植物细胞工程制药

第五章植物细胞工程制药1.在无菌和人工控制的条件下，采用植物细胞和组织培养技术培养植物的细胞，组织，器官以获得有药用价值的次生代谢产物。2.采用植物的遗传操作技术改变植物或植物细胞的原有性状和功能，获得具有优良性状的植株或植物细胞，生产有药用价值的次生代谢产物。第一节概述利用组织和细胞培养技术生产药用成分植物组织及细胞培养过程中，所产生的次生代谢物常存在于细胞内，可以收获细胞进行提取，因所含色素等杂质较少，所以提取过程相对于从原植物中提取要简单一些。植物培养细胞中有效成分含量高于原植物中的含量培养周期短，有利于节约成本大规模生产与哺乳动物细胞培养系统相比，植物表达系统具有耗费极低而生产蛋白复合物量大的潜力，而且植物表达系统不存在来自动物、细菌或者病毒病原体的污染问题。植物组织（细胞）培养的次生代谢产物见表5-1一、植物细胞工程发展简史1902年，德国Haberlandt提出了细胞全能性学说，并进行了植物叶肉细胞、髓细胞、腺细胞、气孔保卫细胞、表皮细胞的培养试验,奠定了细胞工程的基础。之后至30年代，建立了基本的植物组织培养技术50年代期间，组织培养进入新的阶段培养基的设计生物反应器培养动力学等用于次级代谢产物的调控研究80年代后，高速发展时期分子生物学技术改变植物遗传特性植物细胞培养技术进行有药用价值的天然产物的工业化生产和直接生产次生代谢产物成为主流目前，我国处于此方面的领先二、植物细胞的药用成分市售中成药的25%来源于植物提取药物或半合成药物一类为植物后含物，为细胞储液或废弃物，包括生物碱、挥发油和有机酸。一类为生理活性物质，如酶、维生素、植物激素、植物杀菌素等三、植物细胞的生物学特性细胞的全能性:

一个细胞所具有的产生完整生物个体的固有能力。植物干细胞：植物胚性细胞（embryogeniccells）即合子。分化的根茎叶中仍保留少数未分化或分化程度不高的细胞（遗留的胚性细胞）细胞的脱分化（dedifferentiation):特定条件下，分化细胞被诱导，基因活动模式发生变化，改变原有的发育途径，失去原有的分化状态，转变为具分生能力的胚性细胞。已分化的细胞要表现全能性，首先要脱分化形成分生细胞，然后再分化形成胚胎发育成植株脱分化条件：创伤和外源激素。外植体(explant)：植物体上上取出的用用于培养和和分离细胞胞的组织或或器官愈伤组织：植物的伤伤口或外植植体的伤口口长出的细细胞团，既既是组织，，又是脱分分化细胞Callus毛状根(hairyroot)：受到发根根农杆菌感感染后形成成的根组织织，易于培培养，改变变了植物的的次生代谢谢。次生代谢产产物：保持植物物的抗逆性性，抗病性性和抗虫性性，及担当当信号分子子。合成途途径见表5-2毛状根第二节植植物细胞胞的培养植物细胞培培养从植物物组织培养养而来，植植物组织培培养主要用用于形成组组织和再生生成植株细胞培养主主要生成次次生代谢产产物基本技术：：植物材料的的准备培养基制备备培养方法的的选择一、植物细细胞的培养养特点植物培养细细胞四个生生长时期特特性延迟期：细胞数恒定定，高RNA含量，高蛋蛋白质合成成能力；加速期：细胞快速生生长期。干干重恒定，，细胞数、、DNA和蛋白质浓浓度增加，，有丝分裂裂活性、RNA含量和蛋白白质合成能能力减少；；对数期：介于最大生生长率和蛋蛋白质合成成完全停止止期之间。。增加细胞胞鲜重、干干重及RNA酶活性，蛋蛋白质合成成能力完全全减退；稳定期：细胞数稳定定。细胞高高液泡化，，极度脆弱弱，高度分分化及有机机化合物的的高浓度。。（1）植物细胞胞有独特的的培养时间间及特征：：重量的增增加在对数数期，次生代谢产产物在稳定定期积累（2）植物细胞胞很少单一一细胞生长长，对数生生长后期分分泌量蛋白白和粘多糖糖，以非均相集集合的细胞胞团悬浮生生长。