实时荧光定量PCR技术概述课件

实时荧光定量PCR技术暨南大学医学院中心实验室廖继东实时荧光定量PCR技术暨南大学医学院中心实验室廖继东主要内容实时荧光定量PCR的基本原理Chromo4介绍实时荧光定量PCR实验程序的建立实时荧光定量PCR的应用主要内容实时荧光定量PCR的基本原理主要内容实时荧光定量PCR的基本原理Chromo4介绍实时荧光定量PCR实验程序的建立实时荧光定量PCR的应用主要内容实时荧光定量PCR的基本原理PCR技术简介PCR:polymerasechainreaction多聚酶链式反应英文词首字母的缩写，是一种体外选择性扩增DNA或RNA片段的方法。其基本原理是依据DNA双螺旋结构及其半保留复制特性，用人工合成的小片段PCR技术简介PCR技术简介寡核甘酸引物与经高温（变性温度）变性形成的单链DNA模板，在特定温度（复性温度）下产生序列特异性互补结合，在适当温度（延伸温度）条件下，由DNA多聚酶催化使已经结合的寡核甘酸引物沿模板序列延伸产生与模板序列PCR技术简介常规PCR完全互补的新的DNA单链。PCR技术自1985年由美国PE公司的Mullis等发明并推出市场应用以来，实现了小片段DNA的体外快速扩增，为各种因DNA序列的变异、缺失以及由此导致的遗传缺陷和相关疾病的研究和临床诊断提供了强有常规PCR常规PCR力的手段，为各种病原体包括微生物、细菌、病毒等所致疾病的快速确诊提供了技术条件，极大地促进和加速了整个生命科学研究的进程。常规PCR常规PCR的定量在PCR反应中，理论上扩增产物的量与起始样本中模板的含量成正比。但受多种因素的影响，其精确定量模板的可信度明显不足。为克服上述不足，人们设计出包括内标、竞争、酶联、尿苷酶降解等多种定量方法。常规PCR的定量内标法在不同的PCR反应管中加入已知量的内标模板和引物，内标模板可由基因工程合成或采用已知量的标准品。在样品模板扩增的同时，内标模板也被扩增。二者的扩增产物可通过电泳或其它方法分离，以内标为对照进行样本模板定量。内标法竞争法将含有一个新内切酶位点的外源性模板加入PCR反应管中，待测样品模板与外源性模板用同一对引物进行扩增，经内切酶消化竞争性模板的产物成为两个片段，通过电泳等分离检测，根据已知模板的量推测未知模板的起始拷贝数。竞争法酶联免疫利用地高辛或生物素等标记引物，扩增产物被固定在固相板上特异的探针所结合，再加入抗地高辛或生物素抗体－辣根过氧化物酶结合物，检测酶底物显色情况，通过内标－标准曲线实现定量检测的目的。酶联免疫参照物在PCR定量中的作用作为扩增系统的阳性对照；作为未知样本定量的参比标准；通过竞争性作为矫正扩增系统内部的扩增效率，使其具有可比性。（参照物按其性质不同可分为内标和外标）参照物在PCR定量中的作用内标基因的选择原则：内标基因在不同组织或者处理前后表达量不变内标基因的选择一般选取GAPDH、β-actin等看家基因(GAPDH:Glyceraldehyde3-phosphatedehydrogenase,3－磷酸甘油醛脱氢酶)内标基因的选择原则：内标基因在不同组织或者处理前后表达量不变传统PCR定量方法的特点和不足1.定量的准确度：传统PCR定量方法的共同特点是针对PCR扩增的最终产物进行分析。因受酶活性、扩增效率、尤其是平台效应等诸多因素的影响，检测重现性极差，无法直接从终产物量推算出起始模板的精确含量。传统PCR定量方法的特点和不足传统PCR定量方法的特点和不足2.假阳性污染：传统PCR定量方法均依赖于各种不同类型的PCR后处理过程，这些过程极易使数量巨大的PCR扩增产物飞散到实验室的环境中，造成待检样本的污染，导致假阳性结果的上升。传统PCR定量方法的特点和不足实时荧光定量PCR在PCR反应体系中引入DNA结合荧光染料或荧光探针，对每一循环扩增反应产物DNA片段的累积情况进行实时监测记录，通过数学模型实现对起始模板的定量及定性的分析。其特点为全封闭（污染少）、高精确、高灵敏。实时荧光定量PCR实时荧光定量与常规PCR的区别常规PCR：

通过电泳、酶联等后处理技术，对PCR扩增反应的终末产物进行定量及定性分析。实时荧光定量PCR：通过引入DNA结合荧光染料或荧光探针，对PCR扩增反应过程中每一轮循环产物的累积进行实时检测，从而实现对起始模板的定量及定性分析。三个关键词：实时，荧光，定量实时荧光定量与常规PCR的区别常规PCR：PCRRealtimePCRS1S2M实时荧光定量与常规PCR的区别PCRRealtimePCRS1在实时荧光定量PCR技术中常用的概念荧光共振能量转移（fluorescenceresonanceenergytransfer,FRET）：在两个不同的荧光基团中，如果一个荧光基团（供体）的发射光谱与另一基团（受体）的激发光谱有一定的重叠，当两个基团之间的距离足够近（小于100Å）时，以供体基团的激发波长进行激发，可获得由受体基团发射的荧光。在实时荧光定量PCR技术中常用的概念荧光共振能量转移即：在供体基团的激发状态下由一对偶极子介导的能量直接转移给了受体。在此过程中没有光子的参与，是非辐射性的能量转移过程，转移效率与供－受体两个基团之间距离的6次幂倒数成正比例。在实时荧光定量PCR技术中常用的概念荧光共振能量转移在实时荧光定量PCR技术中常用的概念FRET产生条件1.存在荧光供体和受体，而且供体的发色光谱与受体的激发光谱有重叠常用的FRET组合：CFP-YFP/CFP-dsRED/BFP-GFP/GFP-dsRED/YFP-dsRED/Cy3-Cy5/Alexa488-Alexa555/Alexa488-Cy3/FITC-TRITC/YFP-TRITC/YFP-Cy3

