微生物基础知识及检测技术培训班讲义课件

微生物培训讲义

李磊微生物培训讲义

李磊1第一部分：基础理论第一部分：基础理论2一、食品中微生物的来源1.食品中微生物的八个主要来源：土壤、水——大肠杆菌、李斯特菌、弧菌、梭状芽孢杆菌等植物产品——不动杆菌、柠檬杆菌、肠杆菌、李斯特菌等器皿用具——芽孢杆菌、肠杆菌、肠球菌、嗜冷杆菌等动物肠道——弯曲杆菌、肠杆菌、埃希氏菌、沙门氏菌等生产者——金葡菌、欧文氏菌、微球菌、李斯特菌等畜及畜代谢物——梭状芽孢杆菌、乳球菌、明串珠菌等尘埃——产碱菌、芽孢杆菌、梭状芽孢杆菌、类芽孢杆菌等一、食品中微生物的来源1.食品中微生物的八个主要来源：3果蔬加工中有害微生物的污染源：

1.原料由于原料在收获贮藏和加工场所经常暴露于许多不卫生的环境中因此很有可能受到外部污染。2.污垢污染影响微生物数量的因素有风力、湿度、日光、温度以及饲养和野生的动物、灌溉用水、鸟兽粪、收割设备、工人等。3.空气污染4.害虫污染果蔬在生长过程中遭受到害虫的伤害部分易受到腐败菌和致病菌侵袭；部分传媒生物蜜蜂、蝴蝶、鸟类等携带的病菌也容易在害虫伤害部分生长。5.加工过程：分为人为原因和非人为原因6.贮藏和货架污染：贮藏的方式、温度湿度要求、外界环境、包装等果蔬加工中有害微生物的污染源：4二、影响微生物生长的内在和外在因素a)PH值：酸性具有很强的抑菌作用，当PH<2时多数微生物都不能生长;当PH<4.2时微生物可被抑制生长。大多数微生物生长的最适PH值是6.6～7.5,也有少数微生物在PH4.0以下也能够生长。常见的微生物及其生长的PH范围如图二、影响微生物生长的内在和外在因素a)PH值：5PH值对微生物生长的负面影响至少二方面：酶的作用细胞营养物质的输送其他环境因素也可与PH相互影响，如温度盐度b)含水量微生物对水分的要求通常用水分活度（Aw）来表示，水分活度是指食品中水的蒸气压和同温度下纯水的饱和蒸气压的比值---Aw=P/P0。纯水时Aw=1,完全无水时，Aw＝0,食品中结合水含量越高，水分活度就越低。PH值对微生物生长的负面影响至少二方面：6

