外源基因的表达

第七章外源基因的表达第一页，共四十九页，2022年，8月28日第一节外源基因在原核细胞中的表达1.原核生物基因表达的特点

与真核细胞相比，原核细胞的基因表达有以下特点：（1）原核生物只有一种RNA聚合酶（真核细胞有三种）识别原核细胞的启动子，催化所有RNA的合成。（2）原核生物的基因表达是以操纵子为单位的。（3）由于原核生物无核膜，所以转录与翻译是偶联的，也是连续进行的。（4）原核基因一般不含有内含子，在原核细胞中缺乏真核细胞的转录后加工系统。（5）原核生物基因的控制主要在转录水平，这种控制要比对第二页，共四十九页，2022年，8月28日基因产物的直接控制要慢。（6）在大肠杆菌mRNA的核糖体结合位点上，含有一个转译起始密码子及16S核糖体RNA3’末端碱基互补的序列，即S-D序列，而真核基因则缺乏此序列。2.原核表达系统的注意事项

从上述特点可以看出，欲将外源基因在原核细胞中表达，必须考虑表达载体、外源基因的性质、原核细胞的启动子和S-D序列、阅读框架及宿主菌调控系统等基本条件，也就是说必须满足以下条件：（1）通过表达载体将外源基因导入宿主菌，并指导宿主菌的酶系统合成外源蛋白。（2）外源基因不能带有内含子，因而必须用cDNA或化学合成第三页，共四十九页，2022年，8月28日的基因，而不能用基因组DNA。（3）必须利用原核细胞的强启动子和S-D序列等调控元件控制外源基的表达。（4）外源基因与表达载体连接后，必须形成正确的开放阅读框架。（5）利用宿主菌的调控系统，调节外源基因的表达，防止外源基因的表达产物对宿主菌的伤害。3.原核生物基因表达的调控序列

只有在了解了原核生物基因表达调控序列的基础上，才能够构建高效的表达载体，使外源目的基因在原核细胞中得到高效率、高水平地表达。对于原核细胞来讲，基因表达的调控序第四页，共四十九页，2022年，8月28日列主要涉及启动子、S-D序列、终止子、增强子、衰减子等序列。（1）启动子启动子(promoter)是DNA链上一段能与RNA聚合酶结合并能起始mRNA合成的序列，它是基因表达不可缺少的重要调控序列。没有启动子，基因就不能转录。原核生物的启动子是由两段彼此分开且高度保守的核苷酸序列组成。■-35区（TTGACA）：位于转录起始位点上游的-35bp附近，是RNA聚合酶初始识别和结合位点。■-10区（Pribnow框，TATAAT）：RNA聚合酶结合于此处导致DNA双链形成单链。第五页，共四十九页，2022年，8月28日原核表达系统中通常使用的可调控的强启动子有lac（乳糖启动子）、trp（色氨酸启动子）、PL及PR（λ噬菌体左向和右向启动子）、tac（乳糖和色氨酸的杂合启动子）等。（2）终止子在一个基因或一个操纵子的3’端往往有一个特定的核苷酸序列，它有终止转录的功能，这一段DNA序列称为终止子（terminator)。终止子在结构上有一些共同的特点，即有一段富含A/T的区域和一段富含G/C的区域，G/C区域具有回文对称结构，使转录后的RNA具有茎环结构。根据转录终止作用类型，终止子可分为两种：依赖于ρ因子的转录终止子及不依赖于ρ因子的转录终止子。第六页，共四十九页，2022年，8月28日（3）S-D序列S-D序列是位于起始密码子（AUG）上游3~10bp处的由3~9bp组成的序列。这段序列正好与16SrRNA3’端序列互补，是rRNA的识别和结合位点。S-D序列存在与否及S-D序列与起始密码子之间的距离，是影响mRNA翻译成蛋白质的主要因素之一。（4）增强子增强子（enhancer)是能够增强启动子转录活性的DNA顺式作用序列。第七页，共四十九页，2022年，8月28日4.几种类型的原核表达载体

