【2】蛋白质的电泳分离(分子医学实验)

《分子生物学实验》实验报告实验名称：蛋白质的电泳分离和转膜技术姓名：陈杰学号：3140104666组别：同组同学：唐陈曦带教教师：刘伟俞萍实验日期：2015年9月22日目录1.原理： 31.1聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质 31.2SDS测定蛋白质相对分子质量 31.3转膜技术 42.操作步骤 42.1SDS测定蛋白质相对分子质量 42.1.1安装垂直板型电泳装置 42.1.2凝胶的制备 52.1.3蛋白质样品的处理 62.1.4加样 62.1.5电泳 62.1.6剥胶与染色 62.1.7脱色 62.2蛋白质转膜技术 63、实验结果 73.1原始照片记录 73.2数据处理 84.讨论： 91.原理：1.1聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质以聚丙烯酰胺凝胶为支持物的电泳方法称为聚丙烯酰胺凝胶电泳，具有机械强度好、弹性大、透明、化学稳定性高、无电渗作用、设备简单、样品用量小、分辨率高等优点，并可通过控制单体浓度或与交联剂的比例聚合成不同孔径大小的凝胶。可用于蛋白质、核酸等分子大小不同的物质的分离、定性和定量分析；还可结合解离剂十二烷基硫酸钠以测定蛋白质亚基的相对分子质量。聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺与交联剂亚甲基双丙烯酰胺在催化剂的作用下，经过聚合交联形成含有亲水性的酰胺基侧链的脂肪族长链，相邻的两个链通过亚甲基桥交联起来的三位网状结构的凝胶。聚丙烯酰胺凝胶的聚合体系有两种：化学聚合和光聚合。化学聚合通过采用过硫酸铵为催化剂，四甲基乙二胺为加速剂。在TEMED催化下，过硫酸胺形成自由基SO4·，后者可使丙烯酰胺单体的双键打开、活化形成自由基丙烯酰胺，从而引发聚合反应。而光反应形成的凝胶孔径较大，而且随时间延长而逐渐变小，不太稳定。所以一般采用化学聚合。凝胶的浓度决定了凝胶孔径的大小，交联剂的浓度对电泳泳动率也有影响。选择缓冲剂时主要从pH范围、离子种类和离子强度来考虑。不连续聚丙烯酰胺凝胶有三种效应：浓缩效应、电荷效应和分子筛效应。（1）浓缩效应：由于各种蛋白质所带的电荷量不同、相对分子质量不同，泳动的速率也不同，于是各种不同的蛋白质离子在高电压区中分别被压缩成狭窄的区带。这种浓缩效应可使蛋白质浓缩数百倍。（2）分子筛效应：由于分离胶的凝胶孔径较小，各种蛋白质根据其表面电荷多少、相对分子质量大小和分子构象的不同，在分离胶中所受的阻力不同而进行分离，表现为分子筛效应。（3）电荷效应：在整个电泳体系中，电荷效应始终是促进蛋白质样品移动的主要因素，电荷效应在浓缩胶和分离胶中都存在。1.2SDS测定蛋白质相对分子质量在聚丙烯酰胺凝胶中加入十二烷基磺酸钠（SDS）后，与SDS结合的蛋白质带有一致的负电荷，电泳时其迁移速率主要取决于它的Mr（相对分子质量），而与所带电荷和形状无关。当蛋白质的Mr在15000~20000之间时，蛋白质的Mr与电泳迁移率间的关系可用下式表示：lgMr=K-bm，式中，Mr为蛋白质的相对分子质量；m为迁移率；b为斜率；K为截距。在一定条件下，b和K均为常数。将已知相对分子质量的标准蛋白质的迁移率对Mr的对数作图，可得一条标准曲线。将未知的蛋白质样品，在相同的条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率可在标准曲线上差得它的相对分子质量。SDS是一种阴离子型去污剂，在蛋白质溶解液中加入SDS和巯基乙醇后，巯基乙醇可使蛋白质分子中的二硫键还原；SDS能使蛋白质的非共价键（氢键、疏水键）打开，并结合到蛋白质上，形成蛋白质-SDS复合物。由于SDS带有大量负电荷，当它与蛋白质结合时，所带的负电荷的量大大超过蛋白质分子原有的电荷量，因而掩盖了不同种类蛋白质间原有的电荷差异。SDS与蛋白质结合后，还引起了蛋白质构象的改变。长轴与蛋白质的相对分子质量的大小成正比。这样的蛋白质SDS复合物在凝胶中的迁移率只与蛋白质相对分子质量的函数有关。SDS缓冲系统有连续系统和不连续系统。不连续系统有较好的浓缩效应。1.3转膜技术将经过SDS分离的蛋白质样品转移到固相载体上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的蛋白质的相对位置不变。2.操作步骤2.1SDS测定蛋白质相对分子质量2.1.1安装垂直板型电泳装置1.将玻璃板用蒸馏水洗净晾干2.把玻璃板在灌胶支架上固定好。固定玻璃板时，两边用力一定要均匀，防止夹坏玻璃板。2.1.2凝胶的制备1.分离胶的制备：在一个干净的小烧杯中，按下表所列的试剂用量配置。根据室温来调节TEMED的加入量。