No.1 - 如何把液相做到“打游戏”课件

谢沐风上海市食品药品检验所如何把液相做到“打游戏”请大家将手机调至“振动”档！(包括闹钟、叫醒、工作安排、约会等)

谢谢您的配合！液相色谱在药物分析工作中具有举足轻重地位液相色谱仪是药物分析工作者最常用的“一门武器”。本人工作16.7年，深感何时能将液相做到有“打游戏”感觉时，便是到了游刃有余、庖丁解牛的境界。现今的液相软件均已具备了强大的数据处理功能，如能运用自如，便可具有事半功倍之效。二、 流动相的配制与使用1. 恒度洗脱

一定是将水相与有机相混合后、抽滤（使用混合型过滤膜），用一个管路（如A管）泵入仪器，这是使用的基本原则。

切勿因节约有机相、便于摸索色谱条件等原因而使用两个管路（一个纯水相、一个纯有机相）泵入仪器，即便配制了脱气机。因此种情形极易造成水相中盐和表面活性剂的少量析出。★剩余流动相完全可继续使用，密封后放置阴凉处；待下次试验时与新配制的流动相混合后使用。

★无需担心发霉、无机盐析出、挥发、比例不准等问题，这些皆为疑神疑鬼的表现。（引申至分析人员切忌陷入过度谨小慎微、患得患失的工作状态，要锻炼自己“不干不净、吃了没病”的魄力和勇气！）

★实践是检验真理的唯一标准！实践吧~2. 梯度洗脱

流动相配制最为科学的方式是：A相为高比例水相-低比例有机相、B相为低比例水相-高比例有机相（英国药典几乎均如此）；其次为：A相为高比例水相-低比例有机相、B相为纯有机相；最不科学的为：A相为纯水相、B相为纯有机相，如既有质量标准采用了此种方式，建议改为第二种或第一种方式，否则基线漂移严重，难以进行稳定的杂质检测。2. 梯度洗脱

梯度洗脱结束后，建议经5分钟回到初始状态，再平衡5分钟后开始下一测定。这10分钟的稳定极为关键。切勿短时间内回到初始状态，会对仪器和色谱柱损伤较大。（引申至液相一定要配制自动进样装置，这样1台的工作效能可与3台手动匹配。说服领导！）三、 色谱柱的安装以上安装顺序遵循的是：逐级排放气泡和仪器内存留的洗液，使得安装后气泡极难混入。本人曾试验梯度洗脱连续试验一周，第一针与最后一针主成分保留时间相差在6秒以内。四、 试验后色谱柱的清洗1.2 水相中有无机盐、表面活性剂或三乙胺、高氯酸等物质时

先采用纯水（或含有2%甲醇），冲洗A管路（试验采用哪个管路，就要从头到尾冲洗该管路），时间30分钟（如流动相中有表面活性剂，适当增加时间），流速1.0ml/min，柱温可较试验温度高出5~10℃；随后更换成20%甲醇再冲洗30分钟，流速同上，柱温箱加热装置关闭。结束后取下色谱柱放置阴凉处。四、 试验后色谱柱的清洗2.其他类型色谱柱

查询获取如何科学合理地使用与清洗保存该类型色谱柱的方法，切勿盲动，否则易导致色谱柱性能急剧下降。五、 试验顺序工作流程如下进行：

(1)0~2小时配制流动相、对照品和供试品溶液等，切勿催促昨日试验同事。

(2)2~3小时采用A管路注入流动相（B、C、D管路一般不用，除非梯度洗脱才用到B管路），平衡1小时。如流动相中有表面活性剂，建议前一晚小流速过夜，第二天上班后将流速增至1.0ml/min，平衡1小时后即可开始检测。(3)3~5小时测定空白溶剂，一定要做到基线不漂移后方可开始检测样品。所谓“不漂移”，通常系指以1.0%自身对照溶液主成分峰高约20%高度来设定的视野范围观察所得，切不可设定过小，使杂质峰显得很突兀、基线抖动得很厉害，弄得人很担心。

(4)5~8小时配制完所有样品，预试了对照溶液和供试品溶液，设定好自动进样程序，程序最后一针设定为小流速过夜，紫外灯关闭。勿设定为切换至B管路洗脱，此举得不偿失。(5)9~24小时放心回家，让仪器自动进样，除非不稳定样品采取“即配即测”方式。充分利用下班后的16小时，做到从容不迫、镇定自若。

(6)第二天0~0.5小时检查并计算昨晚试验结果，如发现不良记录，将流速增至1.0ml/min，平衡30分钟后，测定重新配制的该份样品即可（同时回校对照一针）。无需全部重新测定，不要过度谨小慎微。