（3）植物细胞胞好气，培培养过程中中需供供气气及及搅搅拌拌，但但细细胞胞壁壁脆脆弱弱，，抗抗剪剪切切能能力力小小，，传传统统的的搅搅拌拌式式反反应应器器极极易易损损伤伤细细胞胞壁壁二、、植植物物细细胞胞培培养养基基植物物细细胞胞生生长长代代谢谢特特点点：：（1）需需大大量量无无机机盐盐（2）需需多多种种维维生生素素和和植植物物生生长长激激素素（3）无无机机氮氮源源，，硝硝酸酸盐盐，，铵铵盐盐为为主主。。（4）以以蔗蔗糖糖为为碳碳源源培养养基基配配方方见见表表5-3常用用培培养养基基MS、N6、B6、LS、RM-1964、H、T、B5、DBMII、米米勒勒、、改改良良怀怀特特、、尼尼许许等等。。MS培养养基基是目目前前应应用用最最多多最最普普遍遍的的培培养养基基。。无机机盐盐的的浓浓度度较较高高，能保保证组组织培培养生生长所所需的的矿物物营养养。并并且因因为离离子浓浓度高高，在在配制制、贮贮存、、消毒毒过程程中，，即使使有些些成分分略有有出入入，也也不致致影响响培养养基中中的离离子平平衡。B5含有较较低的的盐离子，这个成成分可可能对对很多多培养养物的的生长长有抑抑制作作用。White的无机机盐含含量较较低，适于生根培培养。KM-8p主要用用于原原生质质体培培养，其特点点是有有机成成分较较复杂杂，它包括括了几几乎所所有的的单糖糖和维维生素素、呼呼吸代代谢中中的主主要有有机酸酸。凡是花药培培养中常用用的培养基基，其成分较简简单，且KN03和(NH)2N04含高。（一）无机机盐大量元素：：氮、磷、钾钾、钙、镁镁、硫等微量元素：：硼、锰、锌锌、钼、铜铜、钴、氯氯等（二）生长长因素植物生长调调节剂植物生长激激素：生长素，细胞分裂素素，赤霉素，脱脱落酸，乙烯。借生长激素素调控生长长分化，以以及细胞培培养时，获获得最大量量的次生代代谢产物生长素（用来诱导导细胞的分分裂、愈伤伤组织形成成和根的分分化）：组组织培养中中常用的有有：吲哚乙酸(IAA)：第一个被被发现和人人工合成的的的激素二氯本氧乙乙酸(2,4-D)；萘乙酸(NAA)；吲哚-3-丁酸(IBA)；萘氧乙酸酸(NOA)；对氯苯氧氧乙酸(P-CPA)NAA、IAA、IBA易引起生根根，2,4-D有利于愈伤伤组织的诱诱导和生长长细胞分裂素素主要促进细细胞分裂和和由愈伤组组织上或器器官上分化化不定芽。。常用的有有：6-苄基嘌呤(BAP)6-苄基腺嘌呤呤(6-BA)激动素（呋呋喃氨基嘌嘌呤、Kinetin、KT）玉米素(zeatin、zt)异戊烯氨基基嘌呤(2-ip)植物培养物物的生长取取决于生长素和分裂素的比例：高浓度生长长素和低浓浓度分裂素素——刺激细胞分裂低浓度生长长素和高浓浓度分裂素素——刺激细胞生长（三）诱导导子(elicitor)：刺激植物细细胞合成防御性次生生代谢产物物的物质,可以通过改改变次生代代谢途径中中催化酶的的酶活力,引起代谢通通量和反应应速率的改改变,提高次生代代谢产物的的产量。非生物诱导导子：水杨酸，茉茉莉酸等,稀土及重金属盐类生物诱导子：微生物类，，如真菌孢子子，菌丝体真菌培养物滤滤液等（四）碳源细胞培养过程程中不进行光光合作用，需需提供糖做碳碳源。（五）维生生素：烟酸，，B1，B6（六）有机物物：甘氨酸或或水解络蛋白白，酵母提取取液液等。三、植物细胞胞生物反应器器植物细胞易聚聚集化，比较较脆弱，代谢谢途径和代谢谢产物累积与与细胞生长关关系的复杂性性，，选择合合适的培养方方法和反应器器影像产物产产量细胞培养周期期长，次生代代谢产物含量量相对较低，，提取困难，，生物反应器器技术还有待待深入各种生物反应应器性能比较较不同类型的生生物反应器各各有其优缺点点，而改进的的搅拌式生物物反应器和气气升式反应器器可能更适合合植物细胞的的培养。一般来说，悬悬浮培养的细细胞在干重不不大于20g/L时，以气升式式反应器为宜宜，而当干重重超过20g/L时，则改进的的搅拌式生物物反应器优于于其它类型的的反应器我国发明的“气升内错流”式植物细胞培培养反应器，，能够适应植植物细胞培养养周期长，培培养液随培养养进程而蒸发发减少的生物物反应过程；；可抑制气泡泡的聚合，减减弱气泡在液液面破裂时产产生的冲击力力对细胞的损损伤；可提高高降液区气含含率，消除降降液区缺氧现现象，并强化化混合与氧传传递，大大降降低反应器高高度。