主要微生物生长的最低水分活度（Aw）

主要微生物生长的最低水分活度（Aw）7c)温度一方面随着温度的上升，细胞中的生物化学反应速率和生长速率加快。在一般情况下，温度每升高10℃，生化反应速率增加一倍；另一方面，机体的重要组成如蛋白质、核酸等对温度都较敏感，随着温度的增高而可能遭受不可逆的破坏。因此，只有在一定范围内，机体的代谢活动与生长繁殖才随着温度的上升而增加，当温度上升到一定程度，开始对机体产生不利影响，如再继续升高，则细胞功能急剧下降以至死亡。根据微生物对温度要求的不同，微生物可分为嗜冷微生物（最适生长温度在20℃～30℃之间），嗜温微生物（最适生长温度在30℃～40℃之间），而在45℃或以上能够生长，最适温度在55℃～65℃之间的微生物称为嗜热微生物。c)温度8根据微生物的生长特性，在食品加工过程中，我们可用高温杀灭微生物或采用低温方式来抑制微生物，对易腐食品而言，操作间的温度要控制在14℃以下，长时间存放半成品、成品的库温控制在0～4℃之间，冷藏温度一般在-2～-15℃之间，冻藏温度在-18～-21℃之间。根据微生物的生长特性，在食品加工过程中，我们可用高温杀灭微生9d)环境中的气体及其浓度在CO2浓度达到10%以上的气体中贮藏食品称为“可控气体”贮藏或气调（MA）贮藏。CO2的抑菌作用也与温度有关，抑制能力的大小随温度的降低而增加。革兰氏阴性菌要比革兰氏阳性菌更加敏感，其中假单孢菌最为敏感，而乳酸菌和厌氧菌则最具抗性。e)微生物的一般干涉（微生物的竞争性生长）微生物的一般干涉是批在同一环境或栖息地中其他微生物对某种微生物产生的一般性的、非特异的抑制或破坏。干涉菌通常是不同源微生物引起的，常见的干涉现象有乳酸拮抗作用、杀细菌素、PH抑制、有机酸、过氧化氢、双乙酰抑制作用等。d)环境中的气体及其浓度1015℃条件下熟制禽肉中啤酒足球菌与胚芽乳杆菌对金黄色葡萄球菌的抑制作用C－纯培养，P-与啤酒足球菌共同培养，L-与胚芽乳杆菌共同培养，M-混合培养干涉作用的机理主要有1、对营养物的竞争;2、吸附或附着点位的竞争;3、提供不良环境;4、上述几个因素的加成。15℃条件下熟制禽肉中啤酒足球菌与胚芽乳杆菌对金黄色葡萄球菌11三、微生物的营养要素微生物生长所需要的元素主要以相应的有机物与无机物的形式提供的，也有小部分可以由分子态的气体物质提供。营养物质按照它们在机体中的生理作用不同，可以将它们区分成碳源、氮源、能源、生长因子、无机盐和水。1. 碳源在微生物生长过程中能为微生物提供碳素来源的物质称为碳源。碳源物质在细胞内经过一系列复杂的化学变化后成为微生物自身的细胞物质（如糖类、脂类、蛋白质等）和代谢产物，碳可占一般细菌细胞干重的一半。同时绝大部分碳源物质在细胞内生化反应过程中还能为机体提供维持生命活动所需的能源，因此碳源物质通常也是能源物质。三、微生物的营养要素微生物生长所需要的元素主要以相应的有机12微生物利用碳源物质具有选择性，糖类是一般微生物较容易利用的良好碳源和能源物质，但不同微生物对不同糖类物质的利用有其选择性。微生物利用的碳源物质主要有糖类、有机酸、醇、脂类、烃、CO2及碳酸盐等。2.氮源--凡是能被用来构成菌体物质中或代谢产物中氮素来源的营养物质称为氮源。氮对微生物的生长发育有重要的作用，它们主要用来合成细胞中的含氮物质，如蛋白质、核酸等。一般不作为能量。能被微生物利用的氮源物质包括蛋白质及其不同程度的降解产物（胨、肽、氨基酸等）、铵盐、硝酸盐、分子氮、嘌呤、嘧啶、脲、胺、酰胺、氰化物等。微生物利用碳源物质具有选择性，糖类是一般微生物较容易利用的良133．能源能为微生物的生命活动提供最初能量来源营养物或辐射能。化能异养微生物的能源就是碳源。所有真菌、放线菌和大部分细菌是化能异养型微生物。化能自养微生物的能源主要是无机物，如细菌、硝化细菌、硫细菌、氢细菌等。光能自养和异养微生物的能源主要是太阳能，如蓝细菌、紫色非硫细菌等。4．生长因子：通常指那些微生物生长所必需而且需要量很小，但微生物自身不能合成的或合成量不足以满足机体生长需要的有机化合物。各种微生物需求的生长因子的种类和数量是不同的。3．能源能为微生物的生命活动提供最初能量来源营养物或辐射14生长因子分为维生素、氨基酸及和嘌呤及嘧啶碱基三大类。5．无机盐：①参加微生物中氨基酸和酶的组成。②调节微生物的原生质胶体状态，维持细胞的渗透与平衡。③酶的激活剂。根据微生物对矿质元素需要量大小可以把它分成大量元素和微量元素。大量元素：Na、K、Mg、Ca、S、P等。微量元素是指那些在微生物生长过程中起重要作用，而机体对这些元素的需要量极其微小的元素，通常需要量在10-6--10-8mol/L：锌、锰、钠、氯、钼、硒、钴、铜、钨、镍、硼等。

