植物组织培养

第九章植物细胞、组织及器官的超低温保存

植物种质资源是植物育种的基础，种质资源的保存方式有原生境保存和非原生境保存，非原生境保存包括移地保存（种质圃或植物园保存）、种质（种子）库保存、离体保存等。其中种质资源的离体自20世纪60年代逐渐得到广泛应用。种质资源的离体保存是对离体培养的小植株、器官、组织、细胞或原生质体等材料，采用限制生长、延缓或停止其生长的处理使之保存，在需要时可以重新恢复其生长，并再生植株的方法。离体保存又分为限制生长保存和超低温保存。限制生长保存是利用限制离体培养物的生长速度来保存种质的方法，是离体保存的常用方法。限制离体培养物生长速度的方法主要有：（1）低温保存法（2）高渗透压保存法（3）生长抑制剂保存法（4）降低氧分压保存法（5）干燥保存法而超低温保存是将要保存的材料经过适当处理后，保存在液氮中（-196℃），植物细胞生长停止，但细胞活力和形态发生潜能得到了保存。

1949年Polge发现甘油具有保存特性，标志着低温生物学的形成；

1980年开始进行玻璃化保存，开展超低温保存研究。动物细胞、组织、胚胎---植物细胞、组织、器官一、超低温种质保存的发展历史：保持细胞培养物的遗传稳定性；2.长期保存植物的种质资源;长期保存农作物的优良品种及其育种亲本材料的种质；建立长期保存的茎尖分生组织种质库及无病毒的原种；5.保存实验材料，防止再培养中遗传变异。二、超低温保存的作用及意义

在低于-700C的超低温条件下，有机体细胞内部的生化反应极其缓慢，甚至终止。因此采取适当的方法将生物材料降至超低温，即可使生命活动固定在某一阶段而不衰老死亡。当以适当的方法将冻存的生物材料恢复至常温时，其内部的生化反应可恢复正常。三、超低温保存的原理及理论依据

所谓冷冻保存，就是将体外培养物或生物活性材料悬浮在加有或不加冷冻保护剂的溶液中，以一定的冷冻速率降至零下某一温度（一般是低于-700C的超低温条件），并在此温度下对其长期保存的过程。而复苏就是以一定的复温速率将冻存的体外培养物或生物活性材料恢复到常温的过程。不论是微生物、动物细胞、植物细胞还是体外培养的器官都可以进行冻存，并在适当条件下复苏。

水在低于零度的条件下会结冰。如果将细胞悬浮在纯水中，随着温度的降低，细胞内外的水分都会结冰，所形成的冰晶会造成细胞膜和细胞器的破坏而引起细胞死亡。这种因细胞内部结冰而导致的细胞损伤称为细胞内冰晶损伤。

如果将细胞悬浮在溶液中，随着温度的降低，细胞外部的水分会首先结冰，从而使得未结冰的溶液中电解质浓度升高。如果将细胞暴露在这样高溶质的溶液中且时间过长，细胞膜上脂质分子会受到损坏，细胞便发生渗漏，在复温时，大量水分会因此进入细胞内，造成细胞死亡。这种因保存溶液中溶质浓度升高而导致的细胞损伤称为溶质损伤或称溶液损伤。

