血吸虫候选疫苗的研究现状与展望

血吸虫候选疫苗的研究现状与展望摘要：血吸虫病是一种严重危害人民身体健康的人畜共患寄生虫病，发展疫苗是预防和控制日本血吸虫病的重要措施之一。血吸虫病疫苗的研制工作已纳入WHO和我国主要疾病防治规划并取得了显著进展。近年来开展的血吸虫免疫机制和血吸虫基因组研究对血吸虫疫苗的研制起了积极的推动作用，目前各国研究的焦点主要集中在疫苗候选分子方面。对近年来有前途的几种血吸虫疫苗的研究进展予以综述。关键词：日本血吸虫；蛋白疫苗；DNA疫苗；树突状细胞疫苗；综述CurrentStatusandProspectsonCandidateVaccinesagainstSchistosomajaponicumAbstract:Schistosomiasis,aparasiticdiseasescanbothinfecthumanandlivestocks,madeseriousharmfultopeople’shealthinrecentlyyears.Animportantmethodofschistosomiasiscontrolisthecreationofvaccines.Greatprogresshasbeenmadeonvaccineresearchforschistosomiasis,includingthoseonimmunemechanismandSchistosomagenomewhichhavemadeactiveeffecttovaccinedevelopment.scientistsfromallovertheworldarefocusingonthefieldofcandidatemolecularofvaccine.Inthiscase,severalvariesofSchistosomiasisvaccineswhichhadbemuchtalkedaboutinrecentlyyearsshouldbereviewedinthisarticle.Keywords:Schistosomajaponicum;Proteinvaccine;DNAvaccine;dendriticcellvaccine;review日本血吸虫病（Schistosomiasisjaponicum）是由日本血吸虫（Schistosomajaponicum，Sj）引起的一种严重危害人类健康的人兽共患疾病，是世界卫生组织确定的六大热带病之一［1］，目前主要流行于中国、菲律宾和印度尼西亚，中间宿主为湖北钉螺(Oncomelaniahupensis)。据估算，全球目前有1亿多人和几千万头家畜受到威胁，我国感染者84.25万人，感染牛2.48万头，是一个重要公共卫生问题[2-4]。血吸虫病的防治措施主要有健康教育、易感地带灭螺和人畜同步化疗。但在防治过程中发现螺类分布面积广，不易消灭控制；哺乳动物等保虫宿主多，人畜同步化疗难度大；流行区人畜化疗后再感染率高；吡喹酮化疗对已造成的组织损伤没有作用，对再次感染并没有保护作用,长期使用具有一定的毒副作用，且易产生抗药性。近年来，由于种种原因，我国局部地区血吸虫病疫情有所回升，如患者数目有所增加，钉螺面积在扩大，并有由农村向城市蔓延的趋势，我国血吸虫病防治工作面临着严峻的形势。为有效控制和消灭血吸虫病，迫切需要研制一种长效的预防疫苗，有效疫苗的免疫预防是积极预防的最佳选择。下面从蛋白质疫苗、DNA疫苗（单纯的、多价的）、混合疫苗、树突状细胞疫苗4个方面阐述血吸虫病疫苗的研究进展。1血吸虫蛋白疫苗蛋白质疫苗是血吸虫疫苗的一个主要类型，种类比较多。日本血吸虫病疫苗候选抗原大致可分为以下几大类：酶性抗原、肌相关蛋白、膜相关蛋白、钙相关蛋白、线粒体相关蛋白、性别相关蛋白、信号蛋白、卵相关蛋白等。1.1酶性抗原日本血吸虫谷胱甘肽S转移酶(glutathione-S-transferase,GST)有分子质量单位为26和28ku两种同工酶，是血吸虫和其它蠕虫的主要疫苗候选分子和药物靶标。SjGST主要存在于血吸虫雄虫生殖腺的实质和雌虫卵黄腺之间的实质细胞内，在虫体发育、繁殖过程发挥重要作用。