核酸的生物合成

第九章核酸的生物合成中心法则生物的遗传信息从DNA传递给mRNA的过程称为转录。根据mRNA链上的遗传信息合成蛋白质的过程，被称为翻译和表达。1958年Crick将生物遗传信息的这种传递方式称为中心法则。Reversetranscription第一节DNA的生物合成一、DNA的半保留复制复制时期

1.半保留复制的证明2.DNA生物合成的基本问题

模板引物dNTPDNA聚合酶Mg2＋在5’-3’方向延伸二、原核细胞DNA的复制合成

1.原核DNA聚合酶2.复制的复杂性5’5’3’3’酶作用DNA聚合酶Ⅰ5‘－3’聚合酶及外切酶作用，3‘－5’外切酶酶作用，可校正/修复DNA链，还可切除引物DNA聚合酶Ⅱ5‘－3’聚合酶及3‘－5’外切酶酶作用，可校正/修复DNA链DNA聚合酶Ⅲ与酶Ⅰ作用类似，酶活高，是主要的链延伸酶（聚合酶replicase）冈崎片段与半不连续复制（okazaki1968年）复制方向：单起点、双向或单向复制引物（primer）及引物酶(primase)引物的切除与连接

5’－3’外切酶切除引物（DNA聚合酶Ⅰ

）DNA连接酶

（大肠杆菌DNA连接酶/T4连接酶）复制的起始辨识起点（富含AT区）解旋（拓扑异构酶）解链单链结合蛋白（SSB）三、真核DNA的复复制合成真核DNA的合成的的基本过程程类似于原原核DNA，不同之之处：多复制起点点至少有五种种聚合酶αβγδεε端粒的复制制依赖于端端粒酶真核生物DNA聚合合酶

αβγδε亚基数44425分子量（KD)＞25036-38160-300170256细胞内定位核核线粒体核核5′→3′聚合活性＋＋＋＋＋3′→5′外切活性－－－－－