FRET产生条件1.存在荧光供体和受体，

2供体和受体的距 离足够近：1-10nm（1－10nm为分子内/ 间互作的距离：如蛋白质构象转变、酶催 化反应等。）——超显微观察3合适偶极方向

4足够荧光寿命 无FRETFRETFRET产生条件2供体和受体的距 离足够近：1-10nm无F荧光域值线（fluorescencethresholdline）：背景荧光与荧光信号的分界值，可以通过标准曲线或经验来设定，常设定为初始3-7个循环荧光值标准差的10倍。在实时荧光定量PCR技术中常用的概念荧光域值线（fluorescencethresholdlThresholdlineC(t)valueCt值：是在PCR扩增过程中，各反应管的荧光信号与荧光域值线的交叉点所对应的循环次数（指数扩增的开始阶段）。在实时荧光定量PCR技术中常用的概念ThresholdlineC(t)valueCt值：每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数值存在线性关系。起始拷贝数越多，Ct值越小。用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，由此可对样本中目标基因的含量进行精确计算。初始模板浓度的确定每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数值存在线性关系。起DetermineC(t)valueforunknownInterpolatequantityofunknownusingthestandardcurveunknown104103Unknowncontains3108copiesDetermineC(t)valueforunkno用Ct值定量的意义实时荧光定量PCR方法利用循环阈值（Ct）的概念，在指数扩增的开始阶段进行检测，此时样品间的细小误差尚未放大，因此该Ct值具有极好的重复性。用Ct值定量的意义相同模板在同一台PCR仪上相同条件下重复96次扩增的扩增曲线图终点处检测产物量不恒定；Ct值则极具重现性

相同模板在同一台PCR仪上相同条件下重复96次扩增的扩增绝对定量成为可能灵敏度高可检测10–100个细胞中１个拷贝数量的基因低拷贝基因的检测细小倍数差异样品的检测实时荧光定量PCR的优势绝对定量成为可能实时荧光定量PCR的优势线性范围宽(6-9个数量级)，无需稀释高浓度样品可以在一次实验中同时检测定量高表达和低表达基因荧光探针使PCR产物检测特异性进一步提高全封闭无PCR后处理*几乎没有污染机会实时荧光定量PCR的优势线性范围宽(6-9个数量级)，无需稀释高浓度样品可以在一次相对定量和绝对定量：相对定量指的是确定样本中靶序列相对于另一参照样本中靶序列量的变化值，绝对定量指的是确定样本中靶序列的拷贝数。实时荧光定量PCR的定量方法相对定量和绝对定量：相对定量指的是确定样本中靶相对定量的方法：标准曲线法比较Ct值法绝对定量的方法：标准曲线法实时荧光定量PCR的定量方法相对定量的方法：实时荧光定量PCR的定量方法标准曲线法：制作标准曲线的标准序列的绝对量是未知的，将标准品进行相对稀释制成曲线，用以计算样本靶序列的含量，结果为样本靶序列与标准序列的比值。相对定量方法标准曲线法：制作标准曲线的标准序列的绝对量是未知的，将标准品比较Ct法:运用数学公式计算相对量，前提是假设每个循环增加一倍的产物量，在PCR反应的指数期得到Ct值来计算起始模板的量。前提：靶基因和内源控制物的扩增效率基本一致。相对定量方法比较Ct法:运用数学公式计算相对量，前提是假设每个循环增加标准曲线法：制作标准曲线的标准序列的绝对量是已知的，将标准品进行相对稀释制成曲线，用以计算样本靶序列的含量，结果为样本靶序列的绝对含量。质粒DNA和体外转入的RNA常用作绝对定量标准品。标准品的量可根据260nm的吸光度值并用DNA或RNA的分子量来换算成其拷贝数。绝对定量方法标准曲线法：制作标准曲线的标准序列的绝对量是已知的，将标准品DNA结合染色：SYBRGreen1水解探针：TaqManMolecularBeacons荧光标记引物杂交探针实时荧光定量PCR使用的荧光化学方法DNA结合染色：SYBRGreen1实时荧光定量PCR使SYBRGreen1TaqMan

MolecularBeacons荧光化学试剂SYBRGreen1TaqManMolecular荧SYBRGreenISYBRGreen1SYBRGreenISYBRGreen1SYBRGreenI工作原理SYBRGreen1

结合到双链DNA的小沟部位SYBRGreen1

染料只有和双链DNA结合后才发荧光。GTTTGGCCCCCCCAAAGGGACTTGATAGCATCGTAASYBRGreenI工作原理SYBRGreen1BoundSYBRGreenIUnboundSYBRGreenIPCRSYBRGreenIfluorescenceincreasesuponbindingdsDNAPost-amplificationmeltingcurveanalysisSYBRGreenI工作原理BoundSYBRGreenIUnboundSYBRSYBRGreenI工作原理SYBRGreenI工作原理荧光强度Vs温度荧光强度的变化是由于温度不断升高双链DNA解离，SGI重新游离到溶液中Tm是熔解曲线的特征值TemperatureincreasesFluorescencedecreasesTmSYBRGreenI熔解曲线分析荧光强度Vs温度TemperatureincreasesF以荧光值随温度变化作负导-dIdTTmSYBRGreenI熔解曲线分析以荧光值随温度变化作负导-dIdTTmSYBRGreen优化的读板温度-高于非特异产物的Tm值-低于目标产物的Tm值AmpliconNon-specificproducts熔解曲线分析的应用优化的读板温度AmpliconNon-specific熔解曲不同读板温度对实验结果的影响：80℃不同读板温度对实验结果的影响：80℃不同读板温度对实验结果的影响：86℃不同读板温度对实验结果的影响：86℃SYBRGreenI反应体系的设计反应体系的组成：传统PCR反应体系+SYBRGreenI1.SG浓度：终浓度1:5,000－1:100,000，一般为1:10,000—1:70,000SYBRGreenI反应体系的设计