使用这种反应应器培养新疆疆紫草细胞，，培养结束时时细胞量达到到12gdw／L，紫草宁含量量达到了细胞胞干重的10％，是天然植植株含量的2～8倍四、植物细胞胞的获得和扩扩大培养（一）植物细细胞的获得1.外植体直接分分离法:机械切割、组组织破碎直接接从植物外植植体中分离2.愈伤组织分离离法：从愈伤组组织制备小细细胞团或单细细胞悬液3.原生质体再生生法：纤维素和果胶胶酶混合处理外植植体或愈伤组组织，分离原原生质体，再再生培养基中中培养，原生生质体细胞壁壁再生获得植植物细胞（二）植物细细胞的培养方方法1.单细胞的培养养（1）看护培养法（nurseculture）：在单细胞的的生长环境里里加入愈伤组组织同时培养养。愈伤组织织提供促细胞胞分裂的物质质等，传递生生物信息，使使持续分裂增增值等。即愈伤组织看看护单细胞（2）微室培养法：单细胞接种种到小室里，，密封培养，，观测单细胞胞的生长发育育情况（3）平板培养法：单细胞接种种于固体培养养基上，获得得单细胞形成成的细胞系（4）条件培养法：接种于条件件培养基上形形成的细胞系系。条件培养养基指培养过过细胞的培养养基上清，有有植物生长激激素等残留，，用于制备成成固体培养基基。2.单倍体细胞的的培养（花药培养））：指将植物物单倍体细胞胞培养成单倍倍体植株或纯纯和二倍体植植株一般采取花药药作为单倍体体细胞的培养养对象用花粉在固体体培养基上培培养3.愈伤组织培养养愈伤组织既是是组织又是细细胞，为脱分分化细胞，具具再分化的能能力，可用于于次生代谢物物的生产，也也可再生为植植株。4.毛状根诱导和和培养一些次生代谢谢产物只有在在根里生长发根农杆菌感感染双子夜植植物，RI质粒诱导产生生毛状根。形态方面：Ri质粒诱导快速速生长的、非非定向性、高高分支的毛状状根的形成代谢方面：Ri质粒转化根能能合成与原植植物相同或相相似的次生代代谢物，并且且发根合成次次生代谢物具具有遗传稳定定性。毛状根生长快快速和次级代代谢产物含量量高，特别适适用于从木本本植物和难于于培养的植物物中得到较高高含量的次级级代谢产物。。毛状根根具有有如下下特点点：激素自自养，不必必加外外源激激素；；次级代代谢产产物含含量高且稳定；增殖速速度快。用发根农农杆菌菌经直接注注射法法，外外植体体接种种感染染，原原生质质体共共培养养法诱诱导毛毛状根根发根农农杆菌菌转化化后，，经筛筛选鉴鉴定低盐浓浓度下下生长长，培培养植物细细胞培培养工工业化化存在在的问问题生长缓缓慢,通常完完成一一次生生产周周期需需4-5周次级代代谢物物含量量低培养细细胞不不稳定定等多数产产物积积累于于胞内内不耐受受剪切切力一般的的说，，只有有当次次级代代谢产产物的的价格格高于于1000美元/kg时，才才考虑虑采用用植物物细胞胞培养养方法法。第三节节转转基基因植植物一、转转基因因植物物的产产生和和发展展（一））转基基因植植物的的基本本概念念转基因因植物物：遗传修修饰体体(geneticallymodifiedorganisms,GMOs)近年发发展迅迅速应用广广泛世界第第一例例转基基因植植物-烟草1983年在美美国问问世。。1986年,首批转转基因因植物物-抗虫和和抗除除草剂剂棉花花进入入田间间试验验。1992年中国国成为为世界界上第第一个个转基基因植植物商商品化化种植植的国国家，，开创创了转转基因因植物物商品品化应应用的的先河河；当当时种种植的的是一一种抗抗黄瓜瓜花叶叶病毒毒和烟烟草花花叶病病毒双双价转转基因因烟草草。（二））转基基因植植物的的几大大类型型1.抗除草草剂:除草作作用的的酶和和蛋白白质基基因;以除草草剂为为底物物的酶酶的基基因转转移2.抗虫:从细菌菌中、、植物物组织织中和和动物物体内内分离离出相相关抗抗性基基因,转入植植物中中3.抗病4.