GST的酶解产物不但参与虫体发育过程，而且还调节宿主的免疫应答反应向Th2方向发展。抗血吸虫药物砒喹酮可以和GST结合并抑制其酶活性[5]。GST氨基酸序列中同时含有B淋巴细胞和T淋巴细胞表位，因而被认为是可以同时激发体液和细胞免疫应答反应的理想抗原。免疫试验证实，GST可以激发特异性IgE抗体的产生，而且体内外实验都证明IgE抗体主要是通过ADCC作用实现抗血吸虫效果的。用重组Sj26-GST进行免疫，小鼠可获得24%～32%减虫率，57%～79%减卵率，肝脏肉芽肿显著减小；水牛、猪和羊可获得25%～62%减虫率,54%～60%减卵率，且免疫保护力最长可持续1年以上，具有明显的抗感染和抗生殖免疫作用，用重组Sj28-GST进行免疫和尾蚴攻击感染，小鼠可获得0～35%减虫率，水牛和羊可获得33%～69%减虫率。磷酸丙糖异构酶（triosephosphateisomerase,TPI）是血吸虫糖代谢过程的一个关键酶(二聚体糖酵解酶)。在血吸虫的各期均有TPI抗原的合成，并分布于血吸虫的各种组织中。实验研究用天然TPI免疫小鼠减虫率为21%～25%，免疫组肝脏肉芽肿较对照组减少58%～60%，具有一定的保护作用。1.2副肌球蛋白(paramysoin)副肌球蛋白是一种糖蛋白，主要位于血吸虫各个发育期肌组织内，也分布于尾蚴的呼吸盘腺体内，以及肺期虫体的表膜和基底层。在虫体发育过程中分泌结合至虫体表面，虫体移行时成为靶抗原激起保护性免疫，是人抗血吸虫感染免疫中IgA应答的主要靶标。该蛋白质除了参与虫体的肌纤维功能外，还能与动物和人的抗体Fc片段结合，对补体介导的免疫反应有抑制作用.体外实验证明,副肌球蛋白能刺激小鼠T淋巴细胞产生IFN-γ，且直接注射特异性抗副肌球蛋白抗体不能使动物抵抗感染，表明由副肌球蛋白激发的抗再感染的保护性免疫机制主要依赖细胞介导的免疫反应[6]。1.3膜相关蛋白主要为日本血吸虫Mr23000虫膜蛋白(Sj23)和Mr22600虫膜蛋白(Sj22.6)。Sj22.6虫膜蛋白存在于血吸虫的童虫和成虫表膜，曼氏血吸虫和日本血吸虫的22.6ku膜相关蛋白已经克隆和表达，已证实Sj22.6蛋白可对小鼠产生较高的保护力[7]。虫膜蛋白Sj23是分布在日本血吸虫成虫表面的一种膜蛋白，其功能可能与虫体细胞的扩散有关。对虫膜相关蛋白的研究不仅可以为血吸虫病疫苗提供候选抗原，也对血吸虫与宿主相互作用和免疫诊断的研究有着重要意义[7]。1.4钙相关蛋白脂肪酸结合蛋白(FABP)、钙蛋白酶(calpain)、钙网蛋白(calreticulin)等都属于这一类。血吸虫本身不能合成长链脂肪酸和类固醇，必须利用细胞膜和质膜中FABP来吸收、运输和吞噬宿主各种衍生脂肪酸。在代谢过程中，血吸虫释放出的脂肪酸衍生物在抵御宿主免疫系统的攻击时发挥重要的作用。因此，FABP成为血吸虫合成脂肪酸过程中所必须的载体，是极具吸引力的候选分子[8]。1.5性别相关蛋白血吸虫在宿主体内发育过程中需要雌雄虫合抱才能发育成熟，而且发育成熟的虫体仍需要维持合抱状态。因此，找到可能与血吸虫雌雄虫合抱有密切关系的基因或蛋白，作为血吸虫疫苗的靶目标，并明确其免疫保护作用机制，必将大大促进血吸虫病疫苗的研究和开发[9]。1.6热休克蛋白(heatshockprotein,HSP)血吸虫由于环境改变而产生热休克蛋白，可诱导宿主免疫杀伤[10]。HSP作为分子伴侣，在细胞内可以结合各种变性或合成的短肽呈递给T细胞，引发细胞免疫反应。由于HSP-抗原肽复合物疫苗是多价的，所以防治血吸虫感染更为有效，同时HSP能激活记忆T细胞，避免了宿主对血吸虫抗原不能持续产生保护性抗体的缺点。目前血吸虫HSP-抗原肽复合物方面的研究开展比较少，但为预防血吸虫感染提供了一个研究方向。1.7日本血吸虫14-3-3蛋白（SJ14-3-3）Mr29000,主要分布于肌肉、表皮以及实质层中,是一种具有信号传导作用的蛋白，参与多种生理过程调节。日本血吸虫信号传导蛋白14-3-3蛋白(Sj14-3-3)已被确认为血吸虫疫苗候选抗原。蒋就喜等人用rSj14-3-3免疫BALB/c小鼠获得了17.0%的减虫率、25.3%的减卵率，肝虫卵肉芽肿的大小也显著减小[11]。