生长因子分为维生素、氨基酸及和嘌呤及嘧啶碱基三大类。15微量元素一般参与酶的组成或使酶活化（见下表）6．水：①起到溶剂与运输介质的作用，营养物质的吸收与代谢产物的分泌必须以水为介质才能完成；②参与细胞内一系列化学反应；③维持蛋白质、核酸等生物大分子稳定的天然构象；④因为水的比热高，是热的良好导体，能有效地吸收代谢过程中产生的热并及时地将热迅速散发出体外，大而有效地控制细胞内温度的变化；⑤通过水合作用与脱水作用控制由多亚基组成的结构，如微管、鞭毛的组装与解离。微量元素一般参与酶的组成或使酶活化（见下表）6．水：①16对数期迟缓期分为四期：迟缓期、对数期、稳定期、衰退期细菌生长曲线0515202530105.56.08.58.07.57.06.59.0衰退期总菌数活菌数细菌数的对数次小时稳定期细菌生长繁殖的四个时期对数期迟缓期分为四期：迟缓期、对数期、稳定期、衰退17四、培养基的分类：1．按成分不同划分（1）天然培养基：常用的天然有机营养物质包括牛肉膏、蛋白胨、酵母浸膏、豆芽汁、玉米粉、牛奶等。（2）合成培养基：是人工添加化学成分完全了解的物质配制而成的培养基。2．根据物理状态划分（1）固体培养基在液体培养基中加入一定量凝固剂，使其成为固体状态即为固体培养基。培养基中的琼脂含量一般为1.5%-2.0%。在实验室中，固体培养基一般加入平皿或试管中，制成培养微生物的平板或斜面。固体培养基常用来进行微生物的分离、鉴定、活菌计数及菌种保藏。四、培养基的分类：1．按成分不同划分18（2）半固体培养基半固体培养基中凝固剂的含量少比固体培养基少，培养基中琼脂含量一般为0.2%-0.7%。半固体培养常用来观察微生物的运动特征、分类鉴定及噬菌体效价滴定等。（3）液体培养基液体培养基常用于大规模工业生产及在实验室进行微生物增菌、生化、传代等。3．按用途划分（1）基础培养基尽管不同微生物的营养需求不同，但大多数微生物所需的基本营养物质是相同的。基础培养基是含有一般微生物生长繁殖所需的基本营养物质的培养基。（2）半固体培养基半固体培养基中凝固剂的含量少比固体培养19（2）加富培养基也称为营养培养基、富集培养基，即在基础培养基中加入某些特殊营养物质制成的一类营养丰富的培养基。这些特殊营养物质包括血液、血清、酵母浸膏、动植物组织液等。（3）鉴别培养基用于鉴别不同类型微生物的培养基。在培养基加入某种特殊化学物质，某种微生物在培养基中生长后能产生某种代谢产物，而这咱代谢产物可以与培养基中的特殊化学物质发生特定的化学反应，产生明显的特征变化，根据这种特征性变化，可将该种微生物与其他微生物区别开来。（4）选择培养基用来将某种或某类微生物从混杂的微生物群体中分离出来的培养基。根据不同种类微生物的特殊营养需求或对某种化学物质的敏感不同，在培养基中加入相应的特殊营养物质或化学物质，抑制不需要的微生物的生长，有利于所需微生物的生长。（2）加富培养基也称为营养培养基、富集培养基，即在基础培20五、微生物基础实验技术（1）消毒与灭菌消毒：消灭病原菌和有害微生物的营养体灭菌：杀灭一切微生物的营养体，芽胞和孢子。灭菌方法：一、物理的方法：加热、过滤、辐射二、化学的方法：用化学试剂抑制或杀灭微生物。主要破坏细菌代谢机能。如重金属离子，磺胺类药物及抗生素等。五、微生物基础实验技术（1）消毒与灭菌21干热法：火焰灼烧灭菌和热空气灭菌。1、火焰灼烧适用于接种环、接种针和金属用具如镊子等，试管口和瓶口，涂布用玻璃棒。2、热空气灭菌利用高温干燥空气（160－170C）加热灭菌1－2h，适用于玻璃器皿和培养皿等。

灭菌原理：加热使蛋白质变性。灭菌效率与水的含量有关，当环境和细胞含水量越大，凝固越快。

注意事项：1）培养基、橡胶制品、塑料制品不能用此法；2）玻璃器皿不要与箱壁、箱底接触，以防暴裂；3）物品不能太挤；4）灭菌过程中不要开箱，灭菌结束后要等温度降至70°时再开箱门，防止器皿骤冷碎裂。干热法：火焰灼烧灭菌和热空气灭菌。22湿热法：1.原理：湿热灭菌作用要强于干热灭菌，主要因为水分有利于蛋白质的凝固，水分越多，凝固蛋白质所需的温度越低。另外，湿热灭菌的穿透性比干热强，因为水的比热（1.0）比空气的比热（0.24）要大，还由于蒸气在凝结时是一个放热过程，要增加额外的热量。所在灭菌效果好。湿热灭菌的方式：1.煮沸法；2.间歇灭菌法；3.巴氏灭菌法；4.高压蒸气灭菌法；5.超高温杀菌（135-150°C和2-8s对牛乳和其它液态食品）。湿热法：23高压蒸气灭菌法