功能复制、引发修复复制复制复制DNA复制制过程真核生物DNA复制制叉结构示示意图四、反转录录作用（RNA指导导下的DNA合成））1970年年，Temin和Baltimore在致癌RNA病毒毒中发现了了反转录酶酶（ReverseTranscriptase）1.DNA聚合酶特特性需引物（tRNA））、dNTP、模板板（RNA、DNA）、5’’-3’方方向聚合2.杂交分分子H键断断开常由核糖核核苷酶H（（RNAaseH）专一切切除RNA-DNA分子中中的RNA,全部或或部分去除除RNA3.前病毒毒DNA合成的DNA链称负负链,然后后由依赖DNA的DNA聚合合酶催化下下,以负链链为模板合合成一正链链这样形成成的DNA称前病毒毒DNA,前病毒DNA可嵌嵌入宿主细细胞DNA中(称整整合)或潜潜伏于宿主主细胞用其其负链(依依赖DNA的RNA聚合酶)出RNA,合成外外壳蛋白.1五、DNA的损伤伤与修复1.DNA的损伤与与突变损伤可造成成突变或致致死突变（mutation））：指一种遗传传状态，可可以通过复复制而遗传传的DNA结构的任任何永久性性改变。携携带突变基基因的生物物称为突变变体，未突突变的称为为野生型。。损伤原因物理（紫外外（见下页））、高能射线线、电离辐辐射）化学（烷基基化试剂、、亚硝酸盐盐、碱基类类似物）生物因素（（碱基对置置换、碱基基的插入/缺失造造成移码））当DNA受受到大剂量量紫外线（（波长260nm附附近）照射射时，可引引起DNA链上相邻邻的两个嘧嘧啶碱基共共价聚合，，形成二聚聚体，例如如TT二聚聚体。2.DNA损伤修修复光复活切除修复重组修复SOS修复复光复活（photoreactivation）可见光（最最有效波长长400nm）激活活生物界广广泛分布（（高等哺乳乳动物除外外）的光复复活酶，该该酶分解嘧嘧啶二聚体体。是一种高度度专一的修修复形式，，只分解由由于UV照照射而形成成的嘧啶二二聚体。切除修复（（excisionrepair））即在一系列列酶的作用用下，将DNA分子子中受损伤伤的部分切切除掉，并并以完整的的那一段为为模板，合合成出切去去的部分，，从而使DNA恢复复正常。这这是一种比比较普遍的的修复机制制。细胞的修复复功能对于于保护遗传传物质DNA不受破破坏有重要要意义。重组修复（（recombinationrepair）又称复制后后修复（postreplicationrepair）受损伤的DNA在进进行复制时时，跳过损损伤部位，，在子代DNA链与与损伤相对对应部位出出现缺口。。通过分子子间重组，，从完整的的母链上将将相应的碱碱基顺序片片段移至子子链的缺口口处，然后后再用合成成的多核苷苷酸来补上上母链的空空缺，此过过程即重复复修复。并并非完全校校正。SOS修复复指DNA受受到严重损损伤、细胞胞处于危急急状态时所所诱导的一一种DNA修复方式式，修复结结果只是能能维持基因因组的完整整性，提高高细胞的生生成率，但但留下的错错误较多，，又称倾错错性修复（（Error-ProneRepair））。3.基因因重组与DNA克隆隆（基因工工程）限制性内切切酶能识别DNA特定核核苷酸序列列的核酸内内切酶分布：主要在微生生物中。特点：特异性，即即识别特定定核苷酸序序列，切切割特特定切点。。结果：产生黏性未未端（碱基基互补配对对）。举例：大肠杆菌的的一种限制制酶能识别别GAATTC序列列，并在G和A之间间切开。一种限制酶酶只能识别别一种特定定的核苷酸酸序列，并并在特定的的切割点上上将DNA分子切切断。目前前已发现的的限制酶有有400～～500多多种。运载体种类类：质粒、噬菌菌体和动植植物病毒。。质粒的特点点:细胞染色体体外能自主主复制的的小型环状状DNA分分子；质粒是基因因工程中最最常用的运运载体；最常用的质质粒是大肠肠杆菌的质质粒；存在于许多多细菌及酵酵母菌等生生物中；质粒的存在在对宿主细细胞无影响响；质粒的复制制只能在宿宿主细胞内内完成。DNA重组组与克隆①从细胞中中分离出DNA①②③④⑤⑥②限制酶截取DNA片断③分离大肠杆菌中的质粒④DNA重组⑤用重组质粒转化大肠杆菌⑥培养大肠杆菌克隆大量基因⑦重组体的筛选PCR(polymeraseChainreaction)聚合酶链式式反应PCR也称称体外酶促促基因扩增增，原理类类似天然DNA复制制。