农杆菌转化法及转基因植物检测方法

农杆菌转化法及转基因植物检测方法摘要：近年来，植物基因工程技术飞速发展，转基因植物在很多领域的研究推广取得了令人瞩目的成绩。植物基因工程中常用的转化方法一般是通过土壤农杆菌系统、植物病毒系统和DNA直接导入法这三种方法进行。另外，转基因技术快速发展的同时转基因植物检测技术也在不断地进步和完善，目前被广泛应用的转基因植物检测方法有三类：整合水平上的检测、转录水平上的检测和表达水平上的检测。本文着重对农杆菌介导的植物转化方法和转基因植物的检测两方面进行综述。关键词：农杆菌，转化，转基因植物，检测方法伴随着生命科学的飞速发展，植物组织培养技术以及植物组织分化、植物基因重组等技术发展迅速并得到广泛应用。1984年转基因烟草的诞生［1］,使外源基因导入植物细胞从而获得转基因新品种的设想成为现实。随后，转基因技术被广泛应用于各个方面如：植物新品种的改良、植物性状改良、植物抗性的提高以及植物基因功能的研究等［2-4］0新型转基因大豆、转基因番茄及转基因玉米等转基因新品种陆续面世［5］0植物转基因技术不但能够打破植物的物种界限，还能够使物种基因彼此进行交流。使植物育种年限缩短，植物育种进程加快，植物抗性也在一定程度上得到很大提高，使来自于不同生物种类的优良目的基因导入植物并得到优良植物新品种。同时，运用转基因技术研究植物自身基因结构组成及其基因功能调控等方面也取得了一定成果；运用转基因技术还研制出生物反应器和雄性不育系［6］。目前，利用转基因技术将目的基因导入植物基因组中的常用方法主要有：土壤农杆菌介导的基因转化、DNA直接导入和植物病毒系统介导法。本文着重介绍土壤农杆菌介导的目的基因转化法，同时也对目前转基因植物的检测进行适当总结。土壤农杆菌介导系统的种类土壤农杆菌中的发根农杆菌和根癌农杆菌能够侵染植物伤口并形成与土壤农杆菌中大质粒有关的植物月中瘤和冠嘤能够诱发此类月中瘤的根瘤农杆菌中常常农杆菌中大质粒有关的植物月中瘤和冠嘤能够诱发此类月中瘤的根瘤农杆菌中常常带有分子量为200-250kb的Ti质粒。研究者对不同株系的根癌农杆菌进行比较得出结论：Ti质粒通常有四个同源区，T-DNA和Vir区与植物月中瘤的形成有关，另外两个区与目的基因的接合转移以及质粒自身复制有关。根癌农杆菌中的T-DNA进入植物细胞后，可以自行插入植物染色体的基因组，改变基因组结构组成。而发根农杆菌侵染寄主植物后，Ri质粒将会诱发植物被侵染部位产生大量毛状根。Ti质粒载体系统根癌农杆菌侵染植物细胞时将根癌农杆菌Ti质粒上的T-DNA插入植物基因组中，以此来改变植物基因组的组成。位于T-DNA上的基因能够编码控制植物生长素和植物细胞分裂素的合成，使被侵染的植物细胞过度增殖而产生瘤。同时T-DNA编码合成的Opines化合物，可以被农杆菌利用并作为碳氮来源。因此农杆菌和寄主植物能够形成彼此互利和共生的密切关系。大量研究数据表明，农杆菌中负责T-DNA转移的有三种组分：Ti质粒上的T-DNA、Ti质粒上的vir基因序列和chv基因序列。由25个不完整的碱基对顺向重复构成了T-DNA,通常T-DNA编码产生的基因序列不能促使自身转移，因此在插入目的基因的过程中可以去掉T-DNA原有内部基因；vir基因序列通常位于T-DNA外。寄主植物被农杆菌侵染后，伤口会分泌出许多化合物，这些化合物与编码vir基因的蛋白质发生反应，产生T-DNA拷贝并被导入寄主细胞中。Chv基因通常与细菌趋化性和受伤植物细胞粘附性有关，与T-DNA的转移也有着密切联系。但在转基因过程中，将野生型Ti质粒作为植物载体存在着很多弊端：Ti质粒的分子量过大，常规实验方法难以操作，在T-DNA片段上无法找到用于插入外源DNA片段的单一限制性内切酶位点；另外将可能诱发冠嘤病的Ti质粒导入健康的植物细胞组织后，很大可能会导致植物的病态。因此，经过改良后的Ti质粒才能够被运用于基因克隆中。目前，对野生型Ti质粒进行改良得到两种载体系统：共和载体系统和双元载体系统。共和载体系统共和载体系统又被称作one-载体法，此方法将Ti质粒作为给体载体，利用给体载体上的Vir区域进行T-DNA转移。将外源目的基因与大肠杆菌的常用质粒pBR322进行连接，形成中间载体，将给体载体与中间载体进行同源重组以此替代给体载体中可缺失的T-DNA片段，最终形成共合体载体。共和载体中包含了目的基因片段及全部的中间质粒片段，这样会导致后期的结果分析复杂化。而隔端载体的出现很好地解决了这一难题。