(7)第二天0.5~2.0小时如上冲洗色谱柱，交给其后试验同事。六、 液相软件的使用★现今几大主流品牌的硬件性能已相差无几，主要还是软件的设计是否能使操作者得心应手、随心所欲。

★建议掌握各软件的批处理、编辑样品处理模板等功能，做到一劳永逸，让软件充分为工作所用。“工欲善其事、必先利其器”。

★本人曾用20分钟完成500个溶出度样品数据处理，做出溶出曲线图。体会一下~只有溶出度/释放度才是☆

这里所指的溶出度/释放度是指：在多pH值溶出介质中溶出曲线的测定，绝非一个介质、一个时间点、一个限度的测定。

☆该测定已成为“剖析”和“肢解”口服固体制剂内在品质一种抽丝剥茧、循序渐进的重要手段；成为固体制剂内在品质呈现于外在的一种“表象”、“映射”与“载体”。“固体制剂内在品质的灵魂与核心所在”！环境（用pH值表达）蠕动强度（虽年龄增长、减弱）

人体消化道中最为关键的两个参数人体内消化道各器官的变化范围

消化道各器官变化范围胃pH1.2-7.6

表面张力(dyne/cm2)35-50

胃液体积(ml)5-200十二指肠pH3.1-6.7

收缩压(mmHg)<3-30小肠pH5.2-6.0胆汁酸(mM)0-17

液体流速(ml/min)0-2从专业角度看：疗效的优劣，即药物在体内吸收的多寡，是与生物利用度密切相关的。优质药品，可在任何体内环境下（即pH值宽范围内）都有一定的崩解、溶出，即对任何人群均有较高的生物利用度。劣质药品，可能只在一种体内环境下（如胃酸正常者）才有一定的溶出和吸收，而在其他体内环境下可能崩解、溶出就会很差，生物利用度也就很低。（我国药品的问题恰在这里）02461000246中年妇女0.6A药厂产品

B药厂产品05002460.20.400246Time(h)老年患者02460246年轻小伙不同制剂的溶出度试验曲线与不同患者体内生物利用度的关系——引申至转速比较溶出度试验不同患者体内生物利用度桨板法、50转桨板法、75转桨板法、100转彼此间就不相关了！100转0204060801000102030Time(min)%dissolvedAB50转0204060801000102030Time(min)%dissolvedAB0.00.51.01.52.02.502468Time(h)Concentration(ug/ml)CapsuleACapsuleB具体实例：两吲哚美辛胶囊溶出度与生物利用度的相关性不相关相关在身体机能虚弱者体内●体内外相关性理解(Ⅰ)：

体外一致→体内多数一致、BE试验成功率高！

何谓“体外一致”？

●如何提高BE试验成功率？

不可能试验一个处方、进行一次生物等效性试验！第一层理解：均能够具有相似的溶出曲线生物等效大多数药物极少数药物生物不等效体外溶出度试验，在各种溶出介质中，在严格的溶出度条件下（低转速）生物等效性试验这样就大大提高了生物等效性(BE)试验的成功率！但并不能替代BE试验。生物利用度体外多条溶出曲线处方/辅料/制剂工艺原研药

生物利用度体外多条溶出曲线处方/辅料/制剂工艺仿制药相同相同不同90%企业界的使命仿制药研发的必由之路→“殊途同归”体外都不一致→体内多数不一致、BE试验成功率很低！《日本药品品质再评价工程》就是充分利用了该点。再评价时，由于无法再进行大量“BE试验”，故只好采用体外溶出曲线比对方法。

给予仿制药厂一定时间、更改处方与工艺，使多条溶出曲线与原研制剂一致！第二层理解：pH7溶出度pH10204060801000204060..0204060801000204060Time(min)02460510152025Time(h)02460510152025胃酸正常患者预测体内血药浓度实测体内血药浓度胃酸缺乏患者不同厂家生产的甲硝唑片体外溶出度与体内血药浓度的相关性A药厂产品B药厂产品01234567010203040Time(h)01234567010203040Time(h)年轻人老年人

体内一致、即BE试验成功→并不意味着仿制制剂临床疗效就一定与原研制剂相当。因BE试验是采用年轻男性、是人体的最佳状态、这也是BE试验的局限性所在！而原研制剂在临床阶段经过大量病例验证。越来越多的文献报道，通过BE试验的部分仿制药临床疗效与原研药依然有差距。第三层理解：只有通过对体外溶出度（释放度）的严格要求，才能尽可能地增加仿制药在年老患者、在体质虚弱患者体内生物利用度高的概率。这一观点弥补了“生物等效性试验的局限与不足”！