在原核细胞中表达外源基因时，由于实验设计的不同，总的来说可以产生融合型和非融合型表达蛋白。不与细菌的任何蛋白或多肽融合在一起的表达蛋白称为非融合蛋白。融合蛋白指蛋白质的N末端由原核DNA序列或其它DNA序列编码，C端由真核DNA的完整序列编码。（1）非融合型表达蛋白载体pKK223-3具有一个强的tac（trp-lac）启动子，这个启动子是由trp启动子的-35区、lacUV5启动子的-10区、操纵基因及S-D序列组成。紧接着tac启动子的是一个取自pUC8的多位点接头，使之很容易把目的基因定位在启动子和S-D序列之后。第八页，共四十九页，2022年，8月28日在多位点下游的一段DNA序列中，还包含一个很强的rrnB核糖体RNA的转录终止子。载体的其余部分由pBR322组成。（2）分泌型克隆表达载体pINIII系统这个载体系统是由pBR322为基础构建的。带有大肠杆菌最强的启动子之一，即Ipp（脂蛋白基因）启动子。在启动子的下游装有lacUV5的启动子及其操纵基因，并把lac阻遏子的基因（lacI）也克隆到这个质粒上。这样目的基因的表达就成为可调节的了。在转录控制的下游再装上人工合成的高效翻译起始序列（S-D序列及ATG）。信号肽序列取自于大肠杆菌中分泌蛋白的基因ompa（外膜蛋白基因）。第九页，共四十九页，2022年，8月28日在编码序列的下游紧接着一段人工合成的多克隆位点片断，包括三个单一酶切位点，EcoRI、HindIII、BamHI。（3）融合蛋白表达载体pGEX系统载体的组成成分基本上与其它表达载体相似，含有启动子tac及lac操纵基因、S-D序列、lacI阻遏蛋白基因等。这类载体与其它表达载体不同之处在于S-D序列下游是谷胱甘肽巯基转移酶基因，而克隆的外源基因则与谷胱甘肽巯基转移酶基因相连。当进行基因表达时，表达产物为谷胱甘肽巯基转移酶和目的基因产物的融合蛋白。第十页，共四十九页，2022年，8月28日5.外源基因在大肠杆菌中的表达部位

（1）不同表达部位克隆在大肠杆菌中的外源基因，它们的编码产物蛋白质，有的是在细胞质中表达，有的是在细胞周质中表达，还有的则是以分泌到细胞外的方式表达。■细胞质中表达大肠杆菌细胞质中表达的外源蛋白，大多是以包含体的形式存在的。包含体是存在于细胞质中的一种由不溶性蛋白质聚集折叠而成的晶体结构。■周质中表达周质是指在大肠杆菌一类格兰氏阴性细菌中，位于内膜和外膜之间的细胞结构部分。周质中表达的蛋白需要在信号肽的引第十一页，共四十九页，2022年，8月28日导下才能穿越内膜，进入细胞周质。■细胞外表达表达的外源蛋白分泌到胞外培养基中，同样需要信号肽序列的引导。（2）不同部位表达外源蛋白的优缺点第十二页，共四十九页，2022年，8月28日表达部位优点缺点细胞质1、形成包涵体（a）蛋白质易于以高纯度和高浓度的方式分离（b）蛋白质受保护而免受胞内酶的降解作用（c）蛋白质没有活性，因此不会使寄主细胞受伤害2、蛋白质产量高3、表达的质粒载体构建比较简单1、形成包涵体（a）蛋白质折叠了，再折叠的蛋白质可能无法恢复其生物学活性（b）蛋白质的终产量偏低（c）蛋白质生产成本比较昂贵2、还原的环境不利于二硫键的形成3、由于N-末端存在甲硫氨酸，使蛋白质的真实性受到影响4、蛋白质会被降解5、蛋白质种类多，因此纯化比较复杂周质1、由于周质中蛋白种类比较少，因此目标蛋白质的纯化就比较简单2、蛋白质降解的程度不甚严重3、促进了二硫键的形成及蛋白质的折叠作用4、蛋白质的N-末端结构真实1、信号肽并非总是有助于蛋白质的转运2、有可能形成包涵体胞外1、蛋白质的降解作用程度最低2、由于分泌到胞外的蛋白质种类少，因此目标蛋白质容易纯化3、增进了蛋白质的折叠作用4、蛋白质的N-末端结构真实1、在大肠杆菌中表达的外源真核蛋白质，通常是不会分泌到胞外培养基中去的2、由于分泌在胞外培养基中的蛋白质相当稀释，因此目标蛋白质的纯化过程比较复杂表7.1不同部位表达外源蛋白的优缺点第十三页，共四十九页，2022年，8月28日6.影响外源基因表达效率的因素及提高表达水平常用的方法