适用范围：培养基、工作服、橡胶物品等、玻璃器皿。

注意的问题：1.冷空气的排放要彻底压力表读数蒸气温度0.07MPA1150.105MPA1210.210MPA132饱和蒸气压力与温度的对应关系但如果冷空气只排除50%，0.105MPA时，温度只能升至112度，为保证冷空气的彻底排除，要求灭菌器的密封性要好、排气管道通畅、排气时间充分。高压蒸气灭菌法压力表读数蒸气温度0.07MPA1150.10242.物品的包装要正确灭菌物品的包装材料要具有良好的通透性，并可防止各种微生物的进入。可采用的包装材料有双层细棉布、牛皮纸等。也可使用专门的容器。3.灭菌物品的摆放要合理灭菌物品间要留有间隙，空玻璃管要侧放或倒放。如有金属物品，要放置于底层。灭菌对培养基成分的影响：a.pH值普遍下降。b.产生混浊或沉淀，这主要是由于一些离子发生化学反应而产生混浊或沉淀。例如Ca2＋与PO43-化合，就会产生磷酸钙沉淀。c.不少培养基颜色加深。d.体积和浓度有所变化。e.营养成分有时受到破坏。部分添加物质（如受热易分解的抗生素）不能采用这种方法。2.物品的包装要正确25高压蒸汽灭菌效果的监测（一般性了解）生物法：（GB15981－1995）菌株选择：选用耐热的非致病性细菌芽胞作指示菌。一般选用嗜热脂肪杆菌，本菌芽胞对热的抗力较强，其热死亡时间与病原微生物中抗力最强的肉毒杆菌芽胞相似。检测时应使用标准试验包，每个包中心部位置生物指示剂2个，放在灭菌柜室的5个点，即上、中层的中央各一个点，下层的前、中、后各一个点。灭菌后，取出生物指示剂，接种于溴甲酚紫葡萄糖蛋白胨水培养基中，置55－60℃温箱中培养48小时至7天，观察最终结果。若培养后颜色未变，澄清透明，说明芽胞已被杀灭。达到了灭菌要求。若变为黄色混浊，说芽胞未被杀灭，灭菌失败。化学法：灭菌指导胶带、化学指示剂等。高压蒸汽灭菌效果的监测（一般性了解）26

（2）微生物的分离、纯化及培养技术分离与纯化：从混杂的微生物群体中获得只含某一种或某一株微生物的过程。纯培养的目的：纯化菌落，使其有唯一正确的生化、血清反应。

方法：点植、划线、倾注平板、涂布等

（2）微生物的分离、纯化及培养技术27保藏的菌种通过斜面、穿刺或疱肉培养基（用于厌氧细菌）培养好后，待其充分生长后，用牛皮纸将棉塞部分包扎好（棉塞换成胶塞效果更好），置4C˚冰箱中包藏。保藏时间：霉菌、放线菌及芽孢菌保存2－4个月移种一次，酵母菌间隔两个月，普通细菌一个月，假单胞菌两周传代一次。此法优点是操作简单、使用方便，缺点是保藏时间短、易被污染。附加石蜡：附加石蜡可延长菌种保藏时间。将无菌石蜡加在已长好菌的斜面上，其用量以高出斜面顶端1CM为准，使菌种与空气隔绝。霉菌、放线菌、芽孢菌可保藏两年以上，酵母菌可保藏1－2年，普通细菌也可保藏1年左右。1、传代培养法

（3）菌种保藏保藏的菌种通过斜面、穿刺或疱肉培养基（用于厌氧细菌）培养好后282、载体法使生长合适的微生物吸附在一定的载体上进行干燥。常用的载体有土壤、砂土、硅胶、明胶、麸皮、磁珠和滤纸片等。3、悬液法将细菌、酵母菌细胞悬浮在一定的溶液中保存。溶液包括蒸馏水、糖溶液、磷酸缓冲液、食盐水等。4、冷冻法使菌种始终存放在低温环境下的保藏方法。包括低温法和液氮法。5、真空干燥法这类方法包括冷冻真空干燥法和L－干燥法。冷冻真空干燥法是将要保藏的微生物样品先经低温预冻，然后在低温状态下进行减压干燥。L-干燥法则不需要低温预冻样品，只是使样品维持在10－20C˚范围内进行真空干燥。2、载体法29（4）染色：

1、革兰氏复染色法所用试剂：结晶紫、乙醇脱色剂、碘液媒染剂、沙黄（蕃红花红）原理：细菌基于细胞壁多糖结构的不同吸附电荷的能力不同。步骤：固定→结晶紫(60S)→碘液媒染（60S）→乙醇脱色（30S）→沙黄复染（60S）→镜检（4）染色：

1、革兰氏复染色法302、芽孢染色：芽孢染色法是利用细菌的芽孢和菌体对染料的亲合力不同的原理，用不同染料进行着色，使芽孢和菌体呈不同的颜色而便于区别。通常可用孔雀绿或碱性品红对菌体和芽孢进行染色。水洗使菌体脱色，再用复染液沙黄等进行菌体着色。2、芽孢染色：313、荚膜染色由于荚膜与染料间的亲和力弱，不易着色，通常采用负染色法染荚膜，即设法使菌体和背景着色而荚膜不着色，从而使荚膜在菌体周围呈一透明圈。由于荚膜的含水量在90%以上，故染色时一般不加热固定，以免荚膜皱缩变形。3、荚膜染色32