2014年2月，媒体报道：FDA低调开展仿制药一致性评价。予以解读……对溶出度试验严格要求的意义体内不一致、即BE试验失败→则肯定会在体外某个溶出度条件下两者呈现显著性差异，关键就看体外溶出度研究的深度与程度了（已有愈来愈多的案例证明）第四层理解：只要体外溶出度试验比较得越充分、越多层次、多角度，多方面，就可使仿制药的内在品质无限趋近于原研药，从而实现仿制药的品质提升，做到简便易行、科学合理、便于重现、难以造假！口服固体制剂仿制药质量一致性评价技术手段——多条溶出曲线★

片剂/硬胶囊：多条溶出曲线/释放曲线、崩解时限（如需要）、有关物质、含量均匀度、硬度/脆碎度。

★

注射用粉末：

(1)表层指标：有关物质、溶液颜色、溶液澄清度、水分、pH值、无菌、热原/内毒素和不溶性微粒等。

(2)深层指标：粒度分布、粒子形状、晶型、晶格能、比表面能、分散性、流变学特性等→复溶/溶解时间的不同，该指标很重要！列举各剂型关键性评价指标1.部分仿制药品的临床疗效不如原研药★某些固体制剂国产药与进口原研药相比、临床疗效相距甚远、价格也相差悬殊！★为什么不同厂家生产的同一制剂、甚至同一厂家生产的不同批号，病人服用后都会有不同疗效。具体表现为：已上市的国产仿制药中部分固体制剂对于某些患者属“安全无效”和“安全不怎么有效”范畴。《规划》颁布前业内部分现状

（从“全局产业链”的高度分析……）2.市场抽验合格率“居高不下”——

因为目前的质量标准拟定得太宽泛……

在某些关键指标上的拟定甚至有时是为了让产品合格；未能抓住品质关键，合格率自然很高。

开个玩笑：有些质量标准、想不合格都难！《规划》颁布前业内部分现状

（从“全局产业链”的高度分析……）卡马西平片的四条溶出曲线桨板法、75转、在四种介质中，5分钟和30分钟时分别取样测定，限度分别为不得过60%和不得少于70%中国药典（2010年版）：桨板法、150转、0.1mol/L盐酸1000ml、60min、65％限度完美制剂的完美表达！尼群地平片的四条溶出曲线桨板法、100转、在四种介质中（其中均含0.15％的吐温-80），45分钟，限度均为70%中国药典（2010年版）：桨板法、100转、0.1mol/L盐酸溶液－乙醇(70:30)900ml，60分钟，60%限度★标准就是生产力★在目前国内制药行业现状下，唯有制订出高标准、严要求的质量标准和科学严谨的评价体系，才能撬动企业进行深入细致的研发与良好规范的生产；因为只有当产品按要求检验不合格时，企业才知晓差距在何处、努力的方向在何处!3.“国家药品评价性抽验工作”简介（2008年起）

●背景按目前质量标准检验几乎皆合格，而临床疗效却有明显差异。

●目的力争通过“探索性研究”，找到我国已上市的仿制药在体外某些检测指标上与原研药的差距，从而为临床疗效差距提供佐证！

（本人负责指导了全国药检所开展“采用体外多条溶出曲线剖析口服固体制剂内在品质”工作。经过5年实践，成果喜人；学以致用、深感欣悦！）《规划》颁布前业内部分现状

（从“全局产业链”的高度分析……）●结果以下五大类有难度的制剂，国内已上市仿制药体外多条溶出曲线与原研品一致的可谓“凤毛麟角”，很多皆相差甚远。该差距为体内生物利用度、为临床疗效差距提供了佐证。★难溶性药物制剂★缓控释制剂★肠溶制剂★pH值依赖型制剂★治疗窗狭窄药物制剂2009年国家评价性抽验结果启示原研品3个批号

——完美制剂的完美表达！2009年国家评价性抽验结果启示国内五家企业产品4条溶出曲线！2009年国家评价性抽验结果启示国内另六家企业产品！（引申至印度仿制药）日本肠溶制剂仿制药研发要求(Ⅰ)酸性介质(50rpm)pH6.0介质(50rpm)

请注意：延迟释放！日本肠溶制剂仿制药研发要求（Ⅱ）

pH6.8介质(50rpm)pH6.0介质(100rpm)