隔端载体是将两个T-DNA上的LB和RB分别放置于给体载体和中间载体上，进行同源重组后，目的基因便只存在于转移片段上，此方法优化了装个转化体系[7]o双元载体系统双元载体系统由辅助载体和双向载体两个载体组成，这两种载体是彼此相容的两个Ti质粒。辅助载体上的Vir区域可辅助T-DNA的转移，双向载体通常寄主范围广，带有T-DNA片段并可作为DNA转移载体。当外源基因连接到双向载体后，双向载体因其分子量小具备易于复制的优点，在大肠杆菌中大量复制，从而得到更多的目的基因。双元载体在不用构建质粒共合体的同时避免了共和载体系统可能出现的同源区问题。双元载体上的多克隆位点和植物选择标记基因有利于后期的植物筛选，细菌选择标记基因有利于对转化菌种的选择，达到了“三菌结合”。随着双元载体系统的快速发展，PART27通用双元载体质粒应运而生。该质粒上带有CaMV35S启动子、RK和ColEl复制子、多克隆位点以及章鱼碱合成酶基因的转录终止序列，其中RK和ColEl复制子能够应用于高拷贝复制中。此外PART27通用双元载体质粒上的壮观霉素和链霉素抗性基因可以辅助在大肠杆菌中的筛选。当今，双元载体系统在农杆菌介导系统中已被广泛应用网。Ri质粒载体系统发根农杆菌中的Ri质粒可以构建出完整的onc+载体，Ti质粒则不能进行。发根农杆菌侵染植物时，在Ri质粒的诱导作用下，伤口产生大量毛状根，毛状根在植物激素的进一iM乍用下分化，形成可育的完整个体。但目前对于发根农杆菌中的Ri质粒的研究还只停留在研究次生代谢物和根瘤形成原因上，Ri质粒系统的研究较少。根癌农杆菌的转化方式根癌农杆菌侵染植物细胞后，将T-DNA导入植物基因组中，这个过程非常复杂。植物伤口处会分泌一些小分子酚类化合物，这些化合物能够将农杆菌粘连在植物细胞表层类似玻连蛋白的分子。植物伤口附近是一种高浓度酸性环境，并且有大量多酚化合物，这些因素能够促使农杆菌中vir基因表达。VirA接收这一信号后，Vir蛋白自发地酸化，同时VirG也发生酸化，进而形成VirA-VirG双组分转录调控系统。各vir基因启动子区域的共有序列vir框在VirG作用后，其它vir基因也发生表达。产生具有内切酶活性的VirDl/VirD2,VirDl作用于T-DNA右端使其形成切口，VirD2蛋白随即结合于T-DNA切口处5-端，形成“引导末端”，最后形成的单链T-DNA很可能带有单链结合蛋白VirD2。VirD2蛋白与T-DNA结合后，使T-DNA在一定程度上避免核酸酶降解。virB位点的11个ORF能够合成蛋白通道，T-DNA经过此通道进入植物细胞，最后在VirD2和VirE2发出的核蛋白信号指引下进入细胞核，整合入植物染色体基因组。根癌农杆菌转化就是通过细菌间接合，利用大肠杆菌将带有目的基因的克隆载体转入农杆菌中，以农杆菌为媒介最终进入植物细胞。将外源目的基因导入植物基因组的方法主要有三种：活体接种法、共培养转化法和叶盘转化法。活体接种法活体接种法是利用仪器在植物幼株表皮形成伤口，在植株伤口处直接涂抹大量新鲜培养的土壤农杆菌菌液，伤口感染农杆菌后将产生月中瘤。近年来运用微波轰击法在烟草和向日葵顶端制造细小伤口用于农杆菌侵染，转化效率明显提高[9]共培养转化法依据受体水平的不同，共培养转化法可分为愈伤组织共培养、原生质体共培养和悬浮细胞共培养。原生质体共培养能形成单细胞愈伤组织，即形成的转基因植株由一个转化细胞增殖产生，大多发生在单细胞或者双细胞阶段，这种方法具有很好的转化效率，使用较广泛。叶盘法选取植物无菌的叶片，剪成1cm2左右的叶盘，放入事前准备好的一定浓度的农杆菌菌液中进行侵染处理。将处理完的叶盘依次放入滤菌培养基，筛选培养基和生根培养基进行筛选培养，直到长出幼嫩植株后移入土壤中进行培育。由于叶盘法操作简单，周期短易于重复操作，目前己被广泛应用于实验室常规培育。其它运用农杆菌的转化方法电穿孔法是将Ti质粒作为一种DNA分子，导入花粉后利用花粉的再生能力获得完整植株。利用电穿孔技术使植物细胞在一定程度上损伤，用土壤农杆菌对其进行感染，从而达到农杆菌侵染的目的。在带有冠嘤组织的液体培养基中培养白蝇，白蝇吸收的营养成分中带有用于转化的根癌农杆菌，利用白蝇的传播过程将农杆菌转入植株［10］。但是在单子叶植物中农杆菌转化法往往不能发挥作用。当根癌农杆菌感染大多单子叶植物伤口时，伤口处没有发生任何变化。有报道指出，单子叶植物中用于转化的靶组织或者细胞与细菌不能有效的进行粘连，如果选取分生能力强的靶组织细胞将能^^有效地解决这一难题。另外，T-DNA在双子叶植物和单子叶植物中存在着一定的整合差异。