当温度进一步下降，细胞内外都结冰，产生冰晶损伤。但是如果在溶液中加入冷冻保护剂，则可保护细胞免受溶质损伤和冰晶损伤。因为冷冻保护剂容易同溶液中的水分子结合，从而降低冰点，减少冰晶的形成，并且通过其摩尔浓度降低未结冰溶液中电解质的浓度，使细胞免受溶质损伤，细胞得以在超低温条件下保存。在复苏时，一一般以很快的的速度升温，，1-2分钟内内即恢复到常常温，细胞内内外不会重新新形成较大的的冰晶，也不不会暴露在高高浓度的电解解质溶液中过过长的时间，，从而无冰晶晶损伤和溶质质损伤产生，冻存的细胞胞经复苏后仍仍保持其正常常的结构和功功能。冷冻保保护剂对细胞胞的冷冻保护护效果还与冷冻速率、冷冷冻温度和复复温速率有关。而且不不同的冷冻保保护剂其冷冻冻保护效果也也不一样。1.主要仪仪器设备(1)用于于组织和细胞胞培养的全套套设备；(2)普通通电冰箱；(3)-70℃--80℃的低低温冰箱；(4)程序序降温器；四、超低温保保存的基本设设备和程序(5)玻璃璃或塑料试管管（5ml或或10m1），封盖盖严密，不进进液氮；(6)液氮氮;(7)光学学显微镜和紫紫外荧光显微微镜；(8)分光光光度计。2.基本本程序(1)材料料的准备与选选择。(2)预处处理。(3)将材材料装入试管管，并随即插插入冰浴中。。(4)加入入0℃预冷的的冰保护剂，，在0℃(冰冰浴中)放置置30一45分钟。(5)降温温冰冻。(6)保存存后的化冻：：一般在37—40℃℃温水浴中快快速化冻。(7)活力力测定,通通常采用TTC法(氯化化三苯四氮唑唑还原法)。。如果是单细细胞或原生质质体，可采用用活性荧光素素染色法，显显示活细胞，，统计存活率率。(8)再培培养，观察组组织细胞恢复复生长的速度度、存活率、、植株的再生生能力。(9)遗传传性状的分析析：如植株的的形态特征、、生长发育状状况、染色体体、同工酶及及抗逆性等。。1．材料的特特性；基因型、抗冻冻性、器官组组织和细胞年年龄、生理状状态。2．预处理目的：A.增增加细胞分分裂和同步化化；B.减少细细胞内自由水水的含量；C.增强细细胞的抗寒性性。五、影响超低低温保存效果果的主要因素素预处理方法：：(1)细胞、、组织继代培培养中．细胞胞分裂分化同同步化的调控控，增加指数数生长期细胞胞。(2)预培养养，增加培养养基中的糖浓浓度，提高渗渗透压；或在在预培养基中中加入诱导抗抗寒力的物质质或冰冻保护护剂，如脱落落酸(ABA)，山梨糖糖醇、脯氨酸酸及二甲基亚亚砜(DMSO)等。(3)低温锻锻炼：如香石石竹茎尖经4℃低温预处处理14天，，不仅提高了了存活率．而而且分化率从从30％增加加到60％。。3．冰冻保护护剂迄今，已经报报道了多种类类型的冰冻保保护剂。常用用的是二甲基基亚砜(DMSO)、甘甘油、糖和糖糖醇类物质、、氨基酸、多多肽及聚乙二二醇等。但作为冰冻保保护剂的物质质应该具备以以下特性：（（1）易溶于水水；（2）在适当当浓度下对细细胞无毒；（3）化冻后容易从从组织细胞中中去除。冷冻保护剂的的作用：(1)降低低冰点，促进进过冷却和““玻璃态化””的形成；(2)提高高溶液的粘滞滞性，阻止冰冰晶的生长，，(3)DMSO可使膜膜物质分子重重新分布，增增加细胞膜的的透性，在温温度降低时，，加速细胞内内的水流到细细胞外结冰，，防止细胞内内结冰的伤害害；(4)稳定定细胞内的大大分子结构，，特别是膜结结构，阻止低低温伤害，非非透性保护剂剂的主要作用用在质膜上。。4．降温冰冻方方法(1)快速速冰冻法：将将材料从0℃℃，或者其他他预处理温度度(如木木本植物的冬冬芽在-3℃℃一-10℃℃预处理20天)直接投投入液氮。其其降温速度在在每分钟l000℃以上上。植物体内的水水分在降温冰冰冻过程中，，从-10℃到到-140℃℃是冰晶形成成和增长的危危险温度区，，在-140℃以下，冰冰晶不再增生生。