（1）启动子结构对表达效率的影响原核生物启动子有两种保守序列，即-35区的TTGACA序列和-10区的TATAAT序列。研究发现，启动子的强度与一致序列的相似程度成正比。进一步的研究表明，-35和-10区的距离也是一个重要因素。如果间隔为17个碱基对，启动子表现很强，如果大于17个碱基对，启动子表现较弱。根据这些原理，Amann等克隆了tac启动子（lac-trp），促进了克隆基因的表达。（2）转译起始序列对表达效率的影响第十四页，共四十九页，2022年，8月28日S-D序列的保守性、S-D序列后面的4个碱基成分以及起始密码子AUG左侧的密码三联体的碱基组成都会影响到外源基因的表达效率。如：UAAGGAGG比GGAGG高3～6倍（表达水平)SD与AUG间富含AT有利于翻译AUG左侧的密码三联体为UAU或CUU时，转译最为有效；如果是UUC、UCA或AGG时，转译水平将下降20倍。（3）启动子同克隆基因间的距离对表达效率的影响启动子同克隆基因间的距离对表达效率的影响，主要是由于mRNA的5’末端形成不同的二级结构，从而影响mRNA的翻译效率。根据上述原理，要提高克隆基因的表达效率，可采用构建克第十五页，共四十九页，2022年，8月28日隆库的办法。在库中，将外源基因分别放置在离启动子远近不同的地方。转化后，筛选重组克隆，从中筛选出外源基因表达最强的克隆。（4）转录终止区对克隆基因表达效率的影响克隆基因的末端是否存在转录终止区也会影响到克隆基因的表达效率。其原因可能为：若干非必须的转录本的合成，会使细胞消耗巨大的能量用于制造大量非必须的蛋白质。在转录本上有可能出现一些不期望出现的二级结构，从而降低了转译的效率。偶尔会出现启动子阻塞现象。因此，在构建表达载体时，在克隆基因后面安装一个强转录第十六页，共四十九页，2022年，8月28日终止子（如rrnB终止子）对完全终止转录是必要的，可以阻止通读，增加基因表达。（5）质粒的拷贝数及稳定性对表达效率的影响由于细胞中的核糖体数量，与任何一种mRNA分子数目相比，都是大大超量的，因此，提高克隆基因表达效率的途径之一，是增加相应的mRNA分子数量。为此，须增加质粒的拷贝数及其稳定性。一般采用松弛型质粒构建外源基因的表达载体，从而达到增加质粒及外源基因拷贝数的目的。质粒载体中含有分配功能区par，能保证质粒分子在每次细胞周期中都能准确地进行分离，并均等地分配到子代细胞中去，从而达到稳定质粒拷贝数的作用。第十七页，共四十九页，2022年，8月28日（6）mRNA的稳定性对表达效率的影响原核生物的mRNA分子的降解速度很快，一般在几秒~几分之间。因此，维持外源基因mRNA的稳定性可提高其表达效率。一般的作法是给外源基因mRNA的5’及3’端安装某些结构序列，保护mRNA不能被降解。如：3’端茎环结构、转录终止子结构；E.coliompA转录物的5’非翻译部分可作为mRNA的稳定剂。（7）遗传密码子的使用对表达效率的影响无论是真核基因还是原核基因，一种特定的氨基酸并不是以等同的频率使用所有的同义密码子，而是使用其中的某一两种。我们将这种遗传密码子使用的非随机性现象，称为密码子使用偏爱性，简称密码子偏爱性。第十八页，共四十九页，2022年，8月28日选择和使用大肠杆菌偏爱密码子有利于增加外源基因在大肠杆菌中的翻译效率，从而提高外源基因的表达效率。（8）寄主细胞的生理状态对基因表达效率的影响大肠肝菌寄主细胞的生理状态，会或多或少地影响外源基因的表达效率，诸如：培养基营养成分的选择、细胞培养的方式，以及培养的温度和培养基中所溶解的氧的数量等环境参数。不过，有关处于不同生理状态下的大肠杆菌寄主细胞，究竟是怎样影响外源基因的细胞效率的，人们在这方面的知识还是相当贫乏的。第十九页，共四十九页，2022年，8月28日图7.1原核细胞的启动子序列

