2022肝癌免疫治疗潜在耐药机制分析(全文)

2022肝癌免疫治疗潜在耐药机制分析（全文）摘要肝癌是临床常见的恶性肿瘤之一，其发病率逐年增加，大多数患者诊断时已处于中晚期阶段，往往预后较差。肝癌的发生发展与免疫系统的消除、平衡、逃逸三个阶段密切相关。近年来，免疫检查点抑制剂已经在临床研究中取得了广泛进展和应用，为改善晚期肝癌患者生存率带来了明显转机。但同时，药物治疗的耐药性随之而来。肿瘤细胞对药物反应性较差，是严重影响临床预后的一大问题。本文对肝癌免疫治疗中先天性耐药和获得性耐药的潜在发生机制作一综述。原发性肝癌是全球第六大最常见的癌症和第三大癌症死亡原因，原发性肝癌包括肝细胞癌(hepatocellularcarcinoma，HCC)(占75%~85%)、肝内胆管癌(占10%~15%)以及其他罕见类型[1]。目前，乙型肝炎病毒(hepatitisBvirus，HBV)、丙型肝炎病毒(hepatitisCvirus，HCV)是引HCC的常见原因，在亚洲和非洲的大多数国家中，HBV感染是HCC的驱动因素，HBV携带者发生HCC的终生发病风险范围为10%~25%[2]。同时，在全球范围内，酒精相关肝病、代谢综合征、非酒精性脂肪性肝病等因素均增加了肝癌的风险[3]。研究表明，免疫系统抑制或者促进肿瘤发生和进展的过程被称为肿瘤免疫编辑，其复杂的形式是通过三个阶段进行的，即：免疫消除、免疫平衡和免疫逃逸[4]。在消除阶段，先天性和适应性免疫系统可识别并杀死未能实现自我凋亡的潜在肿瘤细胞。少数能够存活的肿瘤细胞进入平衡阶段，在平衡阶段，肿瘤的生长受到限制，随着时间推移，自身免疫系统会与之抗衡，肿瘤细胞生长繁殖处于相对停滞状态。最后，极少数肿瘤细胞在自身遗传因素不稳定或免疫细胞耗竭等相关因素下，同时产生相对低致免疫原性的抗原，逃避免疫系统的识别和破坏。基于此，以免疫检查点抑制剂为主的治疗应运而生。2011年，美国食品和药物管理局批准了用于治疗黑色素瘤的依匹单抗，这标志着癌症免疫治疗新时代的开始。随着如今针对多种不同癌症的程序性死亡蛋白-1(programmeddeath-1，PD-1)和程序性死亡蛋白配体-1(programmeddeathligand-1，PD-L1)单克隆抗体的批准，免疫治疗晚期肿瘤患者的医疗理念和方法已经深入人心。2021年版美国国立综合癌症网络指南推荐阿替利珠单抗+贝伐珠单抗为晚期肝癌一线靶向免疫治疗的优选方案[5]。对于没有明确治疗靶点的晚期肝癌患者，免疫治疗是一种非常好的选择，但在临床应用中耐药的发生将严重影响预后，因此进一步深入研究免疫治疗的耐药机制对于改善患者预后有重要意义[6]。本文将对肝癌免疫治疗中先天性耐药和获得性耐药的潜在发生机制作一综述。一、先天性耐药根据是否有药物反应及作用时间，先天性耐药常发生在治疗初期，患者并未取得药物治疗后的改善或者缓解。1．肿瘤免疫原性抗原表达下调：肿瘤突变负荷(tumormutationalburden，TMB)是指肿瘤基因组中平均Mb范围内所包含的体细胞蛋白编码区点突变、插入缺失等基因变异数量。TMB产生相应的免疫原性新抗原，激活CD8+T细胞并诱导肿瘤排斥，达到清除肿瘤细胞的作用[7]。2017年Goodman等[8]发表的除外黑色素瘤和非小细胞肺癌的篮子试验纳入了包括3例肝癌在内的63例接受免疫治疗的患者，研究发现虽然中位总生存期接近，但17例高TMB患者比例中低TMB患者在中位无进展生存期(10.0个月比2.1个月)和客观缓解率(47%比9%)上更具有优势。低TMB导致免疫原性新抗原的低表达，抑制了免疫消除反应，免疫治疗效果往往较差。此外，具有错配修复缺陷(deficientmismatchrepair，dMMR)的肿瘤以微卫星序列改变为特征，可累积数千个突变。这种TMB使肿瘤具有免疫原性，并对免疫治疗敏感[9]。错配修复功能完整(proficientmismatchrepair，pMMR)者遗传不稳定性的发生风险减少，产生微卫星不稳定及致免原性的新抗原减少，使肿瘤细胞逃避免疫消除的可能增加。