抗逆境境:抗旱、、抗寒寒、抗抗热和和抗盐盐5.品质改改良6.代谢修修饰7.生产药药物二、转转基因因植物物技术术原理理和方方法（一））基因因获得得（1）氨氨基基酸酸序序列列反反推推核核酸酸序序列列，，合合成成探探针针，，从从基基因因组组或或cDNA文库库中中筛筛选选利用用这这种种方方法法人人类类首首次次人人工工合合成成了了胰胰岛岛素素基基因因。。虽然然在在早早期期采采用用这这种种方方式式已已经经成成功功地地克克隆隆了了许许多多基基因因。。局限限性性：：兼兼并并密密码码子子;效率率低低;未知知基基因因及及产产物物分离离蛋蛋白白质质明确确氨氨基基酸酸序序列列推导导核核苷苷酸酸序序列列人工工合合成成（2）分分离离蛋蛋白白，，制制备备抗抗体体，，用用抗抗体体从从cDNA表达达文文库库中中筛筛选选（3）根根据据数数据据库库信信息息，，利利用用保保守守区区域域制制备备PCR引物物，，进进行行扩扩增增（4）以以其其他他物物种种的的类类似似基基因因为为探探针针，，杂杂交交分分离离相相应应基基因因（二二））外外源源基基因因导导入入1.载体体转转化化系系统统是目目前前植植物物基基因因工工程程中中使使用用最最多多、、机机理理最最清清楚楚、、技技术术最最成成熟熟的的、、最最重重要要的的一一种种转转化化系系统统TumorinducedbyA.tumefaciens冠瘿瘿瘤瘤过程程：：先先将将带带有有目目的的基基因因的的质质粒粒整整合合到到农农杆杆菌菌基基因因组组中中，，再再将将此此农农杆杆菌菌与与植植物物细细(1)根癌农农杆菌菌转化系系统。。含有Ti质粒，，感染染双子叶叶植物物时，质质粒中中DNA整合到到植物物的染染色体体上，，并随随染色色体一一起复复制。。随后后T-DNA携带的的基因因在植植物中中表达达出相相应的的蛋白白质。。Ti质粒是是约160-240kb的环状状DNA分子。。Ti质粒具具有两两个区区域，，T-DNA和毒性区区域(vir)还具有有冠瘿瘿碱代代谢(opinecatabolism)、复制制原点点(ori)。T-DNA区包括括：章鱼碱碱合成成酶基基因nos植物生生长素素生物物合成成酶基基因Tm1,Tm2植物分分裂素素生物物合成成酶基基因tmrT-DNA区编码码的基基因第一类类是编编码冠冠瘿碱碱合成成酶及及分解解代谢谢基因因。第二类类是致致瘤基基因生长素素基因因（Aux）。即即肿瘤瘤细胞胞茎芽芽产生生Tms基因（（tumourmorphologyshoot）Aux-l（Tm-1），编编码色色氨酸酸单加加氧酶酶,将色氨氨酸转转变成成吲哚哚乙酰酰胺IAMAux-2（Tm-2），编码吲哚哚乙酰胺水解解酶，将IAM转变成乙酸吲吲哚IAA。细胞分裂素基基因（cyt），突变将引引起易生根特特性。故称为为Tmr（tumourmorphologyroot）基因由于Tms和Tmr基因的表达，，使转化植物物细胞内激素素平衡紊乱，，冠瘿瘤细胞胞无限生长，，形成激素自自主性特性，，引起癌变。。T-DNA:农杆菌侵染植植物细胞时，，从Ti质粒上切割下下来转移到植植物细胞的一一段DNA，称为转移DNA。该DNA片段上的基因因与肿瘤的形形成有关直接参与转移移并整合的，，仅是T-DNA两端与其它序序列交界处的的25bp不完全直接重重复，为右界界(rightborder,RB)和左界(leftborder,LB)。T-DNA区域内的所有有基因与转移移无关，将致致瘤基因全部部缺失即卸甲甲(disarmed)后，将其它序序列插入到这这个区域，形形成的T-DNA仍可将将RB至LB内的序序列转转移并并整合合到植植物基基因组组。