请注意：延迟释放！

请注意：延迟释放！●为此、国家药监总局网站“十二五规划解读（建议大家阅读）”中有这样的描述：“……。因此，仿制药与原研药相比，质量存在一定的差距。对此情况，国家食品药品监督管理局开展了上市药品的质量评价性验证工作。结果显示，仿制药总体质量有保证，但部分产品与原研药存在一定差距，主要体现在体外溶出度和体内生物等效性的指标上，这两项指标是反映药品等效的重要指标。”（这可谓是进行了6年评价性抽验的最大收获！）4.GMP的实施与药品品质间关系

★各企业纷纷投入巨资进行了硬件改造与升级换代，可药品品质却依旧差强人意。这其中的缘由何在？

请允许本人作个比喻：“做药好比做馒头”、“GMP好比厨房和制作馒头的工艺”。我国的现状是：“用五星级厨房生产出死面疙瘩”；应是“用三星级厨房生产出五星级馒头”。

因此可以说：我国的GMP与药品品质没有必然联系，只有认知到这一点，我们才能理性客观地知晓努力的方向与奋斗的目标，才能将有限的人力、物力和财力用在实处!!!《规划》颁布前业内部分现状

（从“全局产业链”的高度分析……）《规划》出台背景●针对固体制剂是安全性为主、还是有效性为主？

国家局在2011年下半年组建《规划》撰写小组，深入调研了本行业各方面情况与现状。同时，在高层领导深入基层了解我国药品质量现状时，有专家大胆指出：现今是解决有效性问题的时候了！

于是，《仿制药一致性评价工程》应运而生！交流两个小故事……★

在外企工作的同学，面对物价局领导的提问，机敏灵活的回答……

★

2009年下半年《基药目录》刚开始招标时，本人在为发改委领导“技术上空中加油”时坦陈的回答和预测，果然三年后验证，符合客观规律！要点解读:如何找到最具区分力的溶出曲线(1)45~60min达85%溶出量的曲线。

(2)90~120min达85%溶出量的曲线。

且无突释和拐点。这样的曲线既不快、也不慢。

●仿制药研发时需要它！

●仿制药质量评价时需要它！

●仿制药做什么都需要它！

引申至既有质量标准，很多均为“烟雾弹”！今后对通过评价的产品如何监管预测可能会引入多条溶出曲线测定手段，以期使仿制制剂企业具备持续生产高品质药品的能力，否则难免会出现再次得过且过的局面，最终将使得我国的QbD应运而生！“撬动”整个制药产业链的全面发展（“四两拨千斤”！）……使广大人民群众能够使用到品质优良、价廉物美的“有效药”!溶出度的深入研究和严格要求这一过程，必将“任重而道远”!小结：如何科学地进行药物品质评价？1.确定参比制剂/原研制剂

2.

获得数批样品，检测关键性指标

3.

测定仿制制剂这些指标

4.

有针对性地制订质量标准，撬动仿制制剂

的品质提升。

5.

举例（肠溶制剂溶出度试验的制订……）从宏观讲述杂质对于临床的意义

（强调：以下仅代表个人观点）●口服固体制剂仅是“锦上添花”：若主成分尚未吸收，遑论那0.5%杂质；解决主要矛盾后再来研究杂质。故“杂质不是高科技，生物利用度才是高科技”。从宏观讲述杂质对于临床的意义●注射剂不良反应与杂质基本无关（有点儿“颠覆”，呵呵~~，详细讲述……）世界卫生组织N年前就已指出“能吃药不打针，能打针不输液”的用药原则，盖因“是药三分毒”，药物（系指主成分）是把“双刃剑”，即有七分优点、三分缺点，……2012年本人看到媒体报道：

挪威人埃玛·格里森在《中国日报》撰文，

讲述自己在中国的经历：我生病了，被人带到医院以便打点滴。打点滴？在挪威，只有快要死去的病人才打点滴；而在中国，得个感冒都要打点滴，还不止1瓶液体，而是5瓶以上。MyGod!发达国家向非发达国家“发射的两枚烟雾弹”●一枚是有关物质：目的为引入歧途。●另一枚是溶出度：往往韬光养晦、瞒天过海。因为这是最为核心的评价法：不会评价，就不知做出来的“馒头是死面疙瘩还是五星级馒头”；只有会科学客观地评价，才能做出与原研制剂一致的高品质仿制药来，即通常所讲的“标准就是生产力”！●

请记住：全世界都公开的技术指标（包括进口质量标准）就一定不是高科技，看不到的才是高科技。（详细讲述……）★已基本呈现“剑走偏锋、误入歧途”之状态，甚至“上天入地、走火入魔”的窘境！★具体试验时，已陷“刻舟求剑、缘木求鱼”的学术思维窠臼，落入极度疑神疑