KEYNOTE-016试验将41例患者分别分配到结直肠癌合并dMMR组(11例)、结直肠癌合并pMMR组(21例)和非结直肠癌合并dMMR组(9例)，结果显示，结直肠癌合并dMMR组患者的免疫相关客观缓解率和无进展生存期发生率分别为40%和78%，非结直肠癌合并dMMR组患者分别为71%和67%，而结直肠癌合并pMMR组患者分别为0和11%[10]。而MLH1、PMS2、MSH2、MSH6这四个错配修复基因发生缺陷时，肝癌患者生存可得到改善。2．抗原提呈缺陷：抗原提呈是免疫细胞杀伤肿瘤细胞的重要过程。主要组织相容性复合体(MHC)I类分子和β2-微球蛋白(beta-2-microglobulin，B2M)是抗原提呈的重要组成部分，B2M对于正确的MHCI类折叠和进一步运输到细胞表面至关重要。有学者分析了17例接受免疫检查点抑制剂治疗的转移性黑色素瘤患者的纵向肿瘤活检标本，观察到29.4%的进展性疾病患者中B2M的杂合性缺失(lossofheterozygosity，LOH)、点突变或缺失突变[11]。在先天性耐药患者中，LOH是更常见的B2M改变形式。有研究通过Sanger测序分析了2765例良性和恶性肿瘤(包括45例肝癌患者和23例肝母细胞瘤患者)组织中的B2M热点突变，发现9例(7.5%)微卫星不稳定型结直肠癌和3例白血病中存在B2M突变，但在其他肿瘤中未发现[12]。在B2M突变型和野生型对照组中发现CD8+T细胞浸润差异没有统计学意义，表明B2M突变的发生率较低，且对于肿瘤微环境(tumormicroenvironment，TME)中的CD8+T细胞浸润无明显影响[12]。3．信号通路：(1)干扰素-γ(interferon-γ，IFN-γ)信号通路：肿瘤抗原被识别后，T细胞产生IFN-γ，通过IFN-γ受体、非受体型酪氨酸蛋白激酶(januskinase，JAK)1和JAK2以及信号转导和转录激活因子(STAT)导致大量干扰素刺激基因的表达，其中大多数是有益的抗肿瘤作用，例如通过诱导蛋白酶体亚单位、抗原处理相关的转运蛋白和MHC表达，以及通过趋化因子吸引T细胞导致肿瘤生长停滞和凋亡。然而，IFN-γ还提供增加肿瘤细胞PD-L1表达的信号使T细胞失活，从而特异性地逃避其细胞毒性作用。当IFN-γ发生突变时，JAK-STAT信号通路失活，PD-L1抗原表达下降，导致产生先天性耐药[13]。有学者筛选了48个不表达PD-L1的黑色素瘤细胞系，以确定Ⅰ型(α和β)或Ⅱ型(γ)干扰素对PD-L1表达的影响，发现IFN-γ最有可能诱导PD-L1表达[14]。同时，IFN-γ信号通路还可以产生趋化因子(chemokines，CXCL)9、CXCL10和CXCL11诱导T细胞、NK细胞和NKT细胞进入TME中杀伤肿瘤细胞[7]。研究发现，IFN-γ信号通路的缺失同样会导致抗CTLA-4治疗的耐药，数据显示，在转移性黑色素瘤患者中，高比例(75%，9/12)的伊普利单抗无应答者存在IFN-γ信号通路的基因组缺陷，包括关键IFN-γ途径基因的丢失，如IFN-γ受体(interferongammareceptor，IFNGR)1、IFNGR2、干扰素调节因子1(interferonregulatoryfactor1,IRF-1)、JAK2，以及重要IFN-γ途径抑制基因的扩增[如细胞因子信号抑制物1(suppressorofcytokinesignaling1，SOCS1)和活化STAT蛋白抑制剂4(proteininhibitorofactivatedSTAT4，PIAS4)][15]。在肝癌中也可能同样存在IFNGR1、IRF-1、SOCS1和PIAS4等IFN-γ信号通路相关基因的突变或缺失。(2)WNT/β-连环蛋白(WNT/β-catenin)通路：WNT/β-catenin在细胞内信号转导与细胞黏附过程中起重要作用。HCC患者WNT/β-catenin通路的改变可能会导致免疫治疗耐药的发生。