园林植物育种学-诱变育种

第八章诱变育种本章教学目的和要求1•明确诱变育种的概念与特点。•掌握辐射诱变与化学诱变育种的方法。本章教学重点和难点重点：辐射诱变常用的射线种类、处理方法；影响诱变效果的因素。难点：诱变剂量的确定；诱变后代的鉴定与筛选。教学内容：第一节诱变育种的概念、特点及发展概况一、诱变育种的概念诱变育种(mutationbreeding):人为地利用物理和化学因素诱发植物产生遗传性的变异，经过人工选择、鉴定，培育出新品种的方法。包括辐射育种和化学诱变育种。辐射育种(radiationbreeding):利用辐射(射线)诱发植物遗传物质发生变异,从中选择培育新品种的方法。化学诱变育种(chemicalinducedmutationbreeding):利用化学诱变剂诱发植物产生遗传变异，以选育新品种的技术。二、诱变育种的特点•突变率高，变异谱广自发突变：突变频率10-4〜10-5；变异范围狭窄。诱发突变：突变频率3%；变异范围广，类型多，甚至可以产生自然界尚未发现的新基因源。如四川省原子能研究所，采用Y射线处理菊花插条e花期从11月提前到4-10月。前苏联育种工作者，采用理化因素结合处理葡萄（137CsY射线照射种子+0.2%秋水仙素处理子叶期幼苗生长点）e抗病性、枝型、叶形、果色、果形等大量的变异。诱变频率为1%〜3%。.可有效改良品种的单一性状，保持其它优良特性诱发突变多为点突变。•育种程序简单，变异稳定快，育种年限短诱变多为一个主基因的改变，后代稳定快。如一、二年生草花，F3可稳定，3-4年即可出品种。园林植物多数采用无性繁殖，变异易固定。.打破原有的基因连锁，有利于基因重组.克服远缘杂交不亲和性，改变植物育性•诱发突变的方向和性质难以掌握，有利突变频率较低突变位点随机；突变方向偶然（有益或无益）.改良的性状有限诱变往往是点突变，对某些受多基因控制的数量性状改良作用不大。•变异性状具不稳定性诱发的突变有时会发生逆突变，使已产生的突变又恢复成原来的性状。容易产生嵌合体，不利于性状的稳定。三、诱变育种的发展概况1895年，伦琴发现X射线1936年，WEDemol用X射线处理Tulip，经10余年育成突变新品种'法腊迪'。1970年，全球诱变品种101个（观赏植物38个）；1981年，518个（238个）1990年，1330个（407个）；1995年，1737个（465个）包括菊花（170多个）、大丽花、六出花、秋海棠、月季、杜鹃、百合、香石竹等。我国诱变育种起步于1956年，诱变育种的成绩位居世界首位。至1998年底，育成新品种513个，其中观赏植物近100个。包括菊花（30多个）、月季（40多个）、小苍兰、瓜叶菊、朱顶红、美人蕉、紫罗兰、金鱼草、矮牵牛、杜鹃、唐菖蒲、荷花、梅花等。第二节辐射诱变的原理与方法一、射线的种类及其特征电子束a射线B射线（特定时）〔带电粒子円「粒子辐射＜