2.Primer浓度：设计原则同普通PCR终浓度50nM－300nM固定摸板浓度的梯度实验不加摸板的对照实验（NTC）——有无非特异信号SYBRGreenI反应体系的设计

2.Primer浓度：SYBRGreenI反应体系

熔解曲线的分析——是否单峰

建议使用HPLC纯化的引物3.MgCl2浓度

降低MgCl2浓度以减少非特异性产物

最低可至1.5nM同时做梯度实验和NTC对照SYBRGreenI反应体系的设计

熔解曲线的分析——是否单峰SYBRGreenI反应

4.反应温度和时间参数：

反应温度参考所用酶的种类；

退火温度使用温度梯度功能优化；反应时间与常规PCR类似；扩增片断一般为200－300bp。SYBRGreenI反应体系的设计

4.反应温度和时间参数：SYBRGreenI反应

SYBRGreenI的特点和不足不涉及特异的探针，方法设计简单，特异性差；荧光强度依赖于体系中所有的dsDNA分子，不能区分引物二聚体、非特异性扩增片断等；通过绘制溶解曲线可较好地保证特异性。

SYBRGreenI的特点和不足TaqMan探针荧光素淬灭剂TaqMan水解型杂交探针TaqMan探针荧光素淬灭剂TaqMan水解型杂交探针TaqMan目标特异性探针5’为荧光素，3’为淬灭剂5’荧光素3’淬灭剂与目标序列互补TaqMan目标特异性探针5’荧光素3’淬灭剂与目标序列互RQReporterQuencherRQIntactprobe-reporterquenchedbyFRETFRRQDuringPCR,probehybridizestotargetsequenceRQProbeispartiallydisplacedduringextensionRQProbecleavedby5’-3’nucleaseactivityofpolymeraseRQFreereporterexhibitsunquenchedfluorescenceTaqMan工作原理RQReporterQuencherRQIntactproTaqman探针反应体系的设计引物、探针设计原则：优先选择探针的序列；Tm值应比引物的Tm值高8－10度（68－70）；GC含量：30－80％；长度不应超过30碱基，18-30bp,optimal20；5’端不应是G，G有可能会淬灭荧光素。

Taqman探针反应体系的设计引物、探针设计原则：Taqman探针反应体系的设计选择合适的模板链，使探针的Cs>Gs；扩增片断不超过400bp，通常为80－150bp。避免相同碱基连续出现，特别是四个或四个以上Gs连续出现；引物应尽量靠近探针；引物的Tm值为59－60度，长度约20碱基；避免引物、探针之间的二级结构。Taqman探针反应体系的设计选择合适的模板链，使探针的Cs引物、探针浓度的优化

目标：最高的信号/背景比，最小的Ct值

引物浓度：50nM－900nM

探针浓度：50nM－250nM

通过多次实验确定各自的浓度和比例Taqman探针反应体系的设计引物、探针浓度的优化Taqman探针反应体系的设计Taqman探针的不足采用荧光淬灭及双末端标记，淬灭难以彻底，本底较高；采用酶外切活性，受酶性能影响；探针标记成本较高。改进：用不发光的淬灭荧光分子取代TAMRATaqman探针的不足Molecular

BeaconsMolecularBeacons发夹型杂交探针Molecular

BeaconsMolecularMolecularBeacons茎由互补配对的序列组成环与目标序列完全配对茎荧光素淬灭剂环MolecularBeacons茎由互补配对的序列组成环与Target-loopinteractionmorestablethanstem-stemTACCGGGGGTTACGAACGGTAATTTTTGCCCCCAAAAQRTargetDuringtheannealingstep:ProbebindstargetReporterandquencherseparatedTarget-specificfluorescenceMolecularBeacons

Target-loopinteractionmoresMolecularBeacons特点和不足对目标序列有很高的特异性；是用于SNP检测的最灵敏的试剂之一；采用非荧光染料作为淬灭分子，荧光本底低；不能完全与模板结合，稳定性差；探针合成标记较复杂。MolecularBeacons特点和不足引物/探针设计和评估相关的免费网站

1．引物/探针的设计

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Primer3(WhiteheadInstitute,MIT)

/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi

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GeneFisher(BielefeldUniversity)

http://bibiserv.techfak.uni-bielefeld.de/cgi-bin/gf_submit?mode=STARTUP&qid=na&sample=dna

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引物/探针设计和评估相关的免费网站

1．引物/探针的设计

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FastPCR(Biocenter,UniversityofHelsinki)

http://www.biocenter.helsinki.fi/bi/bare-1_html/oligos.htm

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PerlPrimer(OwenMarshall)

/

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PrimerDesignAssistant(DivisionofBiostatisticsandBioinformatics,NationalHealthResearchInstitutes)

.tw/primer/

引物/探针设计和评估相关的免费网站

引物/探针设计和评估相关的免费网站．2.反转录(RT)PCR引物设计

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ExonPrimer(TechnischeUniversität,München)

http://ihg.gsf.de/ihg/ExonPrimer.html

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AutoPrimer(DeutschesKrebsforschungszentrum)

http://www.autoprime.de/

3.引物特异性的验证

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Blast(NCBI) /BLAST/引物/探针设计和评估相关的免费网站．2.反转录(RT)PCR引物设计引物/探针设计和评估4．引物/探针特性的评估

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OligoAnalyzer(IDT)

/Analyzer/

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OligoAnalysis&PlottingTool(Operon/Qiagen)

/oligos/toolkit.php

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NetPrimer(PremierBiosoft)

/netprimer/netprlaunch/netprlaunch.html引物/探针设计和评估相关的免费网站4．引物/探针特性的评估引物/探针设计和评估相关的免费网站

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GeneWalker(Cybergene)

http://www.cybergene.se/primerdesign/genewalker/genewalker11.html

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OligonucleotideAnalyzer(RNAture)

/oligonucleotide.html

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OligonucleotidePropertiesCalculator(NorthwesternUniversity)

/biotools/oligocalc.html

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mfold(MichaelZuker,RensselaerPolytechnicInstitute)

/applications/mfold/old/dna/

引物/探针设计和评估相关的免费网站

引物/探针设计和评估相关的免费网站5．扩增子二级结构的评估

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mfold(MichaelZuker,RensselaerPolytechnicInstitute)

/applications/mfold/old/dna/

引物/探针设计和评估相关的免费网站5．扩增子二级结构的评估引物/探针设计和评估相关的免费网站实时荧光定量PCR的原理实时荧光定量PCR的应用Chromo4介绍实时荧光定量PCR的原理实时荧光定量PCR技术的应用

病原体检测；肿瘤研究；基因表达研究；免疫组份分析；基因突变及多态性的研究实时荧光定量PCR技术的应用病原体检测；实时荧光定量PCR技术的应用

病原体检测：检测患者血清中肝炎病毒浓度为临床药物治疗和疗效观察提供依据；检测HIV的量预测发病时间；选择治疗药物：干扰素对肝炎病毒高拷贝者不敏感，对低拷贝者敏感。实时荧光定量PCR技术的应用病原体检测：实时荧光定量PCR技术的应用

肿瘤研究：癌基因及其相关基因的定量检测可进行肿瘤的早期诊断、分型、分期和预后判断；检测治疗中和治疗后微量残余恶性细胞存在的数量，作为治疗效果和估计复发危险性的依据。实时荧光定量PCR技术的应用肿瘤研究：基因差异表达研究标准曲线法

使用标准曲线来确定基因表达上的差异相对定量法(2－△△Ct法)

不使用标准曲线，直接分析得到基因差异表达的倍数关系基因差异表达研究标准曲线法标准曲线法步骤：1.通过标准曲线分别测出目标基因和内标基因的量2.均一化校正（Normalization)3.比较不同样品间目标基因表达差异标准曲线法步骤：相对定量法前提目标基因和看家基因的扩增效率一致，且接近100％。步骤通过实时荧光曲线得到目标基因和看家基因的Ct值均一化校准△Ct=Ct目标基因－Ct看家基因△△Ctn=△Ctn－△Ct0（不同时间、不同组织)基因差异表达的倍数＝2－△△Ct相对定量法前提基因突变及多态性-SNP检测基因突变及多态性-SNP检测基因分型方法

使用TaqMan探针

(双色法)溶解曲线

(单色法)序列特异PCR(单色法)基因分型方法FRFQGVQTCSNPG/AFQGVQTForwardprimerReverseprimerAllele-specificprobeAllele-specificprobe用TaqMan探针进行基因型分析SNP检测-基因型分析FRFQGVQTCSNPG/AFQGVQTForwardQF5’GCQ5’3’CGFQV5’3’CTQ5’3’HybridizationofTaqManProbeDigestionofprobe-fluorescenceNOdigestionofprobe-NOfluorescenceTVQGFQMatchforAllele1ReducedEfficiencyofProbeHybridizationMismatchforAllele1Polymerase多色双通道技术应用-基因型分析QF5’GCQ5’3’CGFQV5’3’CTQ5’3’Hyb从病人血液样品中提取DNA基因型分类：A/A(Allele1)G/G(Allele2)G/A(Heterozygote)CFQTVQ多色双通道技术应用-基因型分析从病人血液样品中提取DNACFQTVQ多色双通道技术应用Allele1controlVICFAM多色双通道技术应用-基因型分析Allele1controlVICFAM多色双通道技术应Allele2controlVICFAM多色双通道技术应用-基因型分析Allele2controlVICFAM多色双通道技术应HeterozygotecontrolFAMVIC多色双通道技术应用-基因型分析HeterozygotecontrolFAMVIC多色双通多色双通道技术应用-基因型分析多色双通道技术应用-基因型分析SYBRGreenI进行SNP分析T5’PCRprimerswithSNPsiteat3’endC5’

末端不匹配会导致PCR效率上有大约1000倍的差异，由此导致产物积累会有10个cycles延迟

末端匹配与否，与反应终产物量的多少没有必然联系

PCR#1PCR#2SYBRGreenI进行SNP分析T5’PCRprimSYBRGreenI进行SNP分析MatchMismatchSYBRGreenI进行SNP分析MatchMismatSYBRGreenI进行基因分型Amplicon1Amplicon2GCHigherTm…distinctthermalprofileLowerTm…distinctthermalprofileSYBRGreenI进行基因分型Amplicon1AmSYBRGreenI进行基因分型Intensity-dI/dTSYBRGreenI进行基因分型Intensity-dITaqMan®MicroRNA分析方法

加长靶基因的反转录荧光定量PCRTaqMan®MicroRNA分析方法

加长靶基因的反转miRNAs的研究

MicroRNAs是一种内源性长度在２２个碱基左右的RNA分子，它在动植物中具有重要的基因调控作用，它们通过与mRNAs结合抑制翻译或造成mRNAs被酶解切割而起作用目前在各种生命体中发现的miRNAs类型共有约700种以上,通过实验验证或经数据库和软件推测其中人源的约有２００种高丰度存在：平均每个细胞中约有50,000个拷贝miRNAs的研究MicroRNAs是一种内源性长度在２为什么miRNAs非常重要?MicroRNAs是一类新的基因调控因子某些miRNAs控制了动植物的发育理解miRNA的功能将帮助现在流行的siRNA实验结果：RNA干扰／基因沉默MicroRNAs有可能成为新型的疾病标志物MicroRNAs可能具有重要临床应用价值为什么miRNAs非常重要?MicroRNAs是一类新的现有的miRNA检测方法克隆法Cloning杂交法NorthernBlotRibonucleaseProtection-basedPAGE电泳法基因芯片法Microarray-basedmiRNAprofiling