Vir基因:区段上上的基基因能能激活活T-DNA转移，，使农农杆菌菌表现现出毒毒性根据其其诱导导的植植物冠冠瘿瘤瘤中所所合成成的冠冠瘿碱碱种类类不同同，Ti质粒可可以被被分成成四种种类型型：章鱼碱碱型(octopine)胭脂碱碱型(nopaline)农杆碱碱型（（agropine）农杆菌菌素碱碱型（（agrocinopine）或称称琥珀珀碱型型(succinamopine)为了使使Ti质粒成成为有有效的的外源源基因因导入入载体体，必必须对对野生生型Ti质粒进进行改改造去除致致瘤基基因，，及冠冠瘿碱碱合成成基因因，保保留左左右边边界，，及毒毒性区区域增加选选择标标记（（如：：大观观霉素素）和和报告告基因因增加大大肠杆杆菌复复制起起始子子，构构建植植物细细胞-大肠杆杆菌穿穿梭质质粒目前有有共整合合载体体系统统和双元载载体系系统共整合合载体体：载体体的T-DNA区与Ti质粒Vir区连锁锁，又又称之之为顺顺式载载体（（cis-vector）。特点：：①由由两个个质粒粒（E.coli质粒和和Ti质粒））重组组而成成，分分子量量较大大；②共合合体的的形成成频率率与两两个质质粒的的重组组频率率有关关,相对较低；；③必须用Southern杂交或PCR对大的共整整合体质粒粒进行检测测；④构建时比比较困难。。共整合载体体和农杆菌菌质粒重组过过程土壤农杆菌菌-植物DNA转移体系步步骤植物敏感细细胞和土壤壤农杆菌相相互作用土壤农杆菌菌的毒性区区基因被激激活T-DNA的切割和T复合物生成成T复合物由土土壤农杆菌菌经植物细细胞膜进入入植物细胞胞T-DNA整合到植物物染色体上上双元载体系系统：由两个分分别含T-DNA和Vir区的相容性性突变Ti质粒构成的的双质粒系系统,又因为其T-DNA与Vir基因在两个个独立的质质粒上，通通过反式激激活T-DNA转移,故称之为反反式载体（（transvecter）.包括两个Ti质粒，即微微型Ti质粒和辅助助Ti质粒。（2）发根农杆杆菌介导转转化Ri质粒为根诱诱导质粒。。Ri质粒的结构构与Ti质粒很相似似，分为T区、vir区、ori区等。T区与Ti质粒的T-DNA十分相似：：①T区的左右边边界序列，，含有25bp的重复序列列。②TL-DNA区。该区中中含有与毛毛状根形成成有关的rolA、B、C、D基因群。③TR-DNA区。该区中中含有与农农杆碱合成成有关的基基因（ags）和生长素素合成有关关的基因（（tms1、tms2）。ags基因在转化化的初期起起着重要的的作用，是是不定根产产生的关键键和Ti质粒相比，，Ri质粒转化有有许多优点点：①Ri质粒可以不不经“解除武装”进行转化，，并且转化化产生的发发根能够再再生植株；；②发状根是是一个单细细胞克隆，，可以避免免嵌合体；；③Ri质粒和Ti质粒可以以配合使使用，建建立双元元载体系系统，拓拓展了两两种质粒粒应用范范围；④发根适适用于进进行离体体培养，，很多植植物的发发根在离离体培养养条件下下都有原原植物次次生代谢谢产物合合成能力力。(3)植物病毒毒载体病毒载体体只要与与植物细细胞共培培养就可可以较高高地感染染植物细细胞；且且外源基基因能在在植物细细胞中快快速复制制和高水水平表达达。但病毒载体的的容量有限,不能包装大片片段,寄主范围窄,复制稳定性差差,转录和复制机机理复杂。目前,用的较多的是是花椰菜花斑病病病毒(CaMV)和烟草花叶病病毒(TMV)。需要注意的是是其他病毒侵侵染植株后可可能会跟所用用的载体病毒毒之间发生信信息交换,进而导致载体体病毒重新获获得其致病能能力Promotersusedforexpressionintransgenicplants35S,cauliflowermosaicvirus35SpromoterCaMV35Sisastrongpromoterthatisactiveinessentiallyalldicotplanttissues.CaMVisacirculardsDNAgenomevirus2.基因直接接导入农杆菌载载体转化化系统对对单子叶叶植物的的局限性性（1）DNA直接吸收收到植物物细胞制备原生生质体，，电穿孔法法PEG等介导基基因转化化（2）显微注注射法显微注射射，是利利用显微微注射仪仪将外源源DNA直接注入入受体细细胞质或或细胞核核中。