因此，快快速冰冻法成成功的关键在在于，利用超超速冷冻，使使细胞内的水水分迅速通过过冰晶生长的的危险温度区区，即细胞内内的水分还未未来得及形成成冰晶中心，，就降到了-196℃的的安全温度，，从而避免了了细胞内结冰冰的危险。(2)慢速冰冰冻法：通常常成熟的植物物细胞都具有有大的液泡，，含有大量水水分。对大多多数植物材料料说来，不适适宜采用快速速冰冻法，而而需要在冰冻冻保护剂存在在的条件下，，采用慢速冰冰冻法。以每分钟0.1-10℃的降温速速度(一般1—2℃／分分较好)。降降到—70℃℃左右，随即浸入液氮氮，或者以此此种速度连续续降到一196℃。在这这种降温速度度下，可以使使细胞内的水水分有充足的的时间不断流流到细胞外结结冰，从而使使细胞内的水水分减少到最最低限度，达达到良好的脱脱水效应，避避免细胞内结结冰。(3)两步冰冰冻法：这种种方法是慢冻冻法和快冻法法的结合，或或者说，是一一种改良的慢慢冻法。第第一步是是用慢速降温温法从0℃降降到一定的预预冻温度，使使细胞达到适适当的保护性性脱水；第第二步，投入入液氮中迅速速冰冻。(4)逐级冰冰冻法：此方方法是制备不不同等级温度度的冰浴，如如—10℃，，—15℃，，—23℃，，—35℃，，或—40℃℃等。保存材材料经冰冻保保护剂在0℃℃预处理后，，逐步通过这这些温度，样样品在每级温温度上停留一定时时间(4—6分钟)，然然后浸入液氮氮。5．化冻方法法实验证据证实实，植物的冻害常常发生在冰凉凉和化冻两个个过程。因此要使植物物种质的超低低温保存获得得成功，不仅仅要求有一个个合适的降温温冰冻程序，，而且还要求求采取合适的的化冻方法，，以避免在化化冻过程中产产生细胞内的的次生结冰，，并应防止在在化冻吸水过过程中水的渗渗透冲击对细细胞膜体系的的破坏。通常采用快速速化冻方法，，即将液氮保保存后的材料料在37—40℃的温水水浴中化冻。。因为超低温温冰冻材料化化冻时，再次次结冰的危险险温度区域大大约是—50℃至—10℃。从理论论上说，借助助迅速的化冻冻速度通过此此温度区，从从而避免细胞胞内次生结冰冰。6．光照对恢恢复生长的影影响黑暗条件下有有利于超低温温保存培养物物的恢复生长长。显示细跑活力力的TTC法法(氯化三苯苯四氮唑还原原法)，，反映脱氢酶酶活力。2．显显示细细胞存存活率率的二二醋酸酸酯荧荧光素素(FDA)染染色法法，反反映酯酯酶的的脱脂脂化作作用，，或采采用中中性红红染色色法。。3.再再培培养新新鲜培培养基基上培培养。。存在在停滞滞期。。六、超超低温温保存存后细细胞活活力、、存活活率及及遗传传特性性的观观测4.遗遗传传性状状的分分析：：1)细细胞全全能性性的保保持：：形态态发生生能力力的表表达情情况。。2)后后代的的形态态特征征及生生长发发育状状况。。3)后后代染染色体体的分分析。。4)同同工酶酶谱的的分析析。5)特特殊产产物的的分析析。6)抗抗逆性性的分分析。。1.已已进进行超超低温温保存存的植植物：：目前已已超过过30种种植物物成功进进行了了愈伤伤组织织及悬悬浮细细胞超超低温温保存存。保保存后后的材材料表表现出出较高高的存存活率率。七、愈愈伤组组织及及悬浮浮培养养细胞胞的超超低温温保存存2．组组织和和细胞胞超低低温保保存实实验程程序(1)将培培养5一7天的的悬浮浮培养养细胞胞，或或培养养10一15天天的愈愈伤组组织收集于于保存存试管管中，，每管管0.5-1.0ml。。(2)将盛盛有材材料的的试管管插入冰冰浴中中，待温度度平衡衡后，，加入0℃预预冷的的冰冻冻保护护剂(10％DMSO+0.5mo1／L山山梨糖糖醇)，使保护护剂稍稍淹过过保存存材料料。在在0℃℃放置置30分钟钟。(3)以1℃／／分的的降温温速度度从0℃降降到-10℃，轻轻轻摇动动试管管，使使试管管内的的溶液液结冰冰。停停留15－－20分钟钟。