12%SDS-聚丙烯酰胺凝胶分离胶配制用量表30%stockacrylamide（凝胶贮液）4.0mL3mol/LTris-HCl缓冲液，pH8.8（分离胶缓冲液）1.25mL10%SDS0.1mLddH2O4.0mL10%Ammoniumpersulfate0.07mL2%TEMED0.6mL将所配置的凝胶液沿着凝胶的长玻璃片的内面用1000uL取液枪加至长、短玻璃片的窄缝内，加胶高度距样品槽模板下缘约1cm。沿玻璃片内壁加一层异丙醇（用于隔绝空气，使胶面平整）。凝胶配置过程要迅速，加速剂TEMED要在注胶前再加入，否则会提前凝结无法注胶。注胶过程最好一次性完成，避免产生气泡。2.浓缩胶的制备：在另一干净的小烧杯中，按表配置浓缩胶，应根据室温来调节TEMED的加入量。混匀后用细长头的滴管或1000uL取液枪将凝胶溶液加到已聚合的分离胶上方，直至加满，轻轻将“梳子”插入浓缩胶内（插入“梳子”的目的是使胶液聚合后，在凝胶顶部形成数个相互隔开的凹槽）。约30min后凝胶聚合，再放置30min。小心拔去“梳子”，用窄条滤纸吸去样品凹槽内多余的水分。4.5%SDS-聚丙烯酰胺凝胶分离胶配制用量表30%stockacrylamide（凝胶贮液）0.75mL3mol/LTris-HCl缓冲液，pH8.8（分离胶缓冲液）0.83mL10%SDS0.1mLddH2O3.0mL10%Ammoniumpersulfate0.05mL2%TEMED0.3mL2.1.3蛋白质样品的处理取小数肝脏蛋提取白质样品80uL至一eppendorf管中，加入上样缓冲液20uL，在100℃沸水浴中保温5-10min，取出冷至室温。2.1.4加样将电极缓冲液倒入上下贮槽中，应没过短玻璃片。在同一块凝胶上分别按下表加入蛋白质样本和混合标准蛋白质样本。由于样品溶解液中含有比重较大的甘油，古样品溶液会自动沉降到凝胶表面形成样品层。第一块胶样品1样品1蛋白质marker样品2样品210uL15uL15uL15uL10uL第二块胶牛血清样品1蛋白质marker样品2牛血清15uL15uL15uL15uL15uL2.1.5电泳将上槽接负极，下槽接正极，打开电源，开始时将电流控制在60V，待样品进入分离胶后，改为100-120V，待蓝色染料迁移至下端约1-1.5cm时，停止电泳，约需1-2h。2.1.6剥胶与染色将一个电泳槽中的两块凝胶板取出，其中有牛血清对照的一块板用于染色，将凝胶切至合适的大小，放入一大培养皿内，加入染色液，染色45min。另一块凝胶板中的凝胶用于转膜。2.1.7脱色染色完毕，倾出染色液，加入脱色液。20-30min换一次脱色液，均匀晃动，2-3次后脱色过夜，直至背景清晰。2.2蛋白质转膜技术带上手套，在去离子水中切割电泳好的凝胶至合适的大小，转移到3张转膜缓冲液浸湿的滤纸上，盖上一张经甲醇激活15s-30s的PVDF膜，排除气泡后，盖上另3张同样处理的滤纸，排除气泡。按照顺序：负极-海绵-3层滤纸-凝胶-膜-3层滤纸-海绵-正极。用塑料夹夹紧后放入转移电泳装置，将电泳槽搁置冰上。90V恒压1h。取下膜用滤纸两面夹好后上交。3、实验结果3.1原始照片记录3.2数据处理电泳中蛋白质的相对分子量与相对迁移率的关系组别1.02.03.04.05.06.07.08.09.010.0相对分子量（kd)170.0130.0100.070.055.040.035.025.015.010.0迁移距离39.060.0100.0136.0178.0231.0281.0338.0469.0564.0相对迁移率0.10.10.20.20.30.40.50.60.81.0相对分子质量对数2.22.12.01.81.71.61.51.41.21.0由图表可知，函数为y=-1.27x+2.21,代入牛血清蛋白的迁移率0.25得，y==-1.27*0.26+2.21=1.87，即相对分子量为M=10^1.87=74.16kd。4.讨论：这次实验里利用SDS测定蛋白质分子质量和转膜操作是实验室中最常见和最基础的两种操作。就这次最终得到的胶而言，底端边缘较模糊；肉眼观察无法确定染色带中心位置，所以导致长度测量存在一定误差，使最终得到的74.16与准确值66.43存在较大误差。所以制备胶时要把握好时机，尤其在加入过硫酸胺和TEMED后，迅速摇匀并注胶，防止胶凝结。实验过程中有几处地方需要严格密封，否则将影响大大实验结果。制胶时长短玻璃底部要保持对齐，且与胶条紧密接触。同时胶板制作完成后，需要用加样针把不同的样品加入浓缩胶的凹槽内。由于操作不熟练，有一部分的蛋白质样品逸出凹槽或飘到的隔壁的凹槽内。样品的混合可能给测定带来了一定的误差。为解决此问题，今后的实验中如情况允许，可以间隔加样，这样在很大程度上可以避免相邻格子样品在加样时的污染和电泳时的干扰。在电泳时，样品经过浓缩胶将要进入分离胶时，观察到所有样品在浓缩胶的底部连成一条蓝色的线，这时可能会产生混合污染。同时，由于距离比较近，在电泳时两条条带的边缘部分会相互影响。最后牛血清蛋白染色带很模糊且颜色较淡，可能是注样时操纵不标准导致。注样时要注意将移液枪枪头插入分离槽底部，缓慢地注液，防止反冲使样品冲散，而且往往无法完全注完全部样品，会有少量遗留在管尖。而最后的测量是在照片上测量，