广电篦辐射彳’不带电粒子＜_八射线辐射线w电磁辐射*j非电离辐射——紫外纯、激光.Y射线来源：60Co（半衰期5.3年）、137Cs（半衰期30年）、核反应堆特点：一种高能电磁波（丙种射线）波长短（10-8-10-11cm），穿透力强可同时处理大量材料.X射线来源：X光机特点：一种高能的电磁辐射放射出的X光子（伦琴射线）波长较短（10-6-10-10cm），穿透力较强一次不能照射大量材料，诱变效果不及Y射线.B射线来源：32P、35S、电子加速器特点：带负电的粒子流（乙种射线）穿透力较弱，a射线的穿透力更弱（一般不用）只用于内照射（溶液浸种）•中子来源：核反应堆、加速器、中子发生器特点：不带电的粒子流依所带能量大小分为：热中子（1/41ev）、慢中子（1/41-100ev）、中能中子（0.1Kev-0.02Mev）、快中子（0.02-10Mev）、超快中子（〉10Mev）电离密度大，常引起大的变异.电子束来源：电子直线加速器特点：高能电子流（5-20Mev）；穿透力强（几厘米）M1生物损伤轻，M2诱变效率高.激光来源：激光器（CO2激光器、N2激光器、红宝石激光器、氩粒子激光器等）特点：一种中低能的电磁辐射（新光源）单色性、方向性、相干性好；非电离，激发作用•紫外线来源：紫外灯特点：一种低能的电磁辐射(1360-3900埃)；2500-2900埃诱变效果较好穿透能力极弱，非电离，激发作用；多用于处理花粉和微生物二、辐射诱变的机理•辐射对机体的作用直接作用射线直接击中生物大分子，使其产生电离或激发，引起原发反应。靶学说间接作用射线作用于有机体的水，引起水的电离和激发，产生自由基，这些自由基再作用于生物大分子，导致突变的发生。辐射生物学作用的时相阶段物理阶段：辐射能量使生物体内各种分子发生电离和激发；物理化学阶段:发生电离和激发的分子通过一系列反应产生许多化学性质高度活泼的自由基；生物化学阶段：自由基相互作用，并与周围其它物质发生反应，引起分子结构的变化；生物学阶段：细胞内生化过程发生改变，导致细胞内各部分结构及组成发生变化，包括染色体畸变和基因突变。.辐射对遗传物质的作用)辐射对染色体的作用引起染色体的断裂和重排：导致染色体的缺失(deficiency)、重复(duplication)、倒位(inversion)、易位(translocation)等引起染色体数目的改变(非整倍体)）辐射对DNA的作用引起DNA链的断裂和修复单链的断裂与修复：超快修复（ligase）；快修复（polymeraseI+ligase）；慢修复（多种酶参加）双链的断裂与修复碱基的破坏与修复三、辐射诱变的优点•变异频率高，变异范围广，变异类型多.可打破性状连锁遗传，实现基因重组辐射可引起染色体的断裂，实现双亲优良性状的重组.克服远缘杂交的不亲和性四、植物材料的辐射敏感性.概念：辐射敏感性（radiosensitivity）指植物材料对辐射反应的快慢与强弱。.衡量植物材料辐射敏感性的指标致死剂量（LD100）:辐射后引起全部植物材料死亡的最低剂量。半致死剂量（LD50）:辐射后引起50%植株死亡（与对照相比）的辐射剂量。临界剂量（LD60）：辐射后成活率为对照40%的辐射剂量.影响辐射敏感性的因素）遗传因素：不同的科、属、种及品种，敏感性有差异。豆科植物〉禾本科〉十字花科二倍体植物比多倍体敏感。）不同的器官组织和不同分裂时期的细胞分生组织〉其它组织；性细胞〉体细胞；卵细胞〉花粉细胞；小抱子母细胞〉发育中的小抱子〉根尖分生组织）植物不同的发育阶段及生理状态萌动的种子、枝条、鳞茎〉休眠的种子、枝条、鳞茎；配子体〉枝条〉种子；未成熟种子〉成熟种子；种子含水量低〉含水量高外界环境条件温度：温度降低，敏感性减弱氧气：有氧〉无氧；无氧条件下，幼苗损伤与染色体畸变减少，突变率增加培养基的成分五、辐射诱变的处理方法1.外照射(exogenomeirradiation)指辐射源不进入植物体内，只是利用其射线(如x射线，Y射线，中子)从外部照射植物各个器官。特点：简单安全；适于处理大量试材；可进行一代照射和多代重复照射，一次照射和多次照射。根据照射时间的长短可分为：急性照射(acuteirradiation):即快照射，采用较高的剂量率进行短时间连续照射。慢性照射(chronicradiation):用低剂量率在植物的某一个生长期内进行长时间连续照射，需要专门的田间辐射场。根据辐射材料的类型主要有：)植株照射：对完整植株进行辐射，如盆栽苗、田间苗等。)种子照射：可采用干种子、湿种子或萌动种子进行照射。多用干种子，并在干燥有氧条件下进行。优点：可同时处理大量种子；操作方便；便于贮藏、运输；受环境条件的影响较小。要求：种子预先精选，不含杂物；照射后及时播种，以免产生贮存效应。)营养器官照射：用枝条、块茎、鳞茎、球茎、块根、幼芽等进行辐射处理。照射处于活跃状态的新生组织，效果较好;受照射器官内芽原基所含的细胞越少越好；组织充实、生长健壮、芽眼饱满的芽条，照射后易于成活。4）花粉照射先将花粉收集于容器内，经照射后立即授粉（适合花粉生活力强，寿命长，花粉量大）；或者直接照射植株上的花粉（田间照射、上盆后进行室内照射、切花照射）。优点：很少产生嵌合体）子房照射：自花授粉植物，人工去雄后照射e授粉；辐射剂量不宜过高）离体材料照射：单细胞、愈伤组织、叶片等组织培养物。2.内照射将放射性元素引入植物体内，由其放射出的射线在体内进行照射。处理方法：）浸种法：将放射性同位素32P、35S等，配成一定比例浓度的溶液，浸泡种子或枝芽。）注射或涂抹法：用注射器将放射性溶液注入植株或枝条内；或用放射性溶液涂抹叶片、枝条伤口等处。）喂饲法（施肥法）：将放射性同位素施于土壤或加入培养基中，经根部吸收进入体内。六、诱变剂量的确定1•诱变剂量及其单位诱变剂量（induceddose）是指对植物材料进行辐射诱变时使用的处理剂量。1）照射剂量照射量（X）:用于度量X射线和Y射线的剂量，指X射线或Y射线在单位质量空气中产生电离大小的物理量。SI单位c/kg，常用单位R。1R=2.58X10-4c/kg；1R=1g空气吸收相当于83erg（1erg=10-7J）的能量。