1.一般质量检查生产厂必须提供的文件：—培养基名称、各种成分名称和增补剂名称以及产品编号；—培养基使用前的pH；—储藏条件和有效期；—所有性能评价和所用的测试菌种；—技术数据清单；—质控证书；—必要的安全及危害数据。2.实验室检查项目：—培养基的名称和批号；—接收日期；—有效期；—包装的情况和完整性验收记录应包括上述信息。（5）培养基的验收与制备1.一般质量检查（5）培养基的验收与制备333.培养基的使用前应进行的实验室测试：包括：PH值、色泽、透明度、杂质、稳定性、湿度。根据培养基批号的不同，同批培养基还要进行相应的菌株测试，测试菌株必须是来自标准菌种保藏中心或其认可的机构如(ATCC)等提供的标准测试菌株，菌株必须在其活性有效期限内，最好采用非特异性菌株以保证生化反应的正常进行。如有必要或条件许可，可同时接种一两种干扰菌株作空白对照。测试菌株在所用培养基上至少可分离出一株活菌。不能分离出活性菌株或分离过程中产生其它非正常菌株的培养基视为不合格产品。《培养基验收记录》3.培养基的使用前应进行的实验室测试：34例子：以EMB平板验收为例此培养基呈紫色，可有细微沉淀。接种质控菌株后，35℃培养18～24小时，观察结果应如下表所示：例子：以EMB平板验收为例此培养基呈紫色，可有细微沉淀。接种354、培养基的制备记录培养基在每次时要保有记录，记录内容包括：培养基名称批号及其来源最终pH值消毒的温度和制备时间、日期制备者记录应随制好的培养基一同存放4、培养基的制备记录365、培养基的异常现象和可能原因培养基不能凝固：—制备过程中过度加热—低pH值造成培养基发生酸水解—称量不正确—琼脂未完全溶解—培养基成分未充分混匀pH值不正确：—制备过程中过度加热—水质不佳—外部化学物质污染—测Ph值时温度不正确—pH计未正确校准5、培养基的异常现象和可能原因37颜色异常：—制备过程中加热过度—水质不佳—脱水培养基质量差—外部化学物质污染pH不正确产生沉淀：—制备过程中过度加热—水质不佳—脱水培养基质量差—pH值未正确控制培养基出现抑制/重复性差：—制备过程中过度加热—水质不佳—脱水培养基质量差—使用成分不正确，如成分称量不准、添加物浓度不正确颜色异常：38选择性差：—制备过程中过度加热—配方使用不对—脱水培养基质量差—添加成分不正确，如加入成分时培养基过热或错误的添加浓度。选择性差：39第二部分：检测标准第二部分：检测标准40一、细菌总数1.细菌总数测定的注意事项1）细菌总数反映的30－35度有氧条件下培养的细菌。一些特殊要求的细菌、厌氧菌、微需氧菌、非嗜中温菌等，均难以反映出来。实验中可能出现某项菌如单增李氏菌计数多于细菌总数的现象。2）蔓延菌落的判断3）鉴于细菌细胞以单个、双个、链状、葡萄状或成堆的形式存在，因此在平板上出现的菌落可能来源于单个细菌也可能来自细菌菌群，故细菌总数的单位通常以CFU加重量单位来表示。4）细菌总数应做空白对照。空白样品板暴露时间应与样品板暴露时间相同。空白板可采用稀释液+琼脂35度培养也可采用样品液+琼脂4度放置不培养对照法一、细菌总数1.细菌总数测定的注意事项41细菌形态细菌形态42细菌形态细菌形态43琼脂平板上菌群的形态蜡样芽孢杆菌菌落枯草芽孢杆菌菌落琼脂平板上菌群的形态蜡样芽孢杆菌菌落枯草芽孢杆菌菌落44二、大肠菌群、粪大肠菌群、大肠杆菌1.什么是大肠菌群：大肠菌群并非细菌学分类命名，而是卫生细菌领域的用语，它不代表某一个或某一属细菌，而指的是具有某些特性的一组与粪便污染有关的细菌，这些细菌在生化及血清学方面并非完全一致，其定义为：需氧及兼性厌氧、在37℃能分解乳糖产酸产气的革兰氏阴性无芽胞杆菌。一般认为该菌群细菌可包括大肠埃希氏菌、柠檬酸杆菌、产气克雷伯氏菌和阴沟肠杆菌等。大肠菌群与其它肠杆菌、肠球菌的生活环境类似，因此它是检验粪便污染的指标菌。粪便污染指标菌的要求1.特异性：即是人与动物肠道的特有菌。2.对环境耐受力强，对营养要求不高。3.繁殖周期短，可以在短时期内大量培养。4.检测方法可靠。5.检测成本及技术要求低。指标菌二、大肠菌群、粪大肠菌群、大肠杆菌1.什么是大肠菌群：粪便污452、大肠杆菌大肠埃希氏菌(E.coli)通常称为大肠杆菌，是Escherich在1885年发现的。根据不同的生物学特性将致病性大肠杆菌分为5类：致病性大肠杆菌(EPEC)、肠产毒性大肠杆菌(ETEC)、肠侵袭性大肠杆菌(EIEC)、肠出血性大肠杆菌(E．I"IEC)、肠黏附性大肠杆菌(EAEC)。大肠杆菌电镜图大肠杆菌为革兰氏阴性短杆菌，大小0.5×1～3微米。周身有鞭毛，能运动，无芽孢。可发酵多种糖类产酸、产气。2、大肠杆菌大肠杆菌电镜图大肠杆菌为革兰氏阴性短杆46大肠杆菌的抗原成分复杂，可分为菌体抗原（O）：化学成分——多糖-磷脂-蛋白质复合物。可在121℃耐受2h。不被乙醇或0.1%石炭酸破坏。每个菌株只含有一种O抗原，决定o型原特异性的是脂多糖中的多糖侧链部分，通常以1、2、3等阿拉伯数字表示。例如：乙型副伤寒杆菌有4、5、12三个O抗原。鼠伤寒杆菌有1、4、5、12四个O抗原；猪霍乱杆菌有6、7二个O抗原。根据菌体抗原的不同，可将大肠杆菌分为150多型，其中有16个血清型为致病性大肠杆菌，常引起流行性婴儿腹泄和成人肋膜炎。大肠杆菌的抗原成分复杂，可分为47鞭毛抗原（H）