可能因为β-catenin的激活可促进免疫逃逸，导致树突状细胞募集缺陷和细胞活性受损。研究显示，WNT/β-catenin可通过抑制抗原交叉呈递过程中的三系树突状细胞的功能而损害T细胞启动，进而导致免疫治疗包括抗PD-1和抗CTLA-4单克隆抗体联合治疗耐药的产生[16]。一项对27例可评估HCC影像学资料患者的研究显示，10例WNT通路改变的患者均未获得临床益处(所有患者在第一次影像学检查时均有疾病进展)，而17例非WNT通路改变的患者中有9例(53%)达到持久疾病稳定期(≥4个月)或更好的反应[17]。对于接受免疫检查点抑制剂治疗的31HCC患者，激活WNT/β-catenin信号改变与较低的疾病控制率(0比53%)、较短的中位无进展生存期(2.0个月比7.4个月)和较短的中位总生存期(9.1个月比15.2个月)相关。(3)磷脂酰肌醇3-激酶(phosphoinositide3-kinase，PI3K)信号通路PTEN蛋白缺失：PI3K途径通过调节细胞增殖、分化等关键过程，在肿瘤发生发展中起重要作用。肿瘤发生最常见的方式是肿瘤抑制因子PTEN的表达缺失。PTEN是一种抑制PI3K信号活性的脂质磷酸酶，控制多种生物过程，包括维持基因组稳定性、细胞分化、迁移、增殖和代谢。PTEN水平和活性发生突变时也会增加肿瘤易感性，导致肿瘤进展。PTEN的缺失与多种肿瘤类型中PI3K-AKT通路的激活增加有关[18]。一项关于PTEN缺失在人类黑色素瘤和同基因小鼠黑色素瘤模型中的作用以及免疫治疗疗效的研究发现，在缺乏PTEN的情况下，肿瘤细胞在体外和体内对肿瘤特异性T细胞的细胞毒性作用具有更强的抵抗力[19]。PTEN的表达也与抗PD-1治疗的反应和体外扩增的肿瘤浸润淋巴细胞(tumorinfiltratinglymphocyte，TIL)呈正相关。肿瘤基因组图谱中软组织肉瘤数据集的RNA测序数据显示，PTEN缺失的肿瘤T细胞浸润减少，溶解细胞活性降低，相关基因(如编码CD8α和颗粒酶B的基因)表达降低[20]。Meng等[21]通过对微小RNA微阵列的研究发现，miR-21的异常表达可通过调节PTEN的表达和PTEN依赖性途径促进HCC的生长和扩散，PTEN依赖性途径也参与介导了肝癌细胞的生长、迁移和侵袭。同样，缺PTEN的肝癌细胞可能会对细胞毒性T淋巴细胞介导的免疫治疗产生更高的耐药性。4．免疫微环境：肿瘤免疫治疗疗效与TME密切相关。肿瘤及免疫细胞通过各种分泌形式改变和维持TME条件，调节肿瘤的生长和发展。例如，肿瘤细胞分泌和释放转化生长因子-β(transforminggrowthfactor-β，TGF-β)和白细胞介素-10(interleukin-10，IL-10)，TGF-β与T细胞表面的受体结合，并通过激活下游通路分化为调节性T细胞(regulatorycells，Tregs)，同时还促Tregs的增值；IL-10与T细胞结合激活下游JAK通路，并通过相关分子磷酸化激活信号传导及转录蛋白3(signaltransducerandactivatoroftranscription3，STAT3)，并增加叉头框P3基因(forkheadboxp3，Foxp3)的表达[22]。Foxp3主要通过转录共调节蛋白调节Tregs的免疫抑制功能并将T细胞分化为Tregs。除调节因子外，还释放微小RNA，其中mir-214可直接结合T细胞，内吞并降低PTEN蛋白表达，激活PI3K-AKT信号通路，促进Treg增值。免疫抑制细胞在肿瘤细胞周围的聚集可以抑制细胞毒性T细胞(cytotoxiclymphocyte，CTL)的功能。例如，Tregs作为抗原特异性T细胞功能的负性介质，通过产生免疫抑制物质，如IL-10、TGF-β和细胞外腺苷，抑制CD8+T细胞的激活、增殖和功能。骨髓源性抑制细胞通过上调免疫抑制产物一氧化氮合酶和活性氧抑制免疫细胞；树突状细胞可诱导幼稚T细胞分化为无功能状态，同样，肿瘤相关细胞因子，如血管内皮生长因子(VEGF)、IL-10、前列腺素E-2和TGF-β也可影响树突状细胞的抗原提呈功能[23]。