植物生物技术

植物花粉和花药培养花粉培养花药培养第一节花粉培养

花粉培养（pollenculture）：是指当花粉发育到一定阶段，从花药中分离出单个花粉粒，接种到培养基上改变正常发育和机能，不经受精作用而发生细胞分裂并诱导单倍体再生植株的方法。花粉培养的意义花粉小孢子发育途径花粉分离方法花粉培养的方法花粉植株形态发生方式花粉植株的再生与驯化移栽影响花粉培养的主要因素一、花粉培养的意义花粉培养是细胞工程育种中的重要手段之一。在育种领域花粉培养与常规杂交育种、远缘杂交育种、诱变育种以及转基因技术相结合。是生物技术在农作物育种中应用最广泛、最有成效的方法之一。二、花粉小孢子发育途径（一）小孢子的正常发育（二）离体培养条件下的小孢子发育离体培养的原始细胞：花粉花粉形成植株的途径称为花粉孢子体发育途径根据小孢子第一次有丝分裂的情况将雄核的发育分为：A途径（不均等分裂）：花粉的营养细胞不均等分裂数次有丝分裂花粉粒多细胞团胀破花粉壁胚状体

生殖核不参与花粉孢子体的形成B途径（均等分裂）：单核小孢子均等分裂细胞壁将小孢子分隔两个营养型细胞两次分裂多细胞花粉胀破花粉壁胚状体或愈伤组织C途径（不均等分裂、：产生非单倍体植株）已经进行过第一次配子体有丝分裂花粉中营养核与生殖核融合一次分裂花粉植株生殖核和营养核共同参与花粉孢子体的形成。三、花粉分离方法取小孢子处于单核中晚期的新鲜材料，接种前先经低温（8~10℃）预处理，然后选用下列方法游离小孢子。（一）机械分离法：单核中期花粉的幼花蕾消毒无菌水冲洗花药培养液挤压花药花粉粒40μm网筛过滤花粉悬浮液500~800r/min离心3min弃上清离心三次花粉密度调整至1*104~5*104个/mL

机械分离对花粉造成损伤较大（二）散落花粉法：花药液体培养基悬浮花粉自然释放取走花药。四、花粉培养的方法（一）液体培养

（二）双层培养法：在琼脂培养基上部加入薄层液体花粉培养液进行培养。可以保持良好湿度，利于花粉生长。

（三）看护培养：将单个花粉接种于滤纸上，再置于愈伤组织之上培养。优点是操作简便，成功率高；缺点是不能再显微镜下直接观察。

（四）微室培养：将花粉接种于一个由上下两个盖玻片与一金属圈封闭围成的小室内，一定条件下培养。其特点是可以循环供应营养液。最大优点是花粉生长可以尽量少地受到代谢产物积累的影响。花粉培养的方法主要有液体培养、双层培养、看护培养、微室培养。液体浅层培养法：悬浮花粉在培养皿中形成一浅薄膜优点：易于添加新鲜培养基，可以镜检液体悬浮培养法：花粉分散接种于液体培养基中优点：营养吸收和环境条件好，大规模培养。五、花粉植株形态发生方式（一）器官发生途径愈伤组织适当比例生长素和细胞分裂素的分化培养基产生芽或根小植株（二）胚状体发生途径胚状体心形期鱼雷期子叶期小植株。六、花粉植株的再生与驯化移栽植株长至5~6片叶以上大小时可进行移栽。移栽前的驯化：打开培养容器，室内自然光下放置3~4d，取出小苗，洗去培养基，移入准备好的基质中。。七、、影影响响花花粉粉培培养养的的主主要要因因素素（一一））供供体体植植株株的的基基因因型型：：基基因因型型不不同同，，诱诱导导形形成成再再生生植植株株的的难难易易程程度度有有较较大大差差异异（二二））供供体体植植株株的的生生理理状状态态和和栽栽培培条条件件：：植植株株的的生生理理形形态态和和接接种种季季节节对对花花药药愈愈伤伤组组织织诱导导率率有有显显著著变变化化（三三））花花粉粉发发育育时时期期：：随随着着供供体体植植株株的的老老化化，，花花粉粉对对离离体体培培养养的的反反应应能能力力大大大大下下降降（四四））培培养养前前和和培培养养初初期期的的预预处处理理：：预预处处理理措措施施主主要要是是低低温温处处理理。。机机理理：：一一是是低低温温可可以改改变变花花粉粉粒粒第第一一次次有有丝丝分分裂裂的的纺纺锤锤体体轴轴向向；；二二是低低温温作作用用可可以以使使花花粉粉保保持持较较长长时时间间的的活活力力（五）培培养基：：花粉愈愈伤组织织分化为为植株需需要较低低浓度生生长素和和高浓度度细胞分分裂素；；花粉植株株诱导频频率随培培养基中中蔗糖浓浓度升高高而增大大小孢子培培养过程程中会产产生有毒毒物质，，注意活活性炭的的添加和和培养基基的更换换（六）培培养条件件光照温度。第二节花花药药培养一、花药药培养的的意义二、花药药的采集集和处理理三、花药药培养四、影响响花药培培养效率率的因素素五、花药药单倍体体植株的的再生与与鉴定六、单倍倍体植株株的染色色体加倍倍花药培养养（antherculture）：将完整的的花药接接种到培培养基上上使花粉粉粒改变变正常发发育和机机能，不不经受精精而发生生细胞分分裂，诱诱导形成成单倍体体再生植植株的过过程。一、花药药培养的的意义为了获得得单倍体体植株，，为基础础研究和和育种提提供有用用的材料料二、花药药的采集集和处理理（一）花花药的采采集：选选取生命命力强、、颗粒饱饱满的花花药，一一般以花粉粉单核中中、晚期期为佳花药的处理1、低温预处处理：较低温温度处理理时间段段，较高高温度处处理时间间长2、秋水仙碱碱液预处处理：秋水仙碱碱是一种种染色体体加倍剂剂，阻碍碍纺锤丝丝的形成成3、甘露醇预预处理：：可提高成成功率。三、花药药培养（一）培培养基（二）培培养条件件（三）培培养过程程碳源：高浓度蔗蔗糖不利利于体细细胞的生生长，但但不妨碍碍花药的生长氮源：有机氮源源对细胞胞初级培培养的早早期生长长有利植物生长长调节剂剂：生长素和和细胞分分裂素比比例适当，能促促进孢子子体的小小孢子发发育。四、影响响花药培培养效率率的因素素（一）供供试材料料的基因因型（二）供供试材料料的生理理状态（三）花花粉的发发育时期期。五、花药药单倍体体植株的的再生与与鉴定花药发育育成小植植株有愈愈伤组织织和胚状状体两种种发育途途径。再再生植株株并非完完全由小小孢子发发育而来来。鉴定再生生植株的的来源：：遗传学，，一般是是通过染染色体数数量来确确定植物物的倍性性形态学层层次，观观察不同同倍体植植株生长长发育时时的形态态特征差差异，间间接确定定植物倍倍性分子生物物学层次次，流式式细胞仪仪测定基基因组DNA含含量，直直接确定定再生植植株倍性性细胞学层层次，染染色体计计数直接接鉴定法法和叶片片保卫细细胞叶绿绿体计数数间接鉴鉴定法。六、单倍倍体植株株的染色色体加倍倍物理方法