靶DNA分子变变性后解链链，两条单单链DNA分别与两两条引物互互补结合，，在4种dNTP存存在和合适适和条件下下，由耐热热的TaqDNA聚合酶催催化引物由由5’－－3’扩扩增延伸，，形成两条条新的双链链DNA分分子，并作作为下一循循环的模板板。每经过过一个变性性、复性、、延伸循环环，模板DNA增加加一倍。经经过30～～50个循循环，可使使原DNA量增加106～109倍。。PCR的主主要步骤：：•模板DNA的变性一一般选用95℃左右右1min，使DNA双双链解为单单链•复性按按引引物实际情情况确定适适当温度，，时间一般般30s至至1.5min•延伸一一般72℃1min•循环数数按按初始模板板浓度确定定，一般25－45之间PCR的引引物设计PCR扩增增产物的特特异性主要要由引物决决定，引物物的设计是是PCR成成功的关键键，•引物物位置和和产物长长度根据不同同目的和和要求确确定，长长度一般般在200～800bp之间间•引物物的长度度一般为18～25bp•末端端核苷酸酸3’端不不得有任任何修饰饰•G＋＋C含量量和Tm值一般在40－60%之之间，两两条相差差2－3℃第二节RNA的生生物合成成DNA携携带的遗遗传信息息（基因因）传递递给RNA分子子的过程程称转录录（transcription）。在生物界界，RNA合成成有两种种方式：：一是DNA指指导的RNA合合成，此此为生物物体内的的主要合合成方式式。另一一种是RNA指指导的RNA合合成，此此种方式式常见于于病毒。。转录产产生的初初级转录录本是RNA前前体（RNAprecursor），需需经加工工过程（（processing）方方具有生生物学活活性。反应体系系：DNA模模板,NTP,酶，Mg2+,Mn2+，，合成方方向5'→3'。连连接方式式--3',5'磷酸酸二酯键键。转录特点点：不对称转转录--DNA片段转转录时，，双链DNA中中只有一一条链作作为转录录的模板板，这种种转录方方式称作作不对称转转录。模板链(templatestrand)及反反意义链链(antisensestrand):指导RNA合成成的DNA链为为模板链链，又称称反意义义链。编码链(codingstrand)及及有意义义链(sensestrand)：不作为转转录的另另一条DNA链链为编码码链，又又称有意意义链。。由于基基因分布布于不同同的DNA单链链中，即即某条DNA单单链对某某个基因因是模板板链，而而对另一一个基因因则是编编码链。。原料：四种磷酸酸核苷NTP,DNA中的T在RNA合成成中变为为U合成过程程:连续，方向：5‘→3’从头头合成,5´——末端的的起始核核苷酸常常为GTP或ATP一、转录录基本特特点不对称转转录“转录单单位”（（transcriptionunit）以操纵子（operon）为转转录的功功能单位位,结构构上包括括四个功功能区：：多顺反反子（结结构基因因区）、、启动子子、操作作子、终终止子和和调节基基因。原核RNA聚合合酶转录过程程二、原核核细胞RNA转转录合成成特点调节基因启动子操纵基因lacZlacYlacACAPcAMPCAP-cAMP复合物mRNA+-半乳糖苷酶-半乳糖苷透过酶-半乳糖苷乙酰基转移酶酶forward大肠杆菌菌的RNA聚合合酶全酶由5种亚基基α2ββ’σ组组成，σ因子与与其它部部分的结结合不是是十分紧紧密，它它易于与与β’ββα2分离，没有σ、亚基的酶酶称为核核心酶———只催催化链的的延长，，对起始始无作用用。五种亚基基的功能能分别为为：α亚基：：与启动子子结合功功能。β亚基：含催化化部位，，起催化化作用，，催化形形成成磷酸二二酯键。。亚基：在在全酶中中存在，，功能不不清楚。。β’亚基基：与DNA模板板结合功功能。σ亚基：：识别起始始位点。。识别解链起始延伸终止1.起起始位点点的识别别σ识别正正确的启启动位点点，启动子的的结构至至少由三三部分组组成：-35序序列提供供了RNA聚合合酶全酶酶识别的的信号；；-10序列是是酶的紧紧密结合合位点（（富含AT碱基基，利于于双链打打开）；；第三部部分是RNA合合成的起起始点。。3’5’+1转录起始点AACTGTATATTATTGACATATAAT5’3’－35序列