上列各种方法均未被证实是有效，准确并且是高度重现的：不少小RNA间只有一个碱基的不同现有的miRNA检测方法克隆法CloningmiRNAStep1:Stem-loopRTStep2:Real-timePCRFQOligosrequiredpermiRNASpecificRTprimerSpecificforwardprimerSpecificreverseprimerSpecificTaqMan®probeEnzymesrequiredReversetranscriptaseAmpliTaqGold®DNAPolymerasemiRNAStep1:Step2:FQOligosreMicroRNA定量方法EstimatedsyntheticmiRNAinput(lin-4)inRTbasedonOD:707-71copies已经实验证明可达7个数量级的线性范围Slope=-3.4R2=0.9991No.PCRcyclesFluorescencesignal(Rn)No.copiesThresholdCycle(CT)70Mcopies7copiesABMicroRNA定量方法EstimatedsynthetMicroRNA的应用实时定量分析miRNAsmiRNA表达谱分析：疾病／正常的比较分析发现疾病的miRNA标志物or疾病相关的基因表达标签通过同时并行比较基因和miRNA表达类型，发现新的miRNA靶基因细胞分化研究转录后基因调控研究生物标志物的发现MicroRNA的应用实时定量分析miRNAs实时荧光定量PCR的原理实时荧光定量PCR的应用Chromo4介绍

实时荧光定量PCR的原理Chromo4定量PCR仪－外形Chromo4定量PCR仪－外形Chromo4构造DNA热循环仪底座(PTC-0200)Chromo4实时检测单元(CFD-3240)96-孔样品模块(ALS-3296)Chromo4光电探头(CDM-3240-01)Chromo4构造DNA热循环仪底座Chromo4实时MJChromo4LEDs(1perchannel)Photodiodes(1perchannel)FiltersMJChromo4LEDsPhotodiodesFil光学系统－四个通道相互独立光学系统－四个通道相互独立温度梯度温度梯度实验结果——四通道实验结果——四通道实验结果——重复性96个重复扩增的Log-荧光强度对C（t）值的作图通过DyNAMo热启动SYBRGreenqPCR试剂盒扩增并检测初始模板浓度=106实验结果——重复性96个重复扩增的Log-荧光强度对C（t）线性范围扩增从1010到1个拷贝的初始模板所得Log-荧光强度vs.Ct图,每个样本作2个重复。VIC-标记的水解探针用于产物检测标准曲线回归系数R2值为0.998用FAM和Cy5标记的Taqman探针检测也得到了同样的结果线性范围扩增从1010到1个拷贝的初始模板所得Log-感谢各位光临！clmcjn感谢各位光临！clmcjn实时荧光定量PCR技术暨南大学医学院中心实验室廖继东实时荧光定量PCR技术暨南大学医学院中心实验室廖继东主要内容实时荧光定量PCR的基本原理Chromo4介绍实时荧光定量PCR实验程序的建立实时荧光定量PCR的应用主要内容实时荧光定量PCR的基本原理主要内容实时荧光定量PCR的基本原理Chromo4介绍实时荧光定量PCR实验程序的建立实时荧光定量PCR的应用主要内容实时荧光定量PCR的基本原理PCR技术简介PCR:polymerasechainreaction多聚酶链式反应英文词首字母的缩写，是一种体外选择性扩增DNA或RNA片段的方法。其基本原理是依据DNA双螺旋结构及其半保留复制特性，用人工合成的小片段PCR技术简介PCR技术简介寡核甘酸引物与经高温（变性温度）变性形成的单链DNA模板，在特定温度（复性温度）下产生序列特异性互补结合，在适当温度（延伸温度）条件下，由DNA多聚酶催化使已经结合的寡核甘酸引物沿模板序列延伸产生与模板序列PCR技术简介常规PCR完全互补的新的DNA单链。PCR技术自1985年由美国PE公司的Mullis等发明并推出市场应用以来，实现了小片段DNA的体外快速扩增，为各种因DNA序列的变异、缺失以及由此导致的遗传缺陷和相关疾病的研究和临床诊断提供了强有常规PCR常规PCR力的手段，为各种病原体包括微生物、细菌、病毒等所致疾病的快速确诊提供了技术条件，极大地促进和加速了整个生命科学研究的进程。常规PCR常规PCR的定量在PCR反应中，理论上扩增产物的量与起始样本中模板的含量成正比。但受多种因素的影响，其精确定量模板的可信度明显不足。为克服上述不足，人们设计出包括内标、竞争、酶联、尿苷酶降解等多种定量方法。常规PCR的定量内标法在不同的PCR反应管中加入已知量的内标模板和引物，内标模板可由基因工程合成或采用已知量的标准品。在样品模板扩增的同时，内标模板也被扩增。二者的扩增产物可通过电泳或其它方法分离，以内标为对照进行样本模板定量。内标法竞争法将含有一个新内切酶位点的外源性模板加入PCR反应管中，待测样品模板与外源性模板用同一对引物进行扩增，经内切酶消化竞争性模板的产物成为两个片段，通过电泳等分离检测，根据已知模板的量推测未知模板的起始拷贝数。竞争法酶联免疫利用地高辛或生物素等标记引物，扩增产物被固定在固相板上特异的探针所结合，再加入抗地高辛或生物素抗体－辣根过氧化物酶结合物，检测酶底物显色情况，通过内标－标准曲线实现定量检测的目的。酶联免疫参照物在PCR定量中的作用作为扩增系统的阳性对照；作为未知样本定量的参比标准；通过竞争性作为矫正扩增系统内部的扩增效率，使其具有可比性。（参照物按其性质不同可分为内标和外标）参照物在PCR定量中的作用内标基因的选择原则：内标基因在不同组织或者处理前后表达量不变内标基因的选择一般选取GAPDH、β-actin等看家基因(GAPDH:Glyceraldehyde3-phosphatedehydrogenase,3－磷酸甘油醛脱氢酶)内标基因的选择原则：内标基因在不同组织或者处理前后表达量不变传统PCR定量方法的特点和不足1.定量的准确度：传统PCR定量方法的共同特点是针对PCR扩增的最终产物进行分析。因受酶活性、扩增效率、尤其是平台效应等诸多因素的影响，检测重现性极差，无法直接从终产物量推算出起始模板的精确含量。传统PCR定量方法的特点和不足传统PCR定量方法的特点和不足2.假阳性污染：传统PCR定量方法均依赖于各种不同类型的PCR后处理过程，这些过程极易使数量巨大的PCR扩增产物飞散到实验室的环境中，造成待检样本的污染，导致假阳性结果的上升。传统PCR定量方法的特点和不足实时荧光定量PCR在PCR反应体系中引入DNA结合荧光染料或荧光探针，对每一循环扩增反应产物DNA片段的累积情况进行实时监测记录，通过数学模型实现对起始模板的定量及定性的分析。其特点为全封闭（污染少）、高精确、高灵敏。实时荧光定量PCR实时荧光定量与常规PCR的区别常规PCR：

