免疫印迹201300111课件

副教授2012.12免疫印迹

(Immunoblot/Westernblot)1免疫印迹(immunoblot/westernblot)2在电场作用下将电泳分离的蛋白由凝胶转移至固相载体，用识别此多肽的抗体进行检测基本原理3基本步骤51.检测样品中的蛋白。基于：被测蛋白与抗体的特异性结合以及蛋白质的相对分子量2.未知抗原与已知蛋白的关系3.评价新抗体的特性4.蛋白质酪氨酸残基是否发生磷酸化5.不能用于检测蛋白质的生化特性、化学修饰或半寿期应用6

7基本流程

1.将蛋白质经凝胶电泳按分子量大小不同依次分离SDS

2.将分离的组分转印到印迹膜

转印3.对转印到印迹膜的蛋白成分进行免疫学检测

杂交显色

8分离胶(8ml)待分离蛋白质的分子量（KD）溶液>5030～4020～30<20丙稀酰胺/双丙稀酰胺的总百分数8％10％12％15％30：0.8丙稀酰胺/双丙稀酰胺2.13ml2.67ml3.20ml4.00ml去离子水3.87ml4.0ml2.80ml2.00mlTris.HCl/SDSpH8.8（4×）2.00ml2.00ml2.00ml2.00ml10％过硫酸铵(APS)45ul25ul45ul45ul四甲基乙二胺(TEMED)12ul10ul12ul12ul加胶至距短板上沿2.5cm,加水至短板上沿引发剂增速剂10制胶★不连续电泳:使用不同孔径和不同缓冲系统的电泳

浓缩胶(积层胶)的作用:使样品在浓缩胶和分离胶的界面上先浓缩成一窄带;便于分离以及得到漂亮的蛋白条带.

分离胶的作用:分离分子量不同的蛋白质亚基(分子筛效应)SDS－PAGE原理12+14带负电荷的SDS-蛋白复合体+15大多数蛋白质和SDS的平均结合量是1:1.4(以重量为单位),SDS带强负价,使蛋白质原先的带电价微不足道,变性的多肽与SDS结合并因此而带负电荷因此SDS多肽复合物在聚丙烯酰凝胶电泳中的迁移只与多肽的大小相关。分子栅栏效应1617水的作用压平隔氧:大气氧能淬灭自由基，阻止多聚体链长的增加。18常见问题两块玻璃板之间灌胶,胶为什么总是不平?1)玻璃没有洗干净，应该要洗得非常干净！2)过硫酸铵和TEMED的加量不合适，加量相对较多，凝胶凝固过快也会胶不平，最多按照分子克隆加倍。3)加完试剂以后没有很好的摇匀，导致有些部位的聚合剂浓度过高，聚合相对较快造成胶不平。4)稍微注意手法，均匀加入。5)灌胶后应该用水或者正丁醇压胶面20胶为什么总是漏？1）每次电泳完后，洗净玻璃、胶条和其它附件。2）避免玻璃边缘（与胶条接触处）破损，尤其和胶条接触的地方。3）关键是找一块很平的桌面，使两块玻璃底面非常齐就行了。4）胶条一定要干，跑完电泳后，胶条就放在实验台上晾着。5）下面的胶条注意不要老化21具体步骤样本:经过还原剂处理的小鼠血清(还)未经过原剂处理的小鼠血清(非)用1×SDS电泳缓冲液加满电泳槽的上下槽，小心拔出梳子，用移液器样品液加入到孔中，15ul/孔。2.上样加样前枪头外壁干净,加完样后枪头慢慢从孔中拿出,以免样本带出,污染电泳液23蛋白质样品的制备样品的制备快冷蛋白酶抑制剂24超声法冻融法26样品的制备★样品缓冲液的配制SDS:断裂分子内和分子间的氢键,破坏蛋白质分子的二级和三级结构.巯基乙醇或二硫苏糖醇(DTT):使半胱氨酸残基之间的二硫键断裂.甘油:比重大溴酚蓝:指示剂缓冲液样品溶于上样缓冲液后,100℃水浴煮沸3-5分钟.27★在加热组织裂解液时，肝脏和肾脏组织要特别注意其本身浓度，最好是在制作裂解液时就适当稀释，否则加热后会凝结成固态。有些组织处理后很粘稠，有带丝状物，这是未裂解的核酸，可以适当离心后再用。281.样品加热时间过长,导致蛋白样品出现聚集.100℃,5min2.样品中含有高离子浓度,导致电泳后蛋白条带变形.3.为避免蛋白丢失,上样量不要超过泳道体积.4.上样量过多或电泳前停留过长时间,会导致样品污染临近泳道.5.样品处理后,不要放于室温时间过长,以免降解.样品可能出现的问题:

30电泳具体步骤：积层胶：100V分离胶：140V接通电源■溴酚蓝达到胶的底部时，关掉电源，停止电泳。不应让溴酚蓝泳出底部■考马氏亮兰染色，脱色(选做)3.电泳溴酚兰至分离胶与积层胶分界线31

凝胶电泳—SDS胶厚度的使用低限为0.4mm.较厚的凝胶上加入较多的样品可提高灵敏度,但厚度必须<2mm.最大灵敏度获得:胶厚达1.5mm,加大蛋白的上样量.长胶可提高蛋白质的分辨率.必要时可让某些标志物跑出胶,以利于高分子量蛋白的分离.3233电泳过程中易出现的问题:电泳液过少：内槽超过短板，外槽约4CM深蛋白条带弥散:样品可能在电泳前就已经弥散了,应加样后尽快电泳笑纹效应(smileeffect):指示剂前沿呈现两边向上的曲线形凝胶的不均匀冷却,中间部分冷却不好.“皱眉”现象(frowneffect):指示剂前沿呈现两边向下的曲线形:拖尾现象:样品溶解不佳.蛋白条带融合在一起：液体过期或丙烯酰胺质量差34指示剂皱眉(frowneffect)原因:一般是两板之间的底部间隙气泡未排除干净。处理办法：可在两板间加入适量缓冲液，以排除气泡。SDS失败实例及分析35蛋白样本皱眉原因:一般是两板之间的底部间隙气泡未排除干净,制胶过程中中间部分受热不均，抽梳时用力过大或不均处理：在两板间加入适量缓冲液，以排除气泡或重新制胶；抽梳时均匀缓慢用力36指示剂微笑(smileeffect)原因：主要是由于凝胶的中间部分凝固不均匀所致，多出现于较厚凝胶。

处理办法：待其充分凝固再作后续实验。

37蛋白样品微笑原因：电泳过程中受热不均或有气泡处理：将电泳缓冲液先冷却后再用。38拖尾(tailling)原因：主要是样品融解效果不佳或分离胶浓度过大引起的。

处理：加样前离心；选择适当的样品缓冲液，加适量样品促溶剂；电泳缓冲液时间过长，重新配制；降低凝胶浓度。39纹理（streak）原因：样品中存在不溶颗粒处理方法：增加溶解度或离心除去不溶颗粒40上样过多41电流过大42多次加胶

43电泳过早停止44条带歪斜原因：电极或凝胶放置不正确处理方法：重新校正电极及凝胶放置45电泳液被杂蛋白污染了。配胶的DDW或者缓冲或者其他试剂被蛋白污染上样太大造成串带4647电泳甘氨酸的作用?1.缓冲液会与所分离的样品接触，加入甘氨酸为细胞组份和各种提取液提供更接近的天然环境。2.电解时缓冲液温度较高，而Tris受温度影响pH变化较大，甘氨酸可以起到缓冲作用。3.甘氨酸与样品的浓缩效应有关。

48第二部分：电转移戴上手套，在转移缓冲液中操作量好凝胶样品的大小，将NC膜裁至与胶同样大小，用转移缓冲液浸泡2分钟。1.转移芯制备具体步骤：49在转移盒上依次放入以下物品：NC膜50浸入式电转印

滤纸支持垫NC凝胶阳性电极转印缓冲液⊕〇尺寸：支持垫＞滤纸＞NC＞凝胶51将转移盒放入转移槽中，凝胶面朝向阴极，接通电源，冰浴条件下，100V(200mA)转移2小时。取出转印膜，准备杂交。2.电转移具体步骤：52蛋白质从凝胶转印至膜：湿转印法:

凝胶-膜夹层组合完全浸入转移缓冲液中点：转移温和，不会过热，但费时，需较多的电泳液．53半干转印法:

凝胶-膜夹层组合放在浸有转移缓冲液的吸水纸之间．优点：时间少，所需转移液少．54浸入式(湿式)电转印

滤纸支持垫NC凝胶阳性电极转印缓冲液⊕〇尺寸：支持垫＞滤纸＞NC膜＞凝胶55★膜载体:硝酸纤维素膜:在低离子转移缓冲液的环境下，大多数带负电荷的蛋白质会与硝酸纤维素膜发生疏水作用而高亲和力的结合在一起。通常用0.45μm和0.2μm两种规格，大于20kD的蛋白用0.45μm的膜，小于20kD的蛋白就要用0.2μm的膜