Sextama框－10序列Pribnow框2.转转录起始始加入的第第一个核核苷三磷磷酸常是是GTP或ATP。所所形成的的启动子、、全酶和和核苷三三磷酸复复合物称称为三元元起始复复合物，第一个个核苷三三磷酸一一旦掺入入到转录录起始点点，σ亚基就会会被释放放脱离核核心酶。。-35-10pppG或pppA5‘5‘3‘3‘模板链E3.链的的延伸以NTP为原料料和能量量,DNA模板板链为模模板，靠核心酶酶的催化化，核苷酸间间通过3´,5´-磷磷酸二酯酯键成核核糖核酸酸链(RNA)4.转转录终止止转录终止信信号有两两种情况况弱终止子子：依赖ρ因子（（终止因因子，terminators）的终止NusA蛋白识识别DNA链上上的终止止信号，，在ρ因子帮帮助终止止。强终止子子：（1））在终终止点之之前具有有一段富富含G-C的回回文区域域。（2）富含含G-C的区域域之后是是一连串串的dA碱基序序列，它它们转录录的RNA链的的末端为为一连串串U（连连续6个个）。三、真核核生物的的转录作作用酶类分布产物活性分子量(KDa)反应条件ⅠⅡⅢ核仁核质核质rRNA（5.8S、18S、28S）mRNAtRNA、5SrRNA50～70％20～40％10％500～700～700低离子强度要求Mg2+或Mn2+高离子强度高Mn2+浓度1.真核核RNA聚合酶酶2.转转录真核RNA转录录基本过过程与原原核类似似，但其其产生的的mRNA为““单顺反反子”，，只编码码一条肽肽链。四、转录录过程的的选择性性抑制剂剂放线菌素D利福平α－鹅膏蕈碱原核抑制抑制不抑制真核抑制不抑制抑制RNA聚合酶Ⅱ五、转录录产物的的“加工工”（成成熟过程程）在细胞内内，由RNA聚聚合酶合合成的原原初转录录物（primarytranscript））往往需需要一系系列的变变化，包包括链的的裂解、、5和3末端的切切除和特特殊结构构的形成成、核苷苷的修饰饰、以及及拼接和和编辑等等过程，，才转变变为成熟熟的RNA分子子。此过过程总称称为RNA的的成熟或称为RNA的的转录后后加工。。原核生物物的mRNA转录录后一般般不需要要加工，，转录的的同时即即进行翻翻译（半半寿期短短）。rRNA前体的的转录后后加工tRNA前体的的加工真核mRNA前前体的加加工rRNA前体的的加工rRNA基基因之间间以纵向向串联的的方式重重复排列列。加工过程程：1、剪切切作用：：需核酸酸酶参与与。2、甲甲基化修修饰：修修饰在碱碱基上。。3、自我我剪接：：一种核核酶的作作用。原核rRNA加加工：rRNA含非转转录的间间隔区，，其产物物中含tRNA真核rRNA加加工：1.5S自成体体系加工工少无修修饰和剪剪接。2.45S加工中中含剪切切和甲基基化修饰饰，需核核酸酶。。大肠杆菌菌rRNA前体体加工真核生物物rRNA前体体加工tRNA前体的的加工tRNA前体在在tRNA剪切切酶的作作用下，，切成一一定在小小的tRNA分分子3’末端端加上CCA碱基的修修饰：甲甲基化、、脱氨和和还原作作用真核mRNA前前体的加加工剪接（Splicing）去除内含含子，连连接外显显子5’帽端端结构的的生成（（如图））3’端多多聚A（（polyA））的附加加六、RNA的复复制合成成（RNA指导导的RNA合成成）噬菌体Qβ的RNA复复制两阶阶段（1）其其单链RNA可可充当mRNA，利用用寄主中中的核糖糖体合成成外壳蛋白白和RNA复制酶酶的β亚亚基。（2）复复制酶的的β亚基基可与来来自寄主主细胞的的亚基ααδ自动装装配成RNA复复制酶，可进行行RNA的复制制，以分分子中单单链RNA为模模板（正正链），，复制出出一条新新的RNA链（（负链）），再复复制出正链，与外壳壳蛋白组组装成新新的噬菌菌体颗粒粒。某些RNA病毒毒可以以以自身RNA为为模板进进行复制制。不同的RNA病病毒复制制方式不不同5RNA-533RNA+释放释放353355RNA+RNA+RNA-RNA-及