1.8其他蛋白分子天门冬氨酸蛋白酶-组织蛋白酶D、丝氨酸蛋白酶抑制剂、铁蛋白等免疫小鼠或家兔亦能获得较高的减虫率及减卵率。2DNA疫苗Wolff等将编码功能蛋白的质粒DNA肌肉注射小鼠，发现质粒DNA可在局部肌肉组织表达。这种DNA既是疫苗又是载体，故称为DNA疫苗，又称为核酸疫苗。核酸疫苗既具有重组亚单位疫苗的安全性，又具有减毒活疫苗诱导全方位免疫应答的高效、持续性的优点，成为当今疫苗研究的热点之一［12］。2.1单纯的DNA疫苗迄今已报道的抗日本血吸虫DNA候选疫苗有SjTPI、Sj22、Sj23、Sj26、Sj28、Sj32及Sj97等。Sj32DNA疫苗:李传明等构建pBK-Sj32，并将其肌肉注射免疫BALB/c鼠，结果发现免疫鼠的减虫率和肝组织的减卵率分别为30.91%～38.6%和55.21%～55.71%。表明pBK-Sj32也可诱导小鼠产生一定的减虫、减卵作用。Sj97DNA疫苗：研究发现将SjC97DNA全基因质粒表达载体(pCMVSjc97)免疫C57BL/6小鼠，发现pCMV-Sjc97免疫C57BL/6小鼠减虫率为35.5%～4l.1%，肝、脾及肠组织减卵率分别为44.5%～59.6%、56.7%～82.4%和57.9%，pCMV-Sjc97免疫主要诱生Thl型免疫应答增强，Sjc97DNA疫苗具有一定的抗肝纤维化、对小鼠肝脏和皮肤均具有一定的免疫保护作用，pCMV-Sjc97免疫增强了小鼠皮肤及肺组织的细胞反应及其杀童虫作用［13］。2.2多价复合DNA疫苗血吸虫虫体较大，抗原性复杂，目前的研究表明，单价DNA疫苗分子的保护力有限，双盲实验证实,所获得的疫苗候选分子均难以稳定达到40%的免疫保护力(减虫率)［8］，而将含有不同抗原基因的质粒混合起来进行联合免疫，或将协同保护功能的一组基因的功能性表位的氨基酸序列结合起来设计成联合表位肽段，生产多价复合疫苗，综合各种疫苗的协同作用，各取所长，会诱导宿主产生更完全的保护。以VRSj23+VRSj28联合DNA疫苗肌内免疫牛可获得38%减虫率和48%减卵率。以VRSj62+VRSj28+VRSj23+VRSj14-3-3四价混合DNA疫苗肌内免疫小鼠可诱导40%减虫率[14]。3混合疫苗血吸虫混合疫苗包括蛋白(重组蛋白和表位肽)的混合疫苗、DNA的混合疫苗、蛋白与DNA的混合疫苗。混合疫苗综合了蛋白疫苗与DNA疫苗的优点，有良好的发展前景。实验证明应用混合疫苗可诱导实验室动物产生较高的抵抗力，联合疫苗在一定程度上优于单独使用蛋白疫苗和DNA疫苗。4树突状细胞疫苗树突状细胞（DC）是目前体内功能最强的抗原提呈细胞，具有较强的刺激初始T细胞增殖的能力，能启动机体的免疫反应并决定机体免疫应答方向。DC1活化后分泌大量的IL-12，促使Th0向Th1分化，诱导Th1型免疫应答。DC2不分泌IL-12和IL-4，能促使Th0向Th2分化，DC2诱导的Th2分化是IL-4非依赖性的，DC2可能提供某种特殊信号诱导Th0向Th2分化，诱导Th2型免疫应答。Th的极化受多种因素的影响，包括抗原特性、DC细胞类型、细胞因子以及激素等。树突状细胞疫苗目前广泛应用于抗肿瘤、移植免疫，在抗寄生虫感染中也有报道。但在抗血吸虫感染方面的研究还很少见。有报道血吸虫虫卵抗原（SEA）和GST负载的DC免疫BABL/c小鼠，可分别诱导出27.3%和34.5%的减虫率［15，16］。该研究小组接着用日本血吸虫Sj26和Sj23基因转染DC联合免疫BABL/c小鼠，减虫率提高至40.5%［15］。5展望研制有效的血吸虫病疫苗被认为是控制血吸虫病的根本措施之一。虽然当前日本血吸虫病疫苗研究中尚存在一些问题，如：现阶段所研究的血吸虫病候选疫苗分子诱导的保护力水平不高；免疫机制不明确；动物模型与人体免疫机制的差异；此外，多数疫苗的毒副作用尚不明确，能用于人体的佐剂还需要进一步研究［17］。