TME中其他趋化因子如CXCL9、CXCL10、CXCL11的降低，也会导致TIL募集的减少[7]。由HCC细胞分泌外染色体circUHRF1通过上调共抑制分子T细胞免疫球蛋白黏蛋白-3(Tcellimmunoglobulinmucin3，TIM-3)的表达，诱导自然杀伤细胞衰竭，同时其高表达还与不良预后和病理特征显著相关，提示其对HCC具有促瘤作用。这些情况下将产生耐药，影响患者的预后。二、获得性耐药根据是否有药物反应及作用时间，获得耐药常发生在治疗中、晚期，患者能够取得一定的药物疗效、疾病改善或者缓解。有研究对比了已产生获得性耐药患者治疗前后的非小细胞肺癌抗原，发现肿瘤中7~18种突变新抗原缺失，证实了免疫编辑的存在，即新抗原缺失是基因组改变的结果[24]。进一步研究发现，缺失的新抗原能够引起自体T细胞培养扩增，表明T细胞依赖性免疫编辑是在免疫治疗过程中发生的。类似这样的新抗原缺失也可能在肝癌细胞中出现，引起TIL浸润减少，导致获得性耐药发生。在部分肿瘤免疫治疗前已经可以观察到B2M突变，从而导致了抗PD-1/PD-L1治疗的先天性耐药形成，但更多证据表明，包括黑色素瘤、结直肠癌和肺癌等在内的肿瘤在治疗过程中获得B2M突变，或是治疗前存在B2M突变潜能的肿瘤细胞在免疫检查点抑制剂治疗形成的微环境的影响下，激活B2M突变，并产生免疫治疗的获得性耐药[12,25]。其他先天性耐药的产生机制也可能在肝癌患者免疫治疗过程中发生，导致获得性耐药的发生。除外上述情况，肝癌免疫治疗的获得性耐药还可能存在如下机制。1．替代免疫检查点的产生：(1)TIM-3上调：Koyama等[26]对小鼠模型研究发现，长期使用抗PD-1抗体可上调TME中TIL的TIM-3表达，通过TIM-3的额外抑制信号限制TME中的TIL功能，而再使用抗TIM-3抗体阻断后，抗PD-1抗体重新发挥免疫疗效；并在2例使用抗PD-1药物获得性耐药的患者中证实了类似的TIM-3上调。临床研究也证实，治疗后TIL中TIM-3的上调表达，引起获得性耐药。在HCC患者TME中，TIM-3+CD8+TIL细胞增殖减少、细胞活性降低以及细胞因子产生，提示T细胞抗肿瘤活性较低，同样，TIM-3高表达的CD4+TIL的增殖和激活潜能降低[27]。(2)淋巴细胞激活基因-3(lymphocyteactivatinggene-3，LAG-3)：LAG-3表达于活化的T细胞、NK细胞、B细胞和树突状细胞上，通过与MHCⅡ类分子高亲和力结合，在T细胞增殖的负调控中发挥重要作用。LAG-3通过调节性T细胞产生大量IL-10和TGF-β1，抑制CD8+T细胞的激活、增殖和功能，抑制免疫反应导致肿瘤免疫逃逸[28]。PD-1和LAG-3对肿瘤免疫逃逸具有强大协同作用。双重抑制LAG-3和PD-1可以增强CTL抗肿瘤活性。因此，在LAG-3高表达的TME中，肝癌患者接受抗PD-1/PD-L1或CTLA-4治疗也可能因CTL生物学活性降低而导致获得性耐药。(3)T细胞免疫球蛋白和ITIM结构域(TcellIgandITIMdomain，TIGIT)：TIGIT是一种在淋巴细胞上表达的抑制性受体，TIGIT与抗原呈递细胞或肿瘤细胞上表达的CD155相互作用，从而下调T细胞和NK细胞的功能。TIGIT还通过促进Treg释放IL-10和TGF-β抑制免疫反应；也可以与TIM-3协同作用导致肿瘤免疫逃逸[28]。在小鼠和人类的各种恶性肿瘤的研究中，均报道TIL上TIGIT表达增加。其中，Chiu等[29]研究发现，肝癌患者抑制分子TIGIT在活化的CD8+T细胞中高度表达，并且在抗PD-1治疗后诱导增加，从而导致获得性耐药发生。而TIGIT及其配体CD155的表达上调也同时提示了肝癌的低分化。2．T细胞耗竭：T细胞衰竭是癌症进程中出现的一种T细胞功能障碍状态。特征包括：对抗原刺激的低增殖反应、效应功能(细胞因子产生和杀伤功能)的逐渐丧失、多种