显显微注射射的一个个重要问问题是必必须把受受体细胞胞进行固固定。不需要去去除细胞胞壁成本高细胞存活活率低（3）脂质体体介导基基因转化化脂质体法法是用脂脂类化学学包裹DNA成球体，，通过植植物原生生质体的的吞噬或或融合作作用把内内含物转转入受体体细胞。。优点,包括可保保护DNA在导入细细胞之前前免受核核酸酶的的降解作作用,降低了对对细胞的的毒性效效应,适用的植植物种类类广泛,重复性高高,包装在脂脂质体内内的DNA可稳定地地贮藏等等。（4）粒子介介导DNA转移基因枪法法（genegun）是依赖赖高速的的金属微微粒将外外源基因因导入活活细胞的的一种转转化技术术。其基本原原理是将将外源DNA包被在微微小的金金粒或钨钨粒表面面，然后后在高压压的作用用下微粒粒被高速速射入受受体细胞胞或组织织。微粒粒上的DNA进入细胞胞后整合合到植物物染色体体上得到到表达，，从而实实现基因因转化。。是继农杆菌菌介导法之之后的第二二大基因转转化法。在禾本科作作物上应用用较广泛基因枪法转转化的优点点有：无宿主限制制：农杆菌介介导法只对对双子叶植植物敏感，，限制了它它的应用范范围。而基基因枪没有有物种限制制。靶受体类型型广泛：可以是原原生质体，，叶片，悬悬浮细胞，，茎或根切切段，种子子胚，愈伤伤组织，花花粉等。操作简单快快速但该方法转转化率低，，外源DNA整合机理不不清楚。应应该说该技技术只处在在研究阶段段，尚未成成熟。3.种质转化系系统法种质转化系系统是以植物自自身的生殖殖系统种质质细胞为受受体进行的的转化，如如花粉浸泡泡外源DNA、DNA注射受粉后后的子房等等；花粉管通道道法：利用植物物在受精和和胚发育初初期接受外外源DNA的敏感性1.外源DNA转化花粉2.自花授粉后后，下柱头头，外源DNA滴在柱头，，沿花粉管管道进入胚胚囊，转化化受精前后后的卵细胞胞常用植物基基因转化方方法特点比比较转化方法农杆菌法PEG法电击法微针注射法基因枪法花粉管通道法受体材料完整细胞原生质体原生质体原生质体完整细胞卵细胞宿主范围

有无无无无有性繁殖植物组培条件简单复杂复杂复杂简单无嵌合体比例有无无无多无操作复杂性简单简单复杂复杂复杂简单设备要求便宜便宜昂贵昂贵昂贵便宜工作效率高低低低高低单子叶植物应用少可行可行可行广泛广泛（三）受体体系统1.原生质体受受体系统:嵌合体少少，易变异异，再生频频率低原生质体恢恢复细胞壁壁具有分化化再生能力力，是应用用最早的再再生受体系系统之一。。优点：高效效、广泛地地摄取外源源DNA或遗传物质质，获得基基因型一致致的克隆细细胞，所获获转基因植植株嵌合体体少，适用用于多种转转化系统；；缺点：不易易制备、再再生困难和和变异程度度高。2.愈伤组织受受体系统：植体材料经经过脱分化化培养诱导导形成愈伤伤组织，转转化（带有有目的基因因质粒的农农杆菌侵染染），分化化培养获得得再生植株株。愈伤组织易易接受外源源DNA，转化效率率高,适用性广，，变异大优点：外植植体来源广广，繁殖快快，易接受受外源基因因，转化化效率高。。缺点：遗传传稳定性差差、嵌合体体。因此需需要连续的的再生系统统3.种质系统：生殖细胞胞接受外源源DNA能力强，转转化的基因因无显隐性性的影响,与育育种种结结合合紧紧密密，，受受季季节节限限制制以生生殖殖细细胞胞如如花花粉粉粒粒、、卵卵细细胞胞等等受受体体细细胞胞进进行行外外源源基基因因转转化化的的系系统统。。一是是利利用用组组织织培培养养技技术术进进行行小小孢孢子子和和卵卵细细胞胞的的单单倍倍体体培培养养、、转转化化受受体体系系统统；；二是是直直接接利利用用花花粉粉和和卵卵细细胞胞受受精精过过程程进进行行基基因因转转化化，，如如花花粉粉管管导导入入法法，，花花粉粉粒粒浸浸泡泡法法，，子子房房微微针针注注射射法法等等。。4.