然然后以以同样样降温温进度度降到到-30℃℃－-40℃，，停留留2小小时，，然后后浸入入液氮氮中。。(4)在液液氮中中贮存存一定定时期期后，，取出出材料料在37——40℃温温水浴浴迅速速化冻冻，化冻后后立即即转移移到20℃℃水浴浴中。。(5)化冻冻后，，用含3％％蔗糖糖的液液体培培养基基洗涤涤3次次，为减轻轻和避避免渗渗透冲冲击的的伤害害，培培养液液应逐逐步加加入。。(6)洗涤涤后立立即转移到到新鲜鲜培养养基上上进行行再培培养：或者者不经经洗涤涤，直直接转转移到到半固固体培培养基基上，，或漂漂浮于于液体体培养养基的的滤纸纸上培培养。。先置置于黑黑暗条条件下下培养养15—30天天，然然后转转移到到光照照下培培养。。(7)待恢恢复生生长后后，统计存存活率率。此外，，在化化冻洗洗涤后后，可可采TTC法和和FDA荧荧光染染色法法观测细细胞的的活力力和存存活率率。(8)当愈愈伤组组织长长到良良好状状态时时，转移到到分化化培养养基上上，检检验形形态发发生能能力的保持持情况况。(9)植株株形态特特征、、生长长发育育及遗遗传性性状的观察察和分分析．．1、茎茎尖超超低温温保存存植物物种类类：八、芽芽及及茎尖尖分生生组织织的超超低温温保存存2.茎茎尖分分生组组织的的超低低温保保存程程序：：（1））种子消消毒灭灭菌，种子子经70％％酒精精迅速速漂洗洗，10％％漂白白粉溶溶液消消毒20分分钟，，无菌菌水洗洗涤4次．．(2)在无菌条条件下下播种种于具润润湿滤滤纸的的灭菌菌培养养瓶或或培养养皿内内。置置于25——28℃培培养箱箱中黑黑暗培培养。。(3)萌发发生长4—5天后后，在在无菌菌条件件下切切取茎茎尖的的分生生组织织，0.3一0.5mm长，第1对叶叶原基基。在在实体体解副副镜下下进行行操作作。(4)将切切取的的茎尖分分生组组织接接种于于固体体B5培养养基上上，内内含0.5pmol／LBA及及5%DMSO，光照照16小时时，温温度20℃℃／15℃℃预培培养48小小时。。(5)预培培养后后，将将培养养瓶浸浸入冰浴中中2小小时。(6)将茎茎尖分分生组组织转移到到在冰冰浴中中预冷冷的具具有1m1液体体B5培养养基的的离心心管中。(7)逐步步加入等等体积积的预预冷的的10％DMSO，，在30分分钟内内加完完，使使DMSO的最最终浓浓度为为5%，然后再再放置置10一30分分钟．．(8)密封封离心心管口口，以每分分钟降降低0.6℃的的速度度慢速速降温温到——40℃，，然后后浸入入液氮氮中(—196℃)。(9)在液液氮中中贮存存—定定时期期后，，取出材材料在在27℃水水浴中中迅速速化冻冻。化冻冻后．．立即即将试试管转转移到到冰浴浴中．．(10)用用等体体积B5培培养基基在30分分钟钟内内，，分分6次次逐逐步步加加入入试试管管中中。。(11)吸吸去去混混合合液液，，并并用用B5培培养养基基洗洗涤涤4次次。。然然后后将将茎尖尖分分生生组组织织转转移移到到固固体体B5分分化化培培养养基基上。。3周周后后可可分分化化成成苗苗。。植植株株的的再再生生率率达达70％％以以上上，，已已有有的的试试验验表表明明，，贮贮存存2年年多多仍仍能能存存活活。。Sakai(1990)和和Yamada(1991)建建立立了了一一种种茎茎尖尖分分生生组组织织的的超超低低温温保保存存简简便便方方法法，，该该技技术术的的关关键键是是，，在冰冰冻冻前前，，用用高高浓浓度度的的冰冰冻冻保保护护剂剂使使保保存存材材料料脱脱水水，，以以致致不不需需要要慢慢速速程程序序降降温温，，从从室室温温直直接接浸浸入入液液氯氯，，即可可获获得得很很高高的的存存活活率率。。保存存程程序序：：(1)从从试试管管苗苗中中切切取取茎茎尖尖分分生生组组织织。。(2)在在含含1．．2mo1／／L山山梨梨糖糖醇醇的的B5培培养养基基上上4℃℃预预培培养养2天天。。