鞭毛抗原的组成部分为蛋白质，1个菌株仅有1种H抗原，不耐热，60℃加热15分钟或乙醇处理可破坏。加热至80℃时出现蛋白变性反应。具有鞭毛的细菌经甲醇液固定后，其o抗原全部被h抗原遮盖，而不能与相应抗o抗体反应。h抗原的特异性取决于多肽链上氨基酸的排列顺序和空间构型。表面抗原（K）即荚膜抗原；个别位于菌毛中。不耐热，后者有抗机体吞噬和抗补体的能力。

O不凝集性：具有K抗原的菌株不会被其相应的抗O血清凝集

鞭毛抗原（H）48大肠菌群检验中常用的抑菌剂有胆盐、十二烷基硫酸钠、苯磺酸钠、煌绿、龙胆紫、孔雀绿等大肠杆菌对热的抵抗力较其他肠道杆菌强，55℃经60分钟或60℃加热15分钟仍有部分细菌存活。在自然界的水中可存活数周至数月，在温度较低的粪便中存活更久。最适生长温度37℃,PH7.4-7.6，普通培养基上生长良好，菌落特征为圆形，直径2－3mm,凸起、光滑、湿润、半透明、灰白色。某些菌株有β溶血现象。伊红美蓝平板上为蓝紫色，中国蓝琼脂为蓝色、SS琼脂上为红色。营养肉汤生长均匀。大肠菌群检验中常用的抑菌剂有胆盐、十二烷基硫酸钠、苯磺酸钠49SN0169大肠菌群、粪大肠菌群、大肠杆菌检测方法样品液LST增菌液，37℃,48hBGLB,37℃,48hEC，44.5℃产气大肠菌群粪大肠菌群色氨酸甲基红VP柠檬酸盐伊红美蓝平板营养琼脂斜面大肠杆菌产气SN0169大肠菌群、粪大肠菌群、大肠杆菌检测方法样品液LS50伊红美蓝平板上的大肠杆菌普通大肠杆菌与O157的荧光试验O157不发酵山梨醇伊红美蓝平板上的大肠杆菌普通大肠杆菌与O157的荧光试验51细菌在葡萄糖蛋白胨水培养基中能分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸脱羧成乙酰甲基甲醇，在强碱环境下，被空气中氧氧化为二乙酰，二乙酰与蛋白胨中的胍基生成红色化合物，称V－P反应V－P试验细菌在葡萄糖蛋白胨水培养基中能分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸脱52肠杆菌属分解葡萄糖过程中产生丙酮酸，进一步分解后，可产生乳酸，琥珀酸、醋酸、甲酸等大量酸性产物，可使培养基PH值下降至pH4.5以下，使甲基红指示剂变红。甲基红（MethylRed）试验肠杆菌属分解葡萄糖过程中产生丙酮酸，进一步分解后，可产生乳酸53靛基质（Imdole）试验靛基质试验也称色氨酸或吲哚试验。某些细菌能分解蛋白胨中的色氨酸，生成靛基质，进一步脱水生成吲哚。吲哚与显色剂——对二甲基氨基苯醛结合，形成玫瑰吲哚，为红色化合物。靛基质（Imdole）试验靛基质试验也称色氨酸或吲哚试54西蒙氏枸椽酸盐试验某些细菌能利用枸椽酸盐作为碳源，及磷酸铵作为氮源，将枸椽酸盐分解为二氧化碳，培养基反应后成碱性，由于指示剂的作用，培养基变为兰色。西蒙氏枸椽酸盐试验某些细菌能利用枸椽酸盐作为碳源，及磷酸铵作55三、沙门氏菌沙门氏菌属于肠杆菌科，有2300多个血清型。肠道沙门氏肠炎亚种有三种血清型（猪霍乱、甲型副伤寒和伤寒沙门氏菌）可导致严重病症，其它血清型大多引起肠胃炎，表现轻微。沙门氏菌为革兰氏阴性杆菌，需氧或兼性厌氧，最适生长温度为35～37℃，最适pH值为6.8～7.8。鸡白痢、鸡伤寒、羊流产和甲型副伤寒等沙门氏菌在普通琼脂不易生长，血清、葡萄糖、硫代硫酸钠、胱氨酸、脑心浸液和甘油等有助于本菌生长。麦康凯上，大多形成无色菌落（不发酵乳糖）；SS平板上，形成黑色菌落。除鸡白痢和鸡伤寒沙门氏菌外，其余各菌：周生鞭毛，绝大多数具有菌毛。三、沙门氏菌沙门氏菌属于肠杆菌科，有2300多个血清型。56沙门氏菌不分解乳糖（亚利桑那菌除外）。分解葡萄糖产酸产气（伤寒沙门氏菌产酸不产气）。多数产生H2S，不产生靛基质，不液化明胶，不分解尿素，不产生乙酰甲基甲醇，多数能利用枸橼酸盐，能还原硝酸盐为亚硝酸盐，在氰化钾培养基上不生长。本菌属有S-R变异。名词解释：S-R变异细菌菌落可归纳为两种类型：光滑型（SMOOTH.S）与粗糙型（ROUGH，R）。S型菌落一般表面光滑、湿润，边缘整齐；R型菌落表面粗糙，干而有皱纹，边缘不整齐。当细菌从S→R时，其毒力、抗原性往往发生全面的改变。沙门氏菌不分解乳糖（亚利桑那菌除外）。分解葡萄糖产酸产气（伤57光滑型与粗糙型细菌特性的比较*某些致病菌如炭疽、鼠疫杆菌与化脓性链球菌的毒力菌株为R型。光滑型与粗糙型细菌特性的比较*某些致病菌如炭疽、鼠疫杆菌与化58沙门氏菌属（包括亚利桑那菌）检验方法