近年来利用农杆菌LBA4404侵染多种水稻盾片的愈伤组织获得很大成功，使农杆菌转化法在单子叶植物中的研究进展更进一步［11］。转基因植株检测技术随着植物基因工程技术的快速发展，具有优质、高产和抗病虫等优良特性的转基因农作物出现，同时转基因植物的检测技术也得到快速发展和提高。转基因检测技术通常在整合水平、转录水平和表达水平三个方面进行。整合水平上的检测有PCR检测、Southernblot检测和染色体原位杂交检测；转录水平上的检测有RT-PCR检测、Northernblot检测；表达水平上的检测有组织化学染色检测、Westernblot检测、荧光蛋白检测、ELISA检测、叶片涂抹除草剂检测和叶片退绿检测等。下面着重介绍整合水平上的检测。PCR检测20世纪80年代Mullis发明了一种体外核酸扩增技术即聚合酶链反应（PCR）。该技术用少量外源DNA作为模板，加入该基因的特异性引物，在DNA聚合酶的作用下经过高温变性、低温退火、适度延伸的循环反应，使目的基因得以快速扩增。根据目的基因或标记基因设计出PCR引物，从转基因作物中能够扩增出外源目的基因片段，而非转基因作物则不能。目前PCR技术己被广泛应用于外源目的基因检测、目的基因标记、基因分离克隆等多个领域。Southernblot检测1975年Southern提出DNA印迹转移技术即Southernblot[12],是将DNA片段经限制性内切酶消化后进行琼脂糖凝胶电泳，待变性后用高盐缓冲液将凝胶中DNA片段转到硝酸纤维素薄膜上，变性后的DNA单链即与薄膜结合，经过烘烤单链固定在膜上，最后与带有放射性标记的探针杂交，检测与探针有同源性的DNAo之后Sambrook对Southernblot检测技术进行了一定的改进[13],在目的基因附近选择具单切位点的内切酶对基因组DNA酶切，将标记好的基因片段作为探针与处理过基因组DNA进行杂交。含目的基因的基因组片段与探针能够发生同源重组并显示出杂交信号，利用杂交信号便可以分析出转基因植物中外源基因的拷贝数。Ortiz利用Southernblot检测技术对使用基因枪法转入小麦中的hpt基因和bar基因进行检测，得出外源基因在小麦中能进行稳定整合且hpt作为筛选标记可行。Cheng利用Southernblot检测技术对农杆菌介导的转基因小麦进行检测，得知外源基因稳定整合且单拷贝整合植株达到了35%[14]。Hu利用Southernblot检测技术对农杆菌介导法和基因枪法进行比较得出：农杆菌介导法得到的转基因植株整合拷贝数少，质量高[15-16]。叶兴国对多种转基因作物进行Southernblot检测得出了大量外源基因拷贝数在寄主植物中的遗传规律[17]0染色体原位杂交技术染色体原位杂交技术是以Southernblot和Northernblot技术为基础形成的，是细胞学、分子生物学和组织化学三者共同结合的产物，在重复DNA序列物理作图、多拷贝基因家族物理作图、低拷贝或单拷贝DNA序列定位等多方面得到应用。染色体原位杂交技术是根据碱基互补配对原理，将DNA用荧光素、同位素和Gimsa进行标记做成探针，再将标记好的探针与变性后的DNA染色体杂交，具有同源序列的DNA进行配对后,目标DNA在染色体上面的物理位置即清晰可见。早期，植物染色体附加系、代换系和易位系的鉴定通常需要使用原位杂交技术，近年来原位杂交技术同时被广泛应用于转基因植物检测中。位置效应通常在植物基因表达中非常重要，外源基因在寄主细胞中的具体位置不但影响外源基因在植物中的表达，同时对植物自身内在基因的表达也有着一定影响。通过原位杂交检测技术得到的杂交信号能够充分证明外源基因已成功转入植物染色体上，再利用核型分析和分子标记法就能够确定外源基因的具体位置[18]°Pederde制究出转基因大麦、转基因小黑麦和转基因小麦中外源基因的具体位置、包含外源基因的染色体、外源基因的整合位点及整合形式[19]。针对转GUS、bar、hpt的多基因水稻JDV88、92、105、JDTA44进行原位杂交检测得出T-DNA的插入位点及其拷贝数[20]。Chen对转GFP基因的4个大麦株系进行原位杂交试验确定了GFP在各个株系中的整合染色体及拷贝数[21]。Anand对转几丁质酶基因和葡萄糖酶基因的两种小麦进行荧光原位杂交检测，得出外源基因全为单拷贝且全部整合到寄主染色体顶端田。