通过电泳、酶联等后处理技术，对PCR扩增反应的终末产物进行定量及定性分析。实时荧光定量PCR：通过引入DNA结合荧光染料或荧光探针，对PCR扩增反应过程中每一轮循环产物的累积进行实时检测，从而实现对起始模板的定量及定性分析。三个关键词：实时，荧光，定量实时荧光定量与常规PCR的区别常规PCR：PCRRealtimePCRS1S2M实时荧光定量与常规PCR的区别PCRRealtimePCRS1在实时荧光定量PCR技术中常用的概念荧光共振能量转移（fluorescenceresonanceenergytransfer,FRET）：在两个不同的荧光基团中，如果一个荧光基团（供体）的发射光谱与另一基团（受体）的激发光谱有一定的重叠，当两个基团之间的距离足够近（小于100Å）时，以供体基团的激发波长进行激发，可获得由受体基团发射的荧光。在实时荧光定量PCR技术中常用的概念荧光共振能量转移即：在供体基团的激发状态下由一对偶极子介导的能量直接转移给了受体。在此过程中没有光子的参与，是非辐射性的能量转移过程，转移效率与供－受体两个基团之间距离的6次幂倒数成正比例。在实时荧光定量PCR技术中常用的概念荧光共振能量转移在实时荧光定量PCR技术中常用的概念FRET产生条件1.存在荧光供体和受体，而且供体的发色光谱与受体的激发光谱有重叠常用的FRET组合：CFP-YFP/CFP-dsRED/BFP-GFP/GFP-dsRED/YFP-dsRED/Cy3-Cy5/Alexa488-Alexa555/Alexa488-Cy3/FITC-TRITC/YFP-TRITC/YFP-Cy3

FRET产生条件1.存在荧光供体和受体，

2供体和受体的距 离足够近：1-10nm（1－10nm为分子内/ 间互作的距离：如蛋白质构象转变、酶催 化反应等。）——超显微观察3合适偶极方向

4足够荧光寿命 无FRETFRETFRET产生条件2供体和受体的距 离足够近：1-10nm无F荧光域值线（fluorescencethresholdline）：背景荧光与荧光信号的分界值，可以通过标准曲线或经验来设定，常设定为初始3-7个循环荧光值标准差的10倍。在实时荧光定量PCR技术中常用的概念荧光域值线（fluorescencethresholdlThresholdlineC(t)valueCt值：是在PCR扩增过程中，各反应管的荧光信号与荧光域值线的交叉点所对应的循环次数（指数扩增的开始阶段）。在实时荧光定量PCR技术中常用的概念ThresholdlineC(t)valueCt值：每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数值存在线性关系。起始拷贝数越多，Ct值越小。用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，由此可对样本中目标基因的含量进行精确计算。初始模板浓度的确定每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数值存在线性关系。起DetermineC(t)valueforunknownInterpolatequantityofunknownusingthestandardcurveunknown104103Unknowncontains3108copiesDetermineC(t)valueforunkno用Ct值定量的意义实时荧光定量PCR方法利用循环阈值（Ct）的概念，在指数扩增的开始阶段进行检测，此时样品间的细小误差尚未放大，因此该Ct值具有极好的重复性。用Ct值定量的意义相同模板在同一台PCR仪上相同条件下重复96次扩增的扩增曲线图终点处检测产物量不恒定；Ct值则极具重现性

相同模板在同一台PCR仪上相同条件下重复96次扩增的扩增绝对定量成为可能灵敏度高可检测10–100个细胞中１个拷贝数量的基因低拷贝基因的检测细小倍数差异样品的检测实时荧光定量PCR的优势绝对定量成为可能实时荧光定量PCR的优势线性范围宽(6-9个数量级)，无需稀释高浓度样品可以在一次实验中同时检测定量高表达和低表达基因荧光探针使PCR产物检测特异性进一步提高全封闭无PCR后处理*几乎没有污染机会实时荧光定量PCR的优势线性范围宽(6-9个数量级)，无需稀释高浓度样品可以在一次相对定量和绝对定量：相对定量指的是确定样本中靶序列相对于另一参照样本中靶序列量的变化值，绝对定量指的是确定样本中靶序列的拷贝数。实时荧光定量PCR的定量方法相对定量和绝对定量：相对定量指的是确定样本中靶相对定量的方法：标准曲线法比较Ct值法绝对定量的方法：标准曲线法实时荧光定量PCR的定量方法相对定量的方法：实时荧光定量PCR的定量方法标准曲线法：制作标准曲线的标准序列的绝对量是未知的，将标准品进行相对稀释制成曲线，用以计算样本靶序列的含量，结果为样本靶序列与标准序列的比值。相对定量方法标准曲线法：制作标准曲线的标准序列的绝对量是未知的，将标准品比较Ct法:运用数学公式计算相对量，前提是假设每个循环增加一倍的产物量，在PCR反应的指数期得到Ct值来计算起始模板的量。前提：靶基因和内源控制物的扩增效率基本一致。相对定量方法比较Ct法:运用数学公式计算相对量，前提是假设每个循环增加标准曲线法：制作标准曲线的标准序列的绝对量是已知的，将标准品进行相对稀释制成曲线，用以计算样本靶序列的含量，结果为样本靶序列的绝对含量。质粒DNA和体外转入的RNA常用作绝对定量标准品。标准品的量可根据260nm的吸光度值并用DNA或RNA的分子量来换算成其拷贝数。绝对定量方法标准曲线法：制作标准曲线的标准序列的绝对量是已知的，将标准品DNA结合染色：SYBRGreen1水解探针：TaqManMolecularBeacons荧光标记引物杂交探针实时荧光定量PCR使用的荧光化学方法DNA结合染色：SYBRGreen1实时荧光定量PCR使SYBRGreen1TaqMan