第二十页，共四十九页，2022年，8月28日图7.2原核基因转录的起始

第二十一页，共四十九页，2022年，8月28日图7.3原核基因终止子序列及其结构

第二十二页，共四十九页，2022年，8月28日图7.4非融合型表达蛋白载体pKK223-3第二十三页，共四十九页，2022年，8月28日图7.5分泌型克隆表达载体pINIII系统第二十四页，共四十九页，2022年，8月28日图7.6融合蛋白表达载体pGEX系统第二十五页，共四十九页，2022年，8月28日图7.74个天然启动子和两个人造启动子的-35区和-10区的碱基序列第二十六页，共四十九页，2022年，8月28日图7.8三个重组质粒的cromRNA二级结构第二十七页，共四十九页，2022年，8月28日图7.9改变Lac启动子和克隆基因间距离的一般方法第二十八页，共四十九页，2022年，8月28日第二节外源基因在真核细胞中的表达1.酵母表达系统

酵母（yeast）是一类以芽殖或裂殖进行无性繁殖的单细胞真核生物，是最理想的真核生物基因表达系统。（1）酵母表达系统的优点基因表达调控的机制比较清楚，遗传操作相对简便。具有原核生物所不具备的蛋白质翻译后的加工和修饰系统。可将外源基因表达产物分泌到培养基中。对人体和环境安全，不含毒素和特异性病毒。可进行大规模的发酵，工艺简单而成熟，成本低廉。第二十九页，共四十九页，2022年，8月28日（2）酵母基因表达载体酵母克隆和表达载体是由酵母野生型质粒、原核生物质粒载体上的功能基因（如抗性基因、复制子等）和宿主染色体DNA上的自主复制子结构（ARS）、中心粒序列（CEN）、端粒序列（LEL）等一起构建而成。酵母基因表达系统的载体一般是一种穿梭质粒，它既能够在原核细胞（大肠杆菌）中复制，又能在真核细胞（酵母）中复制。■DNA复制起始区a：大肠杆菌源质粒的复制起始序列：使其能在大肠杆菌中复制。b：酵母菌的天然2μ质粒的复制起始序列或酵母基因组中的自主复制序列，使其能在酵母菌中复制。第三十页，共四十九页，2022年，8月28日■选择标记基因a：营养缺陷型选择标记，宿主菌为相应的营养缺陷型。b：显性选择标记（G418等），可采用各种类型酵母细胞作为宿主细胞。■有丝分裂稳定区