粒子注量（积分流量）：指辐射场中通过与辐射方向垂直的单位面积的粒子数。单位：n/cm2。常用来度量中子的辐射量。2）吸收剂量（D）指单位质量的被照射物质实际吸收的辐射能量。SI单位Gy（=J/kg），常用单位rad。lGy=100rad3）放射性强度用来衡量辐射源的辐射强度，以放射性物质在单位时间内发生的核衰变数目来表示。SI单位：Bq（贝克），常用单位：Ci（居里）。lBq=2.073X10-11Ci；lCi=3.7X1010个核发生衰变/秒4）剂量率：单位时间内被照射植物材料所受的照射剂量或吸收剂量。照射量率：单位时间内的照射量。单位：c/kg・s,R/h,R/min,R/s粒子注量率（通量密度）：单位时间内的粒子注量。单位：n/cm2•s吸收剂量率：单位时间内的吸收剂量。单位：Gy/min,Gy/s,rad/h,rad/min,rad/s2.适宜诱变剂量与剂量率的确定通常采用半致死剂量（LD50）或临界剂量;但也有人建议，将植物的成活率60%75%时所对应的辐射剂量定为最适剂量。剂量率多在50-200R/min较好干种子：60-100R/min左右；花粉：10R/min左右常见园林植物的适宜诱变剂量见表8-1。表8-1常见园林植物辐射诱变适宜剂量表植辐射射植辐射射剂量物材料线种(krad)种类植物辐射剂量种类射线种(krad)材类类料花菊嫩茎X0.8〜0.9秋海棠叶X2〜3花菊发根插条Y1〜3毛叶秋海棠叶不定芽插Y10花菊发根插条快中子0.3〜0.5落地生根叶X2花菊组培芽点Y1〜3落地生根苗幼X，Y1.5〜2洲菊非幼株X1〜6阿美尼亚麝香兰片叶X1〜1.5丽菊大新收获块根X2〜3阿美尼亚麝香兰茎隣X3〜5斯菊波发根插条Y1〜2花叶兰子种X0.3〜0.4线菊绣干种子Y2美人蕉（2x）茎根Y2薇属蔷一年生植株X8〜9美人蕉（3x）茎根Y>2.7

薇属蔷幼嫩休眠枝Y412小苍兰茎球X2〜5薇属蔷夏芽Y2〜4虎眼万年青片叶X1薇属蔷休眠芽Y4^〜12虎眼万年青片叶Y0.3〜0.5鹃杜发根插条、幼株,X4〜6葱兰茎隣Y1.2v5鹃杜发根幼嫩枝条Y1〜3铁线莲属根插条生X0.2〜0.5菖蒲唐鳞茎X4虎耳草属根插条生X0.05〜0.4菖蒲唐鳞茎Y2.5藏红花属收获块茎新X1〜1.5菖唐休眠鳞茎Y5〜2.0连翘属根生X4〜8

蒲插条客来仙球茎Y1金莲花属株直X2〜3客来仙种子X9〜10绵刺儿属叶X0.1〜0.5信风鳞茎（挖出数周）X0.3绵刺儿属茎隣X0.5〜信风鳞茎（挖出数周）Y0.1绵紫苏条插X0.2〜信风休眠鳞茎Y2〜5常春藤条插XV5金香郁刚收获小鳞茎X0.4一品红根插条发X3〜4金香郁大鳞茎X0.5丁香属株直X3金香郁休眠鳞茎Y2〜5扶桑根插发X10〜20

条水仙黄鳞茎片X0.4〜0.5龙舌兰子种X6〜8水仙黄鳞茎X0.7〜0.8小檗种干X>60尾茑新收获鳞茎,X1茶条槭种干X15合百鳞茎片X0.25悬铃木种干Y6香晚鳞茎Y2悬铃木根插条发Y2〜4竹石发根插条Y4〜6大叶椴种干X30香石竹麝插条X6〜12欧洲椴种干X30洲苣非叶柄X1.5忍冬种干X>15