参考文献Herrera-EstrelIaL,VandenBroeckG,MaenhautR.Expressionofforeigngenesinregeneratedplantsandintheirprogeny[J].Nature,1984,310:115-120.DunsmuirP.Themolecularbasisofsulfonylureaherbicideresistanceintobacco[J].PlantMolecularBiologyManual,1988,1-17.SouthgateEM,DaveyMR,PowerJB.Factorsaffectingthegeneticengineeringofplantsbymicroprojectilebombardment[J].BiotechnologyAdvances,1995,13:631-651.GasserCS,FraleyRT.GeneticallyEngineeringPlantsforCropImprovement[J].Science,1989,244:1293-1299.AngelisK,BrizaJ,SatavaJ.T-DNAintegration:amodeof川egitimaterecombinationinplants[J].MutationResearch,1992,273(3):271-280.MarianiC,DeBeuckeerM,TruettnerJ.Inductionofmalesterilityinplantsbyachimaericribonucleasegene[J].Nature,1990,347:737-741.GriersonD[M].PlantGeneticEngineering.1991,(11):49-51.GleaveAP.AversatilebinaryvectorsystemwithaT-DNAorganisationalstructureconducivetoefficientintegrationofclonedDNAintotheplantgenome[J].PIantMolecularBiology,1992,20(6):1203-1207.BidneyD,ScelongeC,MartichJ.MicroprojectilebombardmentofplanttissuesincreasestransformationfrequencybyAgrobacteriumtumefaciens[J].PlantMolecularBiology,1992,18(2):301-313.ZeidanM,CzosnckH.Mappingandintrogressionofatomatoyellowleafcurlvirustolerancegene,TY-1[J].MolPlantMicrobeInteract,1994,7(6):792-798.HieiY,OhtaS,KomariT.EfficienttransformationofricemediatedbyAgrobacteriumandsequenceanalysisoftheboundariesofT-DNA[J].PlantJournal,1994,6(2):271-282.SouthernEM.DetectionofspecificsequencesamongDNAfragmentsseparatedbygelelectrophoresis[J].MolBiol,1975,98:503-517.SambrookJ,FritschEF,ManiatisT.MolecularCloning:ALaboratoryManual[M].NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989:281-289.ChengM,FryJE,PanS.GeneticTransformationofwheatmediatedbyAgrobacterium[J].PlantPhysiol,1997,15(3):971-980.HuT,MetzS,ChayC.Agrobacterium-mediatedlarge-scaletransformationofwheat(Triticumaestivum)usingglyphosateselection[J].PlantCellReports,2003,21:1010-1019.VladimirS,LarryG,PrinceA.Agrobacterium-mediatedtransformationofseedling-derivedmaizecallus[J].PlantCellRep