MolecularBeacons荧光化学试剂SYBRGreen1TaqManMolecular荧SYBRGreenISYBRGreen1SYBRGreenISYBRGreen1SYBRGreenI工作原理SYBRGreen1

结合到双链DNA的小沟部位SYBRGreen1

染料只有和双链DNA结合后才发荧光。GTTTGGCCCCCCCAAAGGGACTTGATAGCATCGTAASYBRGreenI工作原理SYBRGreen1BoundSYBRGreenIUnboundSYBRGreenIPCRSYBRGreenIfluorescenceincreasesuponbindingdsDNAPost-amplificationmeltingcurveanalysisSYBRGreenI工作原理BoundSYBRGreenIUnboundSYBRSYBRGreenI工作原理SYBRGreenI工作原理荧光强度Vs温度荧光强度的变化是由于温度不断升高双链DNA解离，SGI重新游离到溶液中Tm是熔解曲线的特征值TemperatureincreasesFluorescencedecreasesTmSYBRGreenI熔解曲线分析荧光强度Vs温度TemperatureincreasesF以荧光值随温度变化作负导-dIdTTmSYBRGreenI熔解曲线分析以荧光值随温度变化作负导-dIdTTmSYBRGreen优化的读板温度-高于非特异产物的Tm值-低于目标产物的Tm值AmpliconNon-specificproducts熔解曲线分析的应用优化的读板温度AmpliconNon-specific熔解曲不同读板温度对实验结果的影响：80℃不同读板温度对实验结果的影响：80℃不同读板温度对实验结果的影响：86℃不同读板温度对实验结果的影响：86℃SYBRGreenI反应体系的设计反应体系的组成：传统PCR反应体系+SYBRGreenI1.SG浓度：终浓度1:5,000－1:100,000，一般为1:10,000—1:70,000SYBRGreenI反应体系的设计

2.Primer浓度：设计原则同普通PCR终浓度50nM－300nM固定摸板浓度的梯度实验不加摸板的对照实验（NTC）——有无非特异信号SYBRGreenI反应体系的设计

2.Primer浓度：SYBRGreenI反应体系

熔解曲线的分析——是否单峰

建议使用HPLC纯化的引物3.MgCl2浓度

降低MgCl2浓度以减少非特异性产物

最低可至1.5nM同时做梯度实验和NTC对照SYBRGreenI反应体系的设计

熔解曲线的分析——是否单峰SYBRGreenI反应

4.反应温度和时间参数：

反应温度参考所用酶的种类；

退火温度使用温度梯度功能优化；反应时间与常规PCR类似；扩增片断一般为200－300bp。SYBRGreenI反应体系的设计

4.反应温度和时间参数：SYBRGreenI反应

SYBRGreenI的特点和不足不涉及特异的探针，方法设计简单，特异性差；荧光强度依赖于体系中所有的dsDNA分子，不能区分引物二聚体、非特异性扩增片断等；通过绘制溶解曲线可较好地保证特异性。

SYBRGreenI的特点和不足TaqMan探针荧光素淬灭剂TaqMan水解型杂交探针TaqMan探针荧光素淬灭剂TaqMan水解型杂交探针TaqMan目标特异性探针5’为荧光素，3’为淬灭剂5’荧光素3’淬灭剂与目标序列互补TaqMan目标特异性探针5’荧光素3’淬灭剂与目标序列互RQReporterQuencherRQIntactprobe-reporterquenchedbyFRETFRRQDuringPCR,probehybridizestotargetsequenceRQProbeispartiallydisplacedduringextensionRQProbecleavedby5’-3’nucleaseactivityofpolymeraseRQFreereporterexhibitsunquenchedfluorescenceTaqMan工作原理RQReporterQuencherRQIntactproTaqman探针反应体系的设计引物、探针设计原则：优先选择探针的序列；Tm值应比引物的Tm值高8－10度（68－70）；GC含量：30－80％；长度不应超过30碱基，18-30bp,optimal20；5’端不应是G，G有可能会淬灭荧光素。

Taqman探针反应体系的设计引物、探针设计原则：Taqman探针反应体系的设计选择合适的模板链，使探针的Cs>Gs；扩增片断不超过400bp，通常为80－150bp。避免相同碱基连续出现，特别是四个或四个以上Gs连续出现；引物应尽量靠近探针；引物的Tm值为59－60度，长度约20碱基；避免引物、探针之间的二级结构。Taqman探针反应体系的设计选择合适的模板链，使探针的Cs引物、探针浓度的优化

目标：最高的信号/背景比，最小的Ct值

引物浓度：50nM－900nM

探针浓度：50nM－250nM

通过多次实验确定各自的浓度和比例Taqman探针反应体系的设计引物、探针浓度的优化Taqman探针反应体系的设计Taqman探针的不足采用荧光淬灭及双末端标记，淬灭难以彻底，本底较高；采用酶外切活性，受酶性能影响；探针标记成本较高。改进：用不发光的淬灭荧光分子取代TAMRATaqman探针的不足Molecular

