第二十章-高效液相色谱法-第四节课件

一、影响分离的因素factorsinfluencedseparation二、柱外展宽choiceofseparationtypes三、分离条件的选择choiceofHPLC第四节

影响分离的因素与操作条件的选择

factorsinfluencedseparationandchoiceofoperationcondition一、影响分离的因素第四节

影响分离的因素与操作条件的选择f1、塔板理论一、影响分离的因素

factorsinfluencedseparation1、塔板理论一、影响分离的因素

factorsinflu2、速率理论（与GC对比）

(1)2、速率理论（与GC对比）(1)2）涡流扩散项及其影响(2)讨论：

1）流动相流速对HPLC板高的影响（与GC对比）2）涡流扩散项及其影响(2)讨论：第二十章-高效液相色谱法-第四节课件第二十章-高效液相色谱法-第四节课件3）传质阻抗项及其影响3）传质阻抗项及其影响3、影响分离的因素(1)

3、影响分离的因素(1)(2)对流动相的要求：1）与固定液不反应2）对样品有良好溶解度

k=1~10k=2~5最理想的3）与检测器匹配：

UV（常用，测定波长应大于溶剂的截止波长）荧光，电化学4）使用粘度小、纯度高的流动相（甲醇，乙腈）使用前过滤、脱气(2)对流动相的要求：1）与固定液不反应(3)洗脱方式1）等度洗脱（恒组成溶剂洗脱）以固定配比的溶剂系统洗脱组分（一个泵）类似GC的等温度洗脱2）梯度洗脱：在一定分析周期内不断变换流动相的种类和比例即不断改变其极性（两个泵）适于分析极性差别较大的复杂组分类似GC的程序升温（沸程较长样品）(3)洗脱方式1）等度洗脱（恒组成溶剂洗脱）第二十章-高效液相色谱法-第四节课件二、柱外展宽柱外展宽：指从进样点到检测池之间除柱子本身以外的所有死体积引起的色谱峰展宽，柱效下降。柱前展宽：由进样引起减小进样器的死体积，进样到中心，可减小柱前谱带展宽，提高柱效柱后展宽：由接管、检测器流通池记检测器响应时间等因素引起。可用短而细的接管，减少流通池体积，改进检测器和记录系统的响应速度减少柱后展宽二、柱外展宽柱外展宽：指从进样点到检测池之间除柱子本身以外的1.影响分离的因素与提高柱效的途径

在高效液相色谱中,液体的扩散系数仅为气体的万分之一，则速率方程中的分子扩散项B/U较小，可忽略不计，即：

H=A+Cu故液相色谱H-u曲线与气相色谱的形状不同，如图所示。三、HPLC法中分离条件的选择1.影响分离的因素与提高柱效的途径三、HPLC法中分离条件液体的黏度比气体大一百倍，密度为气体的一千倍，故降低传质阻力是提高柱效主要途径。由速率方程，降低固定相粒度可提高柱效。液相色谱中，不可能通过增加柱温来改善传质。恒温改变淋洗液组成、极性是改善分离的最直接的因素。液体的黏度比气体大一百倍，密度为气体的一千倍，故降低

2.固定相及分离柱气相色谱中的固定液原则上都可以用于液相色谱，其选用原则与气相色谱一样。选粒径小的、分布均匀的球形固定相（dp≤10μm）首选化学键合相，匀浆法装柱但在高效液相色谱中，分离柱的制备是一项技术要求非常高的工作，一般很少自行制备。2.固定相及分离柱

3.流动相及其流速的选择选粘度小、低流速的流动相——甲醇流速大于0.5cm/s时,H～u曲线是一段斜率不大的直线。降低流速，柱效提高不是很大。但在实际操作中，流量仍是一个调整分离度和出峰时间的重要可选择参数。3.流动相及其流速的选择选粘度小、低流速的流动相——甲醇4.柱温的选择：

选室温250C左右柱温提高，可减少传质阻力，但分辨率降低。4.柱温的选择：分离类型选择

choiceofseparationtypes分离类型选择

choiceofseparationt一、影响分离的因素factorsinfluencedseparation二、柱外展宽choiceofseparationtypes三、分离条件的选择choiceofHPLC第四节

影响分离的因素与操作条件的选择

factorsinfluencedseparationandchoiceofoperationcondition一、影响分离的因素第四节

影响分离的因素与操作条件的选择f1、塔板理论一、影响分离的因素

factorsinfluencedseparation1、塔板理论一、影响分离的因素

factorsinflu2、速率理论（与GC对比）

(1)2、速率理论（与GC对比）(1)2）涡流扩散项及其影响(2)讨论：

1）流动相流速对HPLC板高的影响（与GC对比）2）涡流扩散项及其影响(2)讨论：第二十章-高效液相色谱法-第四节课件第二十章-高效液相色谱法-第四节课件3）传质阻抗项及其影响3）传质阻抗项及其影响3、影响分离的因素(1)

3、影响分离的因素(1)(2)对流动相的要求：1）与固定液不反应2）对样品有良好溶解度

k=1~10k=2~5最理想的3）与检测器匹配：

UV（常用，测定波长应大于溶剂的截止波长）荧光，电化学4）使用粘度小、纯度高的流动相（甲醇，乙腈）使用前过滤、脱气(2)对流动相的要求：1）与固定液不反应(3)洗脱方式1）等度洗脱（恒组成溶剂洗脱）以固定配比的溶剂系统洗脱组分（一个泵）类似GC的等温度洗脱2）梯度洗脱：在一定分析周期内不断变换流动相的种类和比例即不断改变其极性（两个泵）适于分析极性差别较大的复杂组分类似GC的程序升温（沸程较长样品）(3)洗脱方式1）等度洗脱（恒组成溶剂洗脱）第二十章-高效液相色谱法-第四节课件二、柱外展宽柱外展宽：指从进样点到检测池之间除柱子本身以外的所有死体积引起的色谱峰展宽，柱效下降。柱前展宽：由进样引起减小进样器的死体积，进样到中心，可减小柱前谱带展宽，提高柱效柱后展宽：由接管、检测器流通池记检测器响应时间等因素引起。可用短而细的接管，减少流通池体积，改进检测器和记录系统的响应速度减少柱后展宽二、柱外展宽柱外展宽：指从进样点到检测池之间除柱子本身以外的1.影响分离的因素与提高柱效的途径

在高效液相色谱中,液体的扩散系数仅为气体的万分之一，则速率方程中的分子扩散项B/U较小，可忽略不计，即：

H=A+Cu故液相色谱H-u曲线与气相色谱的形状不同，如图所示。三、HPLC法中分离条件的选择1.影响分离的因素与提高柱效的途径三、HPLC法中分离条件液体的黏度比气体大一百倍，密度为气体的一千倍，故降低传质阻力是提高柱效主要途径。由速率方程，降低固定相粒度可提高柱效。液相色谱中，不可能通过增加柱温来改善传质。恒温改变淋洗液组成、极性是改善分离的最直接的因素。液体的黏度比气体大一百倍，密度为气体的一千倍，故降低

2.固定相及分离柱气相色谱中的固定液原则上都可以用于液相色谱，其选用原则与气相色谱一样。选粒径小的、分布均匀的球形固定相（dp≤10μm）首选化学键合相，匀浆法装柱但在高效液相色谱中，分离柱的制备是一项技术要求非常高的工作，一般很少自行制备。2.固定相及分离柱

3.流动相及其流速的选择选粘度小、低流速的流动相——甲醇流速大于0.5cm/s时,H～u曲线是一段斜率不大的直线。降低流速，柱效提高不是很大。但在实际操