此外，我国血吸虫病疫苗的研究还应在以下几个方面加强：1)充分利用日本血吸虫基因组信息资源及蛋白质组技术,继续探索和验证新的、优质的疫苗候选抗原；2)继续加强对血吸虫病疫苗候选抗原免疫机制，特别是免疫逃避机制的研究，这是疫苗研制取得最后成功的关键所在；3)加强对血吸虫病疫苗候选抗原T、B细胞表位基因联合表达的研究，为研制杂合疫苗奠定基础;4)加强对血吸虫病疫苗抗原佐剂的研究；5)完善载体和表达系统，提高疫苗候选抗原的表达水平和稳定性，以达到GLP/GMP生产标准，为疫苗的产业化创造条件；6)充分利用血吸虫基因组计划资源和蛋白质组学、基因芯片等新技术开展工作；7)注重借鉴曼氏血吸虫的研究资料，以加强日本血吸虫的相关研究。基因组学和蛋白组学研究的发展及其在血吸虫领域研究的应用，使血吸虫病疫苗研究呈现更大的发展空间。近几年来我国研究者在血吸虫病疫苗研究方面取得了一系列的研究进展，并取得了可喜的成绩[18]。综合蛋白疫苗、核酸疫苗的优点制成的联合疫苗取得了较好的免疫效果。因此研制一种能够诱导机体产生全面、强效、稳定的疫苗是很有希望的。参考文献：[1]ChitsuloL,EngelsD,MontresorA,etal.Theglobalstatusofschistosomiasisanditscontroi[J].ActaTrop,2000,77(1):41－51[2]ZhouXN,WangLY,ChenMG,etal.Thepublichealthsignificanceandcontrolofschistosomiasis-thenandnow[J].ActaTrop,2005,96:97-105[3]BlasBL,RosalesMI,LipayonIL,etal.TheschistosomiasisprobleminthePhilippines:areview[J].ParasitolInt,2004,53:127-134[4]UtzingerJ,ZhouXN,ChenMG,etal.ConqueringschistosomiasisinChina:thelongmarch[J].ActaTrop,2005,96:69-96[5]罗四维，周秦等.血吸虫疫苗的研究进展[J].微量元素与健康研究，2011，28（4）：49-54[6]付媛，张雪娟，赵俊龙等.日本血吸虫22.6ku膜相关蛋白基因的克隆及原核表达[J].华中农业大学学报，2009，26（3）：357-360[7]BlasBL,RosalesMI,LipayonILetal.TheschistosomiasisprobleminthePhilippines:areview.ParasitolInt2010,53:127–134.[8]徐妮为，田智,汪世平，日本血吸虫病DNA疫苗的研究进展[J].中国病原生物学杂志，2010，5（10）：786-789[9]WuZhong-Dao,LuZhi-Yue,YuXin-Bing.DevelopmentofavaccineagainstSchistosomajaponicuminChina:areview［J］.ActaTropica2009,96:106–116[10]TardieuxI,BainesIMossakowskaM,etal.Actin-bindingproteinsofinvasivemalariaparasitesandtheregulationofactinpolymerizationbyacomplexof32/34kuproteinsassociatedwithheatshockproteins70ku[J].MolbiochemParasitol,1998,93(2):295-308[11]蒋就喜,房修罗,沈继龙,胡婷婷，日本血吸虫rSj14-3-3疫苗和rSj26GST疫苗联合免疫保护作用研究[J].中国人兽共患病学报，2010，26(9)：825-829，834[12]蔡世飞，李文桂，等.日本血吸虫Sj23疫苗研究进展[J].热带医学杂志，2010，10（1）：105-108[13]王敏,李文桂.日本血吸虫Sj97疫苗研究进展[J].中国病原生物学杂志，2010，5(3)：227-229[14]ZhangY,TaylorM,JohansenM,etal.Vac