来源于酵母染色体着丝粒（centromere）片断，能保证表达载体在酵母细胞分裂时，能平均地分配到子代细胞中去。■表达盒

表达盒是酵母表达载体的重要元件，包括启动子、分泌信号肽序列、多克隆位点及终止子序列。启动子：保证转录的起始。分泌信号肽序列：引导目的基因蛋白分泌到细胞外。第三十一页，共四十九页，2022年，8月28日多克隆位点：供外源基因插入。终止子：保证转录在适当位置停止。（3）酵母基因表达载体的种类■自主复制型质粒载体该质粒含有酵母基因组的DNA复制起始区、选择标记、基因克隆位点等关键元件。酵母基因组DNA复制起始区：能够在酵母细胞中自主复制。基因克隆位点：来源于大肠杆菌源质粒，如pBR322。这类载体的优点在于：在酵母细胞中的转化率高，每个细胞拷贝数可达200个缺点在于：由于缺乏酵母染色体着丝粒片断，在细胞分裂过程中不能均匀的分配到子细胞中去，因而经过多代培养后，子细第三十二页，共四十九页，2022年，8月28日胞中质粒载体的拷贝数迅速减少。■整合型质粒载体该质粒载体不含有酵母DNA复制起始区，不能在酵母中进行自主复制，但该质粒含有整合介导区，可以通过DNA的同源重组将外源基因整合到酵母染色体上，随染色体一起进行复制。■着丝粒型质粒载体该质粒载体是在自主复制型质粒载体的基础上构建而成的，增加了酵母染色体有丝分裂稳定序列元件（着丝粒），因而能保证质粒载体在细胞分裂时平均地分配到子细胞中去，同时提高了质粒在宿主细胞中的稳定性。■酵母人工染色体第三十三页，共四十九页，2022年，8月28日（4）酵母基因表达系统宿主菌目前，作为外源基因表达的宿主酵母菌主要包括：酿酒酵母、巴斯德毕赤酵母、乳酸克努维酵母和多形汉森酵母。（5）在酵母中高效表达外源基因的策略■提高表达载体在细胞中的拷贝数以多拷贝酵母内源性质粒为基础构建的多拷贝表达载体，是提高表达载体在酵母中拷贝数的一个途径。但以上的多拷贝载体在没有选择压力的情况下，可能难以保持其高拷贝数。将外源基因整合到染色体上可维持外源基因在细胞中的稳定性，然而在多数情况下会因为在细胞中的拷贝数较低而影响其表达。第三十四页，共四十九页，2022年，8月28日■提高外源基因的转录水平在构建表达载体时组入强启动子，如：酵母磷酸甘油酯激酶基因启动子、甘油醛磷酸脱氢酶基因启动子，可提高外源基因的转录水平。但外源基因表达的产物量过高也会对细胞形成伤害。■选择合适的受体细胞系统根据表达载体特性，选择合适的酵母受体系统。第三十五页，共四十九页，2022年，8月28日2.植物细胞基因表达系统