胚状状体体再再生生系系统统：最最理理想想的的基基因因转转化化受受体体系系统统体细细胞胞胚胚使使具具卵卵细细胞胞特特性性的的胚胚性性细细胞胞发发育育而而来来，，接接受受外外源源DNA能力力强强体细细胞胞单单细细胞胞起起源源，，嵌嵌合合体体少少；；体体胚胚具具两两极极性性，，可可同同时时分分化化根根和和芽芽；；个个体体遗遗传传背背景景一一致致，，可可通通过过反反应应器器大大规规模模生生产产。。5.直接接分分化化芽芽受受体体系系统统：由由未未分分化化的的细细胞胞直直接接分分化化形形成成，，体体细细胞胞元元件件系系变变异异小小，，导导入入的的外外源源基基因因可可稳稳定定遗遗传传。。但易易形形成成嵌嵌合合体体，，转转化化频频率率低低。。（四四））表表达达和和分分析析基因因水水平平的的检检测测：：RE分析析，，DNA序列列分分析析，，PCR，SouthernBlot，RFLP，RAPD等。翻译水平的检检测：ELISA，Western选择标记基因因检测法：抗生素抗性基基因除草剂抗性基基因报告基因检测测法：冠瘿碱基因Gus基因(β-葡糖苷酸酶酶基因)Cat(氯霉素乙酰酰转移酶基基因)(GFP)绿色荧光蛋蛋白基因Gus基因（β-葡糖苷酸酶酶基因）在植物细胞胞中所产生生的葡糖苷苷酸酶在检检测上具有有以下特点点：①在一定条条件下与X-G1ucuionicacid底物发生作作用，产生生蓝色沉淀淀，既可以以用分光光光度法测定定，又可以以直接观察察到植物组组织中形成成的蓝色斑斑点。②当加入4-甲基伞形酮酮基和葡萄萄糖苷酸时时生成4-甲基伞形酮酮，发荧光光（λ=465nm）。因而可可以用荧光光光谱法测测定。由于于荧光强度度高，本底底低，故荧荧光检测极极为灵敏。。三、转基因因植物生产产药用植物物的安全性性问题1.安全性问题题转基因植物物存在的用用于选择性性标记的抗抗生素，以以及导入植植物的DNA序列在加工工过程中可可能出现的的改变。2.环境及生态态问题导入植物的的目的基因因是否转入入其他植物物，是否会会破坏生态态平衡。第四节在在制药工工业上的应应用一、生产天天然药物(1)人参细胞培培养MS培养基生长初期低低糖，生长长后期补糖糖控制磷酸盐盐浓度和PH添加生长素素和激动素素离心叶轮式式反应器进进行高密度培养养细胞干重最最多达30g/L人参皂苷达达2g/L(2)红豆杉细胞胞培养紫杉醇(Paclitaxel):二萜类化合合物,抗癌药，是是有丝分裂裂抑制剂，，可阻止微微管正常生生理聚集，，抑制癌细细胞的有丝丝分裂和纺纺锤体的形形成，从而而使癌细胞胞的复制受受到阻断而而凋亡。1967年美国化学学家Wall和Wani首先从太平平洋紫杉杉（短叶红红豆杉）树树皮中提取取出来。该该药1992年底获美国国FDA批准上市。。紫杉醇存在在于红豆杉杉属植物的的树皮、叶叶及茎中，，其中树树皮中的含含量最高。。12000株成年紫杉杉树中才能能提取1KG的紫杉醇，，而且紫杉杉的生长周周期很长，，在世界分分布很少。。紫杉醇的国国际市场价价格为450美元/gB5培养基，补补糖，暗培培养低浓度的生生长激素诱导子培养基中加加甲基戊酸酸，苯丙氨氨酸等前体体加甲瓦龙酸酸等中间产产物加单萜合成成抑制剂筛选细胞株株最高产量达达0.15g/L(3)丹参发根生生物反应器器大规模培培养技术丹参(Salviamiltiorrhiza)：活血化淤淤,通经止痛.丹参中含有有二类活性性成分:脂溶性二萜萜醌类化合合物和水溶溶性酚酸类类化合物.具有抑制血血小板聚集集、耐缺氧氧、改善冠冠状动脉供供血等药理理作用,是治疗心血血管系统疾疾病的重要要药物。丹参有效成成分在原植植物根中含含量低、生生长周期长长,加之之近近年年产产地地环环境境污污染染和和为为防防病病虫虫喷喷施施农农药药等等原原因因,便得得原原料料药药的的供供应应在在数数量量和和质质量量上上都都不不能能满满足足临临床床应应用用的的需需要要。。