缺点：结合力弱，易脱落尼龙:只能结合少量蛋白,优点:机械强度好,不易变形带正电荷的尼龙(PVDF):通过它膜上的正电荷和蛋白接合（注：常用的PVDF即带正电荷的尼龙膜），同时也有疏水作用可结合各种蛋白缺点:因膜表面有大量结合位点,背景差→改变封闭条件适用：低分子量蛋白重氮化滤纸:能与蛋白共价结合,良好的机械强度.缺点:与许多凝胶电泳系统不相容;价格昂贵;活化后半衰期短5657PVDFPVDF膜用甲醇泡的目的是为了活化PVDF膜上面的正电基团，使它更容易跟带负电的蛋白质结合，做小分子的蛋白转移时多加甲醇也是这个目的58★转移液转移液的导电性要尽可能低甲醇可以提高转移速率甲醇影响糖蛋白和高分子量蛋白的转移59常见问题带上手套，尽量避免污染滤纸和膜尽量使所有物品保持湿润夹凝胶时注意，千万不要太用力，凝胶较脆，易碎60裁减好的滤纸和膜浸泡与电泳转移缓冲液中，可以注射器内筒驱除留于膜上的气泡。61

印迹膜上总蛋白的染色

用以确定蛋白已经转印到膜上,以及了解转印至膜上的总蛋白质的组成情况.

用于凝胶染色的常规方法不适用于免疫印迹染色(背景高)

常用的染料有：氨基黑、印度墨水、丽春红S62第三部分：抗体杂交及显色将转印膜放于封闭液中，4℃封闭过夜。用洗液洗膜3次，每次5min。加入用封闭液稀释的针对抗原的特异性抗体（一抗），摇床上室温振摇反应30～120min。用洗液洗膜3次，每次5min。取出膜，保持膜湿润，DAB显色用蒸馏水或自来水冲洗，终止反应。具体步骤：63

抗原检测原理印迹膜上非特异性蛋白结合位点的封闭电转膜Ag显色反应非特异结合信号64电转膜Ag封闭液显色反应特异性结合信号65常用的封闭液封闭缓冲液组成优点缺点5%脱脂奶粉5%w/v脱脂奶粉价廉易变质溶于PBS中背景清晰可掩饰某些抗原不适于亲和素体系5%脱脂奶粉/吐温5%w/v脱脂奶粉/0.2%价廉易变质Tween20/PBS

背景清晰可掩饰某些抗原Tween0.2%Tween溶于PBS可在抗原检测可能有一些残留后染色的本底BSA3%BSA/PBS信号强相对较贵

66加抗体注意事项抗体用封闭液稀释，稀释浓度参照说明书。抗体孵育过程中，抗体溶液一定要能将膜全部浸泡覆盖，摇晃孵育才能保证反应完全。孵育时间：37℃1小时或4℃过夜在保证实验效果的基础上，抗体尽量少加，提高稀释倍数。进口抗体在4℃保存情况下，短期内可回收使用1-2次。67检测方法：直接法、间接法直接法优点：简单，快速缺点：灵敏度差68间接法优点：灵敏度高二抗选择多缺点：非特异结合条件优化

69酶联抗体生色底物选择：辣根过氧化物酶（HRP）→DAB/NiCl2(二氨基联苯胺/氯化镍)：棕黑色沉淀，易产生背景颜色．ＡＥＣ，ＴＭＢ碱性磷酸酶（AP）→BCIP/NBT（溴氯吲哚磷酸盐/硝基氮蓝四唑）：黑紫色沉淀，背景干净70HRP常用生色底物比较71化学发光检测方法:灵敏度较显色法提高20倍,比放射活性检测法提高7倍.化学发光法的灵敏度已经达到pg级别72底片曝光73化学发光常用底物74化学发光法底片曝光注意事项暗室操作底片冲洗75荧光标记FITC，PE，AlexaFluor,APC等荧光染料76显色常见问题背景过高1）封闭不全，不适合的封闭试剂。2）一抗或者封闭液与膜蛋白的交叉反应。3）一抗或二抗中某些不纯的物质也可以造成背景。4）抗原或抗体的浓度太高，或孵育时间太长都可能遇到。5)胶片曝光过度，曝光时间的控制。6)洗涤不充分和洗涤液的量，增加洗涤的时间,次数7)HRP浓度过高77一抗二抗1：100001：100001：100001：50001：200001：10000078杂交常见问题信号弱或无信号7980内参照评价各个上样孔内胞内蛋白的总量是否基本一致通常使用一些看家蛋白，比如β-actin、GAPDH等等，这些蛋白在所有细胞中的表达量基本一致，而且很少受外界因素影响而发生变化，所以用他们来作为加样量的对照。目的蛋白经过处理后发生变化，而内参的条带基本均匀一致。表明的确