。白假丝酵母菌具有粘附人体细胞的能力,随着其芽管的形成，粘附力加强。二相真菌如荚膜组织胞浆菌、皮炎芽生菌等进入机体后必须先转换成酵母型在巨噬细胞中不被杀灭反而扩散。新生隐球菌的荚膜有抗吞噬作用。近来研究表明白假丝酵母菌和烟曲霉的热休克蛋白HSP90与宿主细胞和血清蛋白结合能使之功能改变，是其能致病的一种原因。至今对真菌致病性研究仅限于少数几种真菌。不同的真菌可通过下列几种形式致病。1.致病性真菌感染主要是一些外源性真菌感染。浅部真菌如皮肤癣菌是由于这些真菌的嗜角质性，并能产生角蛋白酶水解角蛋白。在皮肤局部大量繁殖后通过机械刺激和代谢产物的作用，引起局部炎症和病变。深部真菌感染后不被杀死，能在吞噬细胞中生存、繁殖，引起慢性肉芽肿或组织溃疡坏死。2.条件致病性真菌感染主要是由一些内源性真菌引起的，如假丝酵母菌、曲霉、毛霉。这些真菌的致病性不强，只有在机体免疫力降低时发生，如肿瘤、糖尿病、免疫缺陷、长期应用广谱抗生素、皮质激素、放射治疗或在应用导管、手术等过程中易继发感染。例如导管、插管入口为真菌入侵提供门户，真菌粘附其上，并不断增殖，从而进入血液，并播散至全身。3.真菌超敏反应性疾病敏感患者当吸入或食入某些菌丝或孢子时可引起各种类型的超敏反应，如荨麻疹、变应性皮炎与哮喘等。4.真菌性中毒症粮食受潮霉变，摄入真菌或其产生的毒素后可引起急、慢性中毒称为真菌中毒症（mycotoxicosis)。病变多样，因毒素而异。有的引起肝、肾损害，有的引起血液系统变化，有的作用于神经系统引起抽搐、昏迷等症状。真菌中毒与一般细菌性或病毒性感染不同。真菌是在粮食中产生毒素，受环境条件的影响，所以发病有地区性和季节性，但没有传染性，不引起流行。粮食多次搓洗可以减少污染的毒素，有一定的预防作用。5.真菌毒素与肿瘤的关系近年来不断发现有些真菌产物和肿瘤有关，其中研究最多的是黄曲霉毒素。黄曲霉毒素是一种双呋喃氧杂萘邻酮衍化物，毒性很强，小剂量即有致癌作用。根据荧光分析有20多种衍化物，其中B1致癌作用最强，B2次之。大鼠口服B1后易被吸收，在肝脏迅速达到高峰。B1与RNA和DNA结合能力很强，从而抑制细胞RNA与DNA的合成，与致癌有一定关系。在肝癌高发区的花生、玉米、油粮作物中，黄曲霉污染率很高，黄曲霉毒素含量可高达1ppm。大鼠试验饲料中含0.015ppm即可诱发肝癌。也有人认为肝癌与乙型肝炎有关，经调查90%患者感染过乙型肝炎。故人肝癌的病因可能是多因素的，黄曲霉毒素只是重要因素之一。自然界中并非所有黄曲霉株都能产生黄曲霉毒素。事实上无毒株多于产毒株。相反，除黄曲霉外，寄生曲霉、黑曲霉、赤曲霉、温特曲霉等也可产生黄曲霉毒素。其他致癌的真菌毒素还有赭曲霉产生的黄褐毒素也可诱生肝肿瘤，镰刀菌T-2毒素可诱发大鼠胃癌、胰腺癌、垂体和脑肿瘤，展青霉素可引起局部肉瘤等。免疫性1.天然免疫真菌感染的发生与机体的天然免疫状态有关，最主要的是皮肤粘膜屏障。一旦破损、受创伤或放置导管，真菌即可入侵。