SN0170样品缓冲胨水（BPW）四硫磺酸盐煌绿（TTB）亚硒酸盐胱氨酸（SC）37℃4hor20～24h直接选择性增菌亚硒酸盐胱氨酸（SC）四硫磺酸盐煌绿（TTB）37℃24±2h

BS&DHL(亚利桑那菌琼脂)

前增菌37℃24～48hTSI&赖氨酸脱羧酶TSI&尿素酶37℃24～48h生化试验血清学试验（“O”抗原，“Vi”抗原）42℃20±2h37℃24～48h结果判定沙门氏菌属（包括亚利桑那菌）检验方法

SN0170样品缓冲59样品（20类）25g225mL乳糖肉汤（LB）or胰酪胨大豆肉汤（TSB）or煌绿溶液（BG）or通用前增菌肉汤（UPB）or营养肉汤（NB）or再造脱脂奶粉or四硫酸盐煌绿（TT）pH6.8±0.224±2h35℃RVTT

43±0.2℃or35±2.0℃24±2h

24±2h42±0.2℃BS&XLD&HE24±2h35℃TSI&LIA非沙门氏菌沙门氏菌非沙门氏菌LIA+LIA－TSIK/ALIA－TSIA/A&尿素酶，H抗原（多价H抗血清或Spicer-Edwardsflagellar(H)test），赖氨酸脱羧酶，酚红卫矛醇肉汤，色氨酸肉汤（KCN，丙二酸盐，吲哚），O抗原酚红乳糖肉汤，酚红蔗糖肉汤，MR－VP,西蒙氏柠檬酸盐5种商业生化鉴定系统（API20E,EnterotubeII,