用植植物物组组织织培培养养反反应应器器(10L规模模)进行行了了丹丹参参发发根根培培养养的的研研究究,发现现丹丹参参发发根根在在50天内内鲜鲜重重增增殖殖倍倍数数可可高高达达240倍左左右右,丹参参酮酮、、丹丹酚酚酸酸A的含含量量也也相相当当高高，，非非常常适适合合于于丹丹参参发发根根的的生生长长及及丹丹参参酮酮的的积积累累,而且且利利用用此此系系统统生生产产出出的的丹丹参参及及其其有有效效成成分分由由于于不不受受农农药药等等污污染染物物的的影影响响,具有有广广阔阔的的市市场场前前景景。。丹参参发发根根生生物物反反应应器器培培养养的的中中试试已已达达100L规模。(4)紫草细胞胞培养化学成分分:含乙酰紫紫草素、、β-羟基异戊戊酰紫草草素、紫紫草素、、β，β’-二甲基丙丙烯酰紫紫草素等等。性味性寒寒，味甘甘、咸。。功能主治治凉血血，活血血，解毒毒透疹。。用于血血热毒盛盛、斑疹疹紫黑、、麻疹不不透、疮疮疡、湿湿疹、水水火烫伤伤。紫草宁产产生于亚亚洲的多多年生植植物紫紫草的根根部。。但紫草草资源严严重不足足，在日日本，紫紫草已濒濒临灭绝绝，在我我国，紫紫草列入入了国际际二级保保护植物物紫草宁可可用作创创伤、烧烧伤以及及痔疮的的治疗药药物，同同时又作作为高级级色素使使用。紫草的人人工栽培培成活率率低，而而且直接接提取紫紫草宁的的无法满满足市场场需求。。化学合成成紫草宁宁的工艺艺非常复复杂，且最终产产率只有有0.7％，生产产成本昂昂贵。紫草宁在在国际市市场上售售价高达达7000美元/kg1974年Tabata等就研究究了用于于培养紫紫草细胞胞的培养养基。1981年Tabata和Fujita等又用大大的培养养容器进进行细胞胞悬浮培培养并获获得了紫紫草宁衍衍生物。。日本在1983年进行紫紫草细胞胞大规模模培养来来生产紫紫草宁。。我国南京京大学等等从1986年开始对对该项目目进行研研究，在在进行大大量的研研究之后后得出，，在适当当的条件件下，培培养的紫紫草细胞胞悬浮物物中紫草草宁含量量占干重重的14%，比紫草草根中的的含量高高10倍。B5,N6,MG5,LS培养基PH5.3-5.8生物诱导导子生长素与与激动素素25度暗培养两步培养养法使用两个个生物反反应器，，第一个个用于细细胞生物物量的累累积(适合细胞胞生长的的培养基基，营养养丰富)，第二个个用于次次级代谢谢产物的的生产(较低含量量的硝酸酸盐和磷磷酸盐，，并含有有较低的的糖分或或少量的的碳源)日本科学学家用此此方法开开发了第第一个植物细胞工程产产品——紫草宁通过提高高第二个个反应器器中的Ca2+浓度，大大幅度增加了培培养液中中的紫草草素含量量二、生产产抗体、、重组疫疫苗、多多肽类药药物上游游生生产产成成本本低低获取取的的遗遗传传性性质质稳稳定定自然然条条件件下下易易于于生生长长，，管管理理植物物作作为为生生物物反反应应器器，，可可省省去去下下游游提提取取，，廉廉价价生生产产蛋白白在在植植物物中中多多数数正正确确折折叠叠，，保保证证生生物物活活性性的的稳稳定定利用用转转基基因因植植物物生生产产抗抗体体表达达抗抗体体的的关关键键是是抗抗体体片片段段正确确组组装装和和糖糖基基化化等后后修修饰饰。。在在植物物和和动动物物的的内内膜膜系系统统中中蛋蛋白白质质折折叠叠机机制制相相当当类类似似，植植物物能能够够表表达达全全长长的的抗抗体体重重链链、、轻轻链链并并能能高高效效组组装装构构成成完完整整的的抗抗体体。。植物中的的糖基化化同时包包括N及O糖基化，，和动物物稍有不不同，植物的糖糖基化更更具有异异质性，不同植植物产生生的糖基基化末端端不相同同，即使使是同一一株植物物不同时时期产生生的糖基基末端仍仍有不同同。糖基基化不会会对抗体体与抗原原的结合合能力及及特异性性产生影影响，，但可能能会影响响抗体构构型或体体内的清清除。目前研究究发现苜苜蓿可产产生单一一糖型的的抗体，，它有望望成为更更为合适适的表达达系统。。许多IgG单抗已能能在植物物中表达达，且在在治疗中中有应用用价值。。第一个个在植物物中表达达的抗体体是IgG1，通过杂杂交繁殖殖的烟草草表达其其重链及及轻链构构成完整整的抗体体，图5-13。目前，表表达的类类型有分分泌抗体体和抗体体片段。