（1）植物基因表达载体的组成特性大多数植物基因表达载体是以Ti质粒为基础构建而成的，其组成包括启动子、T-DNA、终止子、内含子及选择标记基因和报告基因。■植物基因表达载体的启动子根据启动子的功能和作用方式，可分为组成型启动子、诱导型启动子和组织特异性启动子等几类。组成型启动子：外源基因的表达大体恒定在一定水平，在不同组织部位没有明显差异，没有时空特异性。一般采用花椰菜花叶病病毒（CaMV）35SRNA的启动子、Ti质粒的胭脂碱合成酶基因(nos)或章鱼碱合成酶基因(ocs)的启动子。第三十六页，共四十九页，2022年，8月28日诱导型启动子：在某些特定的物理或化学信号刺激下，可大幅度提高外源基因的转录水平。组织特异型启动子：外源基因只能在特定的组织细胞中表达。如：采用马铃薯块茎蛋白基因的启动子、花粉特异表达基因启动子等。■植物基因表达载体的终止子不同来源的终止子对外源基因的表达有很大影响，它不仅决定外源基因的转录活性，也决定mRNA在细胞中的稳定性，从而影响mRNA的翻译。研究表明，采用相同的启动子及外源基因，而采用不同的终止子序列，外源基因的表达水平有很大差异（差异可达60倍）。■T-DNA（transferDNA）第三十七页，共四十九页，2022年，8月28日可将外源基因连入T-DNA区域，随T-DNA随机整合进入植物细胞的染色体基因组中，从而使外源基因得到稳定维持和表达。但必须注意保留T-DNA序列的左右边界序列，因为左右边界序列是外源DNA转移和整合不可缺少的元件。■内含子序列研究表明，内含子与基因表达水平有很大关系。因而在构建植物基因表达载体时，可根据不同基因的类型，有选择性的插入内含子序列。■选择标记基因和报告基因选择标记基因和报告基因的作用在于筛选转化体，检测外源基因的转译水平。常用的选择标基因有新霉素磷酸转移酶基因、二氢叶酸还原酶基因、潮霉素磷酸转移酶基因等；报告基因有冠瘿碱基因、氯霉素乙酰转移酶基因等。第三十八页，共四十九页，2022年，8月28日（2）植物基因表达的受体系统植物基因表达的受体系统是指用于转化的植物细胞，主要包括以下五类：■愈伤组织再生系统它是外植体经脱分化培养、诱导愈伤组织并通过分化培养获得再生植株的受体系统。特点：易于接受外源基因，转化效率高；扩繁量大，可获得大量的转化植株；但获得的再生植株无性系变异较大；外源基因的稳定性差。■直接分化再生系统它是指外植体细胞不经脱分化阶段而直接分化出不定芽而获得再生株。第三十九页，共四十九页，2022年，8月28日特点：获得再生植株的周期短，细胞无性系变异小，能较好地保持受体细胞的遗传稳定性；但转化率相对较低，存在较多的嵌合株。■原生质体再生系统特点：转化率高，可形成基因型一致的细胞克隆；但原生质体培养周期较长、难度大、再生频率较低，在原生质体的培养过程中易造成变异。■胚状体再生系统它是指体细胞或单倍体细胞在组织培养条件下诱导成为形态结构和功能上类似于有性胚的胚状体，是一种最理想的转化受体系统。特点：转化率高；获得嵌合体少；可生产人工种子。第四十页，共四十九页，2022年，8月28日■生殖细胞受体系统以生殖细胞如花粉、卵细胞等作为基因转化的受体细胞，通过组织培养技术将生殖细胞诱导成为胚性细胞或愈伤组织，或直接利用花粉和卵子受精过程进行基因转化。特点：转化率高；易于获得稳定的遗传，并且通过加倍后成为纯合的二倍体。（3）提高外源基因在植物细胞中的表达效率的策略■构建高效表达的转化载体■防止外源基因失活■优化先导序列，提高翻译效率第四十一页，共四十九页，2022年，8月28日3.哺乳动物细胞基因表达系统

（1）哺乳动物基因表达载体的组成特性哺乳动物基因表达载体一般包括：■在哺乳动物细胞中进行基因转录的元件，即转录的启动子、终止子、poly(A)信号和内含子剪接信号。

启动子：主要来源于病毒，如：SV40的早期和晚期转录启动子、腺病毒晚期启动子等。也可选用某些真核基因的启动子，如：鼠细胞的金属硫蛋白基因启动子（可达到诱导表达的目的）等。

终止子和poly（A）：常用的poly（A）及终止子信号来自SV40。第四十二页，共四十九页，2022年，8月28日

内含子剪接信号：如果采用cDNA，没有内含子，因而也不需要相应的内含子序列。如果采用基因组DNA，需要内含子剪接信号将相应的内含子去除。剪接点之间的距离及剪接点周围的序列会影响到剪接效果。同时，基因中组入一个合适的内含子有时会提高外源基因的表达水平。■用于筛选转化子的选择标记基因

一般采用胸苷激酶基因（tk）、二氢叶酸还原酶基因、氨基糖苷磷酸转移酶基因等作为哺乳动物转化细胞的筛选标记基因。■在细菌中进行复制和筛选的元件使表达载体能够在原核细胞中进行大量复制，经筛选获得阳性克隆子，后者经大量培养可提取出大量含外源基因的表达载体，最后用于转化或转导哺乳动物受体细胞。第四十三页，共四十九页，2022年，8月28日■基因表达的调控元件

如：增强子可提高外源基因的转录