BeaconsMolecularBeacons发夹型杂交探针Molecular

BeaconsMolecularMolecularBeacons茎由互补配对的序列组成环与目标序列完全配对茎荧光素淬灭剂环MolecularBeacons茎由互补配对的序列组成环与Target-loopinteractionmorestablethanstem-stemTACCGGGGGTTACGAACGGTAATTTTTGCCCCCAAAAQRTargetDuringtheannealingstep:ProbebindstargetReporterandquencherseparatedTarget-specificfluorescenceMolecularBeacons

Target-loopinteractionmoresMolecularBeacons特点和不足对目标序列有很高的特异性；是用于SNP检测的最灵敏的试剂之一；采用非荧光染料作为淬灭分子，荧光本底低；不能完全与模板结合，稳定性差；探针合成标记较复杂。MolecularBeacons特点和不足引物/探针设计和评估相关的免费网站

1．引物/探针的设计

•

Primer3(WhiteheadInstitute,MIT)

/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi

•

GeneFisher(BielefeldUniversity)

http://bibiserv.techfak.uni-bielefeld.de/cgi-bin/gf_submit?mode=STARTUP&qid=na&sample=dna

•

引物/探针设计和评估相关的免费网站

1．引物/探针的设计

•

FastPCR(Biocenter,UniversityofHelsinki)

http://www.biocenter.helsinki.fi/bi/bare-1_html/oligos.htm

•

PerlPrimer(OwenMarshall)

/

•

PrimerDesignAssistant(DivisionofBiostatisticsandBioinformatics,NationalHealthResearchInstitutes)

.tw/primer/

引物/探针设计和评估相关的免费网站

引物/探针设计和评估相关的免费网站．2.反转录(RT)PCR引物设计

•

ExonPrimer(TechnischeUniversität,München)

http://ihg.gsf.de/ihg/ExonPrimer.html

•

AutoPrimer(DeutschesKrebsforschungszentrum)

http://www.autoprime.de/

3.引物特异性的验证

•

Blast(NCBI) /BLAST/引物/探针设计和评估相关的免费网站．2.反转录(RT)PCR引物设计引物/探针设计和评估4．引物/探针特性的评估

•

OligoAnalyzer(IDT)

/Analyzer/

•

OligoAnalysis&PlottingTool(Operon/Qiagen)

/oligos/toolkit.php

•

NetPrimer(PremierBiosoft)

/netprimer/netprlaunch/netprlaunch.html引物/探针设计和评估相关的免费网站4．引物/探针特性的评估引物/探针设计和评估相关的免费网站

•

GeneWalker(Cybergene)

http://www.cybergene.se/primerdesign/genewalker/genewalker11.html

•

OligonucleotideAnalyzer(RNAture)

/oligonucleotide.html

•

OligonucleotidePropertiesCalculator(NorthwesternUniversity)

/biotools/oligocalc.html

•

mfold(MichaelZuker,RensselaerPolytechnicInstitute)

/applications/mfold/old/dna/

引物/探针设计和评估相关的免费网站

引物/探针设计和评估相关的免费网站5．扩增子二级结构的评估

•

mfold(MichaelZuker,RensselaerPolytechnicInstitute)

/applications/mfold/old/dna/

引物/探针设计和评估相关的免费网站5．扩增子二级结构的评估引物/探针设计和评估相关的免费网站实时荧光定量PCR的原理实时荧光定量PCR的应用Chromo4介绍实时荧光定量PCR的原理实时荧光定量PCR技术的应用

病原体检测；肿瘤研究；基因表达研究；免疫组份分析；基因突变及多态性的研究实时荧光定量PCR技术的应用病原体检测；实时荧光定量PCR技术的应用

病原体检测：检测患者血清中肝炎病毒浓度为临床药物治疗和疗效观察提供依据；检测HIV的量预测发病时间；选择治疗药物：干扰素对肝炎病毒高拷贝者不敏感，对低拷贝者敏感。实时荧光定量PCR技术的应用病原体检测：实时荧光定量PCR技术的应用

肿瘤研究：癌基因及其相关基因的定量检测可进行肿瘤的早期诊断、分型、分期和预后判断；检测治疗中和治疗后微量残余恶性细胞存在的数量，作为治疗效果和估计复发危险性的依据。实时荧光定量PCR技术的应用肿瘤研究：基因差异表达研究标准曲线法

使用标准曲线来确定基因表达上的差异相对定量法(2－△△Ct法)

不使用标准曲线，直接分析得到基因差异表达的倍数关系基因差异表达研究标准曲线法标准曲线法步骤：1.通过标准曲线分别测出目标基因和内标基因的量2.均一化校正（Normalization)3.比较不同样品间目标基因表达差异标准曲线法步骤：相对定量法前提目标基因和看家基因的扩增效率一致，且接近100％。步骤通过实时荧光曲线得到目标基因和看家基因的Ct值均一化校准△Ct=Ct目标基因－Ct看家基因△△Ctn=△Ctn－△Ct0（不同时间、不同组织)基因差异表达的倍数＝2－△△Ct相对定量法前提基因突变及多态性-SNP检测基因突变及多态性-SNP检测基因分型方法

使用TaqMan探针

(双色法)溶解曲线

(单色法)序列特异PCR(单色法)基因分型方法FRFQGVQTCSNPG/AFQGVQTForwardprimerReverseprimerAllele-specificprobeAllele-specificprobe用TaqMan探针进行基因型分析SNP检测-基因型分析FRFQGVQTCSNPG/AFQGVQTForwardQF5’GCQ5’3’CGFQV5’3’CTQ5’3’HybridizationofTaqManProbeDigestionofprobe-fluorescenceNOdigestionofprobe-NOfluorescenceTVQGFQMatchforAllele1ReducedEfficiencyofProbeHybridizationMismatchforAllele1Polymerase多色双通道技术应用-基因型分析QF5’GCQ5’3’CGFQV5’3’CTQ5’3’Hyb从病人血液样品中提取DNA基因型分类：A/A(Allele1)G/G(Allele2)G/A(Heterozygote)CFQTVQ多色双通道技术应用-基因型分析从病