RNA+的合成方向均为5‘3’核酶1982年Cech发发现四膜膜虫rRNA前前体自我我剪接作作用，RNA有有催化作作用;1983年发现现RNaseP中的的RNA可催化化tRNA前体体的加工工。核酶我切切割区内内有锤头头结构（hammer-headstructure），其中的结结构特点点是：（（1）三个个茎区形形成局部部的双链链结构；；其中含含13个个保守的的核苷酸酸，N代代表任何何核苷酸酸。（（2））图中的的箭头表表示自我我切割位位点，位位于GUX的X外侧，，X可表表示为C、U或或A，不不能是G。核酶的生生物学意意义1.RNA为生生物催化化剂，具具有重要要生物学学意义。。2.打破破了酶是是蛋白质质的传统统观念。。3.在生生命起源源问题上上，为先先有核酸酸提供了了依据。。4.为治治疗破坏坏有害基基因，肿肿瘤等疾疾病提供供手段。。七、基因因表达转转录调控控方式基因表达达调控概概述原核生物物以操纵纵子为单单元进行行表达和和调控，，特异的的阻遏蛋蛋白是控控制原核核启动序序列活性性的重要要因素。。乳糖操纵纵子的调调节机制制色氨酸操操纵子的的调节机机制I－调节节基因P－启动动子O－操作作子（操操作基因因）Z、Y、、A－三三种结构构基因阻遏蛋白白的负性性调节当无诱导导物乳糖糖存在时时，调节节基因编编码的阻阻遏蛋白白（repressorprotein）处于于活性状状态，阻阻止RNA聚合合酶与启启动基因因的结合合，则无无法启动动转录。。当有乳糖糖存在时时，lac操纵子（（元）即即可被诱诱导。乳乳糖进入入细胞，，经β－半乳乳糖苷酶酶催化，，转变为为半乳糖糖。后者者作为一一种诱导导剂分子子结合阻阻遏蛋白白，使蛋蛋白构象象变化，，导致阻阻遏蛋白白与O序序列解离离、转录录发生。。异丙基硫硫代半乳乳糖苷（（IPTG）是是一种作作用极强强的诱导导剂，不不被细菌菌代谢而而十分稳稳定，因因此被实实验室广广泛应用用。CAP（（代谢产产物活化化蛋白））的正性调节节当没有葡葡萄糖及及cAMP浓度度较高时时，cAMP与与CAP结合，，这时CAP结结合在lac启启动序列列附近的的CAP位点，，可刺激激RNA转录活活性。葡葡萄糖的的分解代代谢产物物能抑制制腺苷酸酸环化酶酶活性并并活化磷磷酸二酯酯酶，从从而降低低了cAMP的的浓度，，CAP不能被被活化形形成CAP－cAMP复合物物，则不不能转录录。lac阻阻遏蛋白白负性调调节与CAP正正性调节节两种机机制协调调合作：：当Lac阻遏遏蛋白封封闭转录录时，CAP对对该系统统不能发发挥作用用；但是是如果没没有CAP存在在来加强强转录活活性，即即使阻遏遏蛋白从从操纵序序列上解解聚仍几几无转录录活性。。lac操纵子强强的诱导导作用既既需要乳乳糖存在在又需缺缺乏葡萄萄糖。调节基因操纵基因结构基因mRNA酶蛋白调节基因操纵基因结构基因辅阻遏物trp阻遏蛋白原调节基因因编码的的阻遏蛋蛋白原不不与操作作基因结结合，结结构基因因转录。。Trp或或Trp－RNA与阻阻遏蛋白白结合，，使之构构象发生生变化与与操纵基基因结合合，结构构基因不不能表达达。阻遏遏物物调调节节机机制制衰减减子子调调节节机机制制衰减减子子：：在在转转录录水水平平上上调调节节基基因因表表达达的的衰衰减减作作用用，，用用于于终终止止和和减减弱弱转转录录，，这这种种调调节节的的作作用用部部位位叫叫衰衰减减子子————是是一一种种位位于于结结构构基基因因上上游游前前导导区区的的终终止止子子。。真核核基基因因的的调调控控⑤翻译调节（translationalcontrol）真核染色质体（DNA）①转录前调节转录初级产物RNA（Pro－RNA）hnRNA③转录后加工的调节（RNAProcessingcontrol）④转运调节（RNAtransportcontrol）mRNA⑥mRNA降解的调控mRNA降解物多肽链⑦翻译后加工及蛋白质活性控制（proteinactivitycontrol）活性蛋白失活蛋白②转录调节（transcriptioncontrol）顺式式作作用用元元件件(cisactingelements)真核核基基因因的的顺顺式式调调控控元元件件是是基基因因周周围围能能与与特特异异转转录录因因子子结结合合而而影影响响转转录录的的DNA序序列列。。其其中中主主要要是是起起正正性性调调控控作作用用的的顺顺式式作作用用元元件件，，包包括括启启动动子子(promoter)、、增增强强子子(enhancer)；；近近年年又又发发现现起起负负性性调调控控作作用用的的元元件件沉沉寂寂子子(silencer)。。1.启启动动子子（（Promoter））是指指RNA聚聚合合酶酶结结合合并并起起动动转转录录的的DNA序序列列。。真真核核启启动动子子一一般般包包括括转转录录起起始始点点及及其其上上游游约约100－－200bp序序列列，，包包含含有有若若干干具具有有独独立立功功能能的的DNA序序列列元元件件，，每每个个元元件件约约长长7－－30bp。。启动动子子中中的的元元件件可可以以分分为为两两种种：：①核核心心启启动动子子元元件件(corepromoterelement)指指RNA聚聚合合酶酶起起始始转转录录所所必必需需的的最最小小的的DNA序序列列，，包包括括转转录录起起始始点点及及其其上上游游－－25/－－30bp处处的的TATA盒盒。。核核心心元元件件单单独独起起作作用用时时只只能能确确定定转转录录起起始始位位点点和和产产生生基基础础水水平平的的转转录录。。②上上游游启启动动子子元元件件(upstreampromoterelement)包包括括通通常常位位于于－－70bp附附近近的的CAAT盒盒和和GC盒盒、、以以及及距距转转录录起起始始点点更更远远的的上上游游元元件件2.增增强强子子（（Ehancer））一种种能能够够提提高高转转录录效效率率的的顺顺式式调调控控元元件件，，通通常常占占100－－200bp长长度度，，也也和和启启动动子子一一样样由由若若干干组组件件构构成成，，基基本本核核心心组组件件常常为为8－－12bp，，可可以以单单拷拷贝贝或或多多拷拷贝贝串串连连形形式式存存在在。。增增强强子子的的作作用用有有以以下下特特点点：：①增增强强子子提提高高同同一一条条DNA链链上上基基因因转转录录效效率率，，可以以远远距距离离作作用用，通通常常可可距距离离1－－4kb、、个个别别情情况况下下离离开开所所调调控控的的基基因因30kb仍仍能能发发挥挥作作用用，，而而且且在在基基因因的的上上游游或或下下游游都都能能起起作作用用。②增增强强子子作作用用与与其其序序列列的的正正反反方方向向无无关关，将将增增强强子子方方向向倒倒置置依依然然能能起起作作用用。。而而将将启启动动子子倒倒就就不不能能起起作作