皮脂腺分泌饱和和不饱和脂肪酸均有杀真菌作用。儿童头皮脂肪酸分泌量比成人少，故易患头癣。成人因手、足汗较多，且掌跖部缺乏皮脂腺故易患手足癣。在正常菌群中有细菌也有真菌。由于菌与菌之间的相互拮抗，不能大量生长引起疾病。长期应用广谱抗生素破坏菌群间的比例，或因恶性疾病以及长期服用免疫抑制剂后，机体免疫力降低，均可引起继发性真菌感染。此外，某些内分泌功能失调也是促使某种真菌感染的一种因素。如肾上腺皮质功能低下、糖尿病、甲状腺功能低下等病人，常并发皮肤粘膜假丝酵母菌病。近年来发现tuftsin（真菌学上称促癣吞噬肽）可结合到中性粒细胞外膜上以提高其吞噬和杀菌活性，并有促趋化作用。抗真菌中中性粒细胞与巨噬细胞起重要作用，被真菌激活后释放H2O2、次氯酸和防御素(defensin)能杀灭假丝酵母菌、烟曲霉等真菌。铁对活细胞是必不可少的，但铁浓度过高有助于细菌和真菌感染，如糖尿病酮中毒患者易发生毛霉病，低浓度不饱和转铁蛋白和高浓度血清铁可诱发白假丝酵母菌感染。血浆中的转铁蛋白，经皮下小血管或汗腺扩散至皮角质层内，可限制数种真菌的生长。2.获得性免疫真菌感染因其胞壁厚，即使有抗体和补体也不能完全杀灭它。但特异性抗体可阻止真菌转为菌丝相以提高吞噬率，并抵制真菌吸附于体表。如假丝酵母珠菌，SIgA抗体即可与其表面甘露聚糖复合体结合阻止其吸附。但一般认为真菌感染的恢复主要靠细胞免疫，真菌抗原剌激后特异性淋巴细胞增殖，释放IFN-和IL-2等激活巨噬细胞、NK细胞和CTL等，参与对真菌的杀伤。播散性真菌感染患者常伴有T细胞功能的抑制，如AIDS、淋巴瘤和使用免疫抑制剂等。真菌感染可引发迟发型超敏反应。临床上常见的癣菌疹就是真菌感染所引起的一种超敏反应。第三节真菌的微生物学检查法各种真菌的形态结构有其一定的特殊性，一般可以通过直接镜检和培养进行鉴定，但具体方法应根据标本种类和检查目的而异。标本浅部感染真菌的检查可用70%乙醇棉球擦拭局部后取皮屑、毛发、指（趾）甲屑等标本。深部感染真菌的检查可根据病情取痰、血液、脑脊液等标本。直接镜检和意义皮屑、毛发、指（趾）甲屑等标本置玻片上。滴加10%KOH少许，以盖玻片覆盖后在火焰上微微加温，使被检组织中的角质软化。轻压盖玻片，使标本变薄透明，然后在低倍或高倍镜下检查。若见菌丝或孢子，即可初步诊断患有真菌癣，但一般不能确定其菌种。皮肤癣标本检查常用湿标本，不加染色。假丝酵母菌感染则取材涂片，行革兰染色;隐球菌感染取脑脊液离心。沉淀物用墨汁作负染色后镜检。结果的判断：①直接检查阳性有意义，阴性不能排除感染。但阴道、痰等分离出假丝酵母菌、曲霉等条件致病菌需多次阳性才有意义。②组织中发现分隔分枝的菌丝多为曲霉;粗大、不分隔或不分枝的菌丝多为毛霉。假丝酵母菌出现假菌丝代表活动性，有意义。③皮肤癣菌菌丝肥大粗长，提示处于活跃状态。④酵母型和二相型真菌在组织内常表现为孢子。分离培养直接镜检不能确诊时应作真菌培养。皮肤