(3)将将预预培培养养后后分分生生组组织织放放入入试试管管，，然后后加加入入高高浓浓度度的的冰冰冻冻保保护护剂剂。。在在含含0。。4mo1／／L蔗蔗糖糖的的B5培培养养基基中中溶溶解解30％％(w／／v)甘甘油油，，35％％(W／／v)乙乙二二醇醇和和15％％(w／／V)DMSO，，在在25℃℃停停留留5分分钟钟，，或或者者在在0℃℃停停留留15分分钟钟，，期期间间更更换换2次次溶溶液液。。(4)直直接接浸浸入入液液氮氮保保存存。。(5)贮贮存存一一定定时时间间后后，，在25℃℃水水浴浴中中快快速速化化冻冻，，为280℃℃／／分分。。(6)化化冻冻后后，，倒倒出出保保护护剂剂，，将材材料料放放入入含含1.2moI／／L蔗蔗糖糖的的B5培培养养基基中中，，25℃℃10分分钟钟。。(7)转转移移到到固固体体B5培培养养基基上上的的灭灭菌菌滤滤纸纸上上。。1天天后后，，再再转转移移到到新新鲜鲜的的同同样样培培养养基基滤滤纸纸上上，，25℃℃、、l4小小时时光光照照下下培培养养。。3天天内内恢恢复复生生长长，，3周周后后产产生生成成苗苗，，成成苗苗率率(存存活活率率)达达80——90％％。。该方方法法也也适适用用于于愈愈伤伤组组织织及及悬悬浮浮培培养养细细胞胞。。2010年年12月月14日日9、静夜四无无邻，荒居居旧业贫。。。12月-2212月-22Sunday,December25,202210、雨中黄叶叶树，灯下下白头人。。。01:12:0801:12:0801:1212/25/20221:12:08AM11、以我独沈沈久，愧君君相见频。。。12月-2201:12:0801:12Dec-2225-Dec-2212、故人江江海别，，几度隔隔山川。。。01:12:0801:12:0801:12Sunday,December25,202213、乍见翻翻疑梦，，相悲各各问年。。。12月-2212月-2201:12:0801:12:08December25,202214、他乡生生白发，，旧国见见青山。。。25十二月月20221:12:08上午01:12:0812月-2215、比不了得就就不比，得不不到的就不要要。。。十二月221:12上上午12月-2201:12December25,202216、行动动出成成果，，工作作出财财富。。。2022/12/251:12:0801:12:0825December202217、做前前，能能够环环视四四周；；做时时，你你只能能或者者最好好沿着着以脚脚为起起点的的射线线向前前。。。1:12:08上上午1:12上上午午01:12:0812月月-229、没有有失败败，只只有暂暂时停停止成成功！！。12月月-2212月月-22Sunday,December25,202210、很很多多事事情情努努力力了了未未必必有有结结果果，，但但是是不不努努力力却却什什么么改改变变也也没没有有。。。。01:12:0801:12:0801:1212/25/20221:12:08AM11、成功就就是日复复一日那那一点点点小小努努力的积积累。。。12月-2201:12:0801:12Dec-2225-Dec-2212、世间成事，，不求其绝对对圆满，留一一份不足，可可得无限完美美。。01:12:0801:12:0801:12Sunday,December25,202213、不知香积寺寺，数里入云云峰。。12月-2212月-2201:12:0801:12:08December25,202214、意志坚强强的人能把把世界放在在手中像泥泥块一样任任意揉捏。。25十二二月20221:12:08上上午01:12:0812月-2215、楚塞三湘湘接，荆门门九派通。。。。十二月221:12上上午12月-2201:12