苔洲苣苔非叶Y3沙棘种干X10洲苣苔非组培芽点X5银槭种干X10寒苣苔耐叶Y2〜4石榴种干X10寒苣苔耐叶X1〜2灰青杨种干X1〜5望角苣苔好叶X3香椿种干X1〜2瓣绿属豆叶X2〜3欧洲赤松种干X1.5〜5瓣豆组培芽点Y5辽东桦种干X5绿属子出花六幼株根茎（2x）X0.35〜0.5樱桃眠接穗休X3〜5出花六幼株根茎（3x）X0.5〜0.7毛桦种干XV10竺葵天植株X1〜1.25第三节化学诱变的原理与方法一、化学诱变剂的种类及其作用机理•烷化剂类）烷基磺酸盐类（-SO2OR）和烷基硫酸盐类（-SO4R）甲基磺酸乙酯（EMS）：CH3SO2OC2H5；乙基磺酸乙酯（EES）：C2H5SO2OC2H5甲基磺酸甲酯（MMS）：CH3SO2OCH3；硫酸二乙酯（DES）：SO2（0C2H5）2硫酸二甲酯（MES）：SO2（OCH3）22）芥子气类硫芥：-S-CH2-CH2Cl；氮芥：〉NCH2-CH2Cl）乙烯亚胺（-N〈CH2CH2）和环氧乙烷类（-CH〈OCH2）乙烯亚胺（EI）：CH2-CH2；环氧乙烷：CH2-CH2NHO环氧丙烷：CH3CHCH2>0）亚硝基烷基化合物（R1-N〈R2NO）：亚硝基乙基脲（NEH）：OHC2H5>N-CONH2亚硝基乙基脲烷（NEU）：ONC2H5>N-COOC2H5烷化剂的诱变机理:这些烷化剂带有一个或多个活性烷基，它们能置换DNA分子的H原子（烷化作用），改变基因的分子结构，导致突变。.核酸碱基类似物5-溴尿嘧啶（5-BU）:取代DNA中的嘧啶，可以同A和G配对2-氨基嘌吟（AP）:取代DNA中的嘌吟，可以同C和T配对.吖啶类（嵌入剂）吖啶黄（acridineyellow），吖啶橙，原黄素（proflavin），ICR-170嵌入DNA分子双链中心的碱基之间，引起单一核苷的缺失或插入e遗传密码编组的移动（移码突变）e转录和翻译的错误，产生突变。.无机类化合物：HN02、H202、CuS04等•简单有机类化合物抗生素（丝裂霉素C、链霉素）、重氮丝氨酸等引起染色体的断裂.其它诱变剂羟胺（HA）:作用于C，使其氨基变成羟基，与A配对，G-CeA-T秋水仙素：诱导染色体数目的变异二、化学诱变的优点.操作简便，成本较低.诱变效果具有一定的专一性.破坏性较小，多引起基因的点突变三、化学诱变的处理方法.前处理处理前用清水浸泡植物材料，如种子、鳞茎等，提高敏感性。.药剂处理）浸渍法：浸泡种子、接穗、插条、块茎、鳞茎、块根等，也可将开花的花枝剪下插入药剂，吸收一定量后，开花时收集其花粉。）涂抹法和滴液法：用脱脂棉或纱布蘸取药剂涂抹植株、枝条、块茎等的生长点或芽眼，或用吸管吸取药液滴于材料的顶芽或侧芽。）注入法：利用注射器注入诱变剂溶液或用浸透诱变剂溶液的棉球包缚在茎的切口处，将药剂引入到植株、花序或枝条等。）熏蒸法：针对产生蒸气的诱变剂而言。将花粉或花序置于密封潮湿的小箱中，使药剂蒸气对其进行熏蒸。）施入法：在生长基质中加入一定浓度的诱变剂，由根吸收或通过简单的渗透扩散作用进入植物体内。.后处理通过漂洗等终止诱变剂的作用。四、影响化学诱变效应的因素.诱变剂的浓度和处理时间.温度温度较高可提高诱变剂在植物体内的反应效力。•溶液pH值•不同植物材料的敏感性不同第四节诱变材料的选择及突变体的鉴定、筛选一、诱变材料的选择.选用综合性状优良的品种.选择杂合度高的材料.选择易产生不定芽的材料。如离体叶片：非洲紫罗兰、豆瓣绿、天竺葵等；鳞茎片：百合、朱顶红、郁金香、风信子等；茎芽：菊花、一品红等。.尽可能选用单细胞或单倍体