EnterobacteriaceaeII,MICRO-ID,orVitekGNI）&O抗原&H抗原沙门氏菌属FDA检验方法

（BAM）细菌学分析手册样品（20类）25g225mL乳糖肉汤（LB6025g样品225mLBPW35℃or37℃16~20h0.1mL+10mLRV10mL+100mLSC42℃24h35℃or37℃24h&48h酚红煌绿琼脂（亮绿琼脂）&第二种选择性平板phenolred/brilliantgreenagar国际标准或实验室方法35℃or37℃20~24h无典型菌落再培养18～24h典型菌落（pinkred）营养琼脂纯化可疑菌落每个平板选5个菌落35℃or37℃18~24hTSI，尿素酶，赖氨酸脱羧酶，ONPG，VP，吲哚血清学试验（O抗原，Vi抗原，H抗原）报告结果送参考实验室分型ISO6579:200225g样品225mLBPW35℃or37℃16~61沙门氏菌的生化试验三糖铁TSI尿素酶试验右为阳性（红）左为阴性对照（黄）沙门氏菌的生化试验三糖铁尿素酶试验62赖氨酸脱羧酶试验从左往右依次为对照、阳性（紫）、阴性（黄）丙二酸盐试验左侧为阳性（兰）右为阴性对照（绿）赖氨酸脱羧酶试验丙二酸盐试验63ONPG试验左为阳性（黄）右为空白对照ONPG试验64沙门氏菌的血清学试验O抗原：沙门氏菌根据O抗原的共同性可分为a～z、o51～o63、o65～o67等42组。使人类致病的沙门氏杆菌大多属于a～e组。H抗原：沙门氏杆菌的h抗原有两种，称为第1相和第2相。第1相特异性高，又称特异相，用a、b、c等表示，第2相特异性低，为数种沙门氏杆菌所共有，也称非特异相，用1、2、3等表示。具有第1相和第2相h抗原的细菌称为双相菌，仅有一相者称单相菌。每一组沙门氏杆菌根据h抗原不同，可进一步分种或型。vi抗原因与毒力有关而命名为vi抗原。由聚-n-乙酰-d-半乳糖胺糖醛酸组成。不稳定，经60℃加热、石碳酸处理或人工传代培养易破坏或丢失。新从患者标本中分离出的伤寒杆菌、丙型副伤寒杆菌等有此抗原。沙门氏菌的血清学试验O抗原：65左侧凝集，右侧为阴性对照左侧凝集，右侧为阴性对照66四、金黄色葡萄球菌典型的金黄色葡萄球菌为球型，直径0.8μm左右，显微镜下排列成葡萄串状。无芽胞、鞭毛，多数无荚膜，革兰氏染色阳性。金黄色葡萄球菌营养要求不高，在普通培养基上生长良好，需氧或兼性厌氧，最适生长温度37°C，最适生长pH7.4。血平板菌落周围形成透明的溶血环。金黄色葡萄球菌有高度的耐盐性，可在10~20%NaCl肉汤中生长。可分解葡萄糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖，产酸不产气。甲基红反应阳性，VP反应弱阳性。许多菌株可分解精氨酸，水解尿素，还原硝酸盐，液化明胶。金黄色葡萄球菌具有较强的抵抗力，对磺胺类药物敏感性低，但对青霉素、红霉素等高度敏感。四、金黄色葡萄球菌典型的金黄色葡萄球菌为球型，直径0.8μm67金黄色葡萄球检测标准SN0172样品10%NaCl胰蛋白胨大豆肉汤37℃,48hBaird-Parker琼脂37℃,48h营养肉汤37℃,24h兔血浆凝固酶（6h)金黄色葡萄球检测标准SN0172样品10%NaCl胰蛋白胨大68

（1）α-溶血：菌落周围有1-2mm宽的草绿色溶血环，也称甲型溶血

（2）β-溶血：菌落周围形成一个2-4mm宽、界限分明、完全透明的无色溶血环

（3）γ-溶血：不产生溶血素，菌落周围无溶血环，也称为丙型

α溶血β-溶血

（1）α-溶血：菌落周围有1-2mm宽的草绿色溶69Baird-Parker琼脂：该琼脂含卵黄和亚碲酸盐，金黄色葡萄球菌可还原亚碲酸盐，产生黑色菌落，可与其他凝固酶阳性的葡萄球菌区分。Baird-Parker琼脂另外一个鉴别特征是金葡菌有产生卵磷脂酶的能力，在培养基上产生卵黄清除反应，但需要注意的是包括部分凝固酶阳性的菌株在内的金葡菌也可能卵磷脂酶为阴性。Baird-Parker琼脂：70凝固酶试验的判断证实实验：耐热核酸酶试验（甲苯胺蓝试验）

对于凝固酶试验不确定的，要做耐热核酸酶试验，耐热核酸酶试验，凝固酶试验，B－P生化试验有二个以上符合者为金黄色葡萄球菌阳性典型菌→15MLBHL肉汤中35-37度培养18-24h,加热煮沸15分钟取10μl接种到甲苯胺蓝琼脂玻片的小孔中，在潮湿的培养箱35-37度培养4小时阳性菌产生明亮的粉红色晕圈，延伸至小孔外围至少1mm凝固酶试验的判断证实实验：典型菌→15MLBHL肉汤中加热煮71五、单增李斯特菌单增李斯特氏菌广泛存在于自然界中，不易被冻融，能耐受较高的渗透压，在土壤、地表水、污水、废水、植物、青储饲料、烂菜中均有该菌存在，所以动物很容易食入该菌，并通过口腔-粪便的途径进行传播。健康人粪便中单增李氏菌的携带率为0.6-16%,有70%的人可短期带菌，4-8%的水产品、5-10%的奶及其产品、30%以上的肉制品及15%以上的家禽均被该菌污染。人主要通过食入软奶酪、未充分加热的鸡肉、未再次加热的热狗、鲜牛奶、巴氏消毒奶、冰激凌、生牛排、羊排、卷心菜色拉、芹菜、西红柿、法式馅饼、冻猪舌等而感染，约占85-90%的病例是由被污染的食品引起的。1979年单增的致病性首次为人们发现。单增是仅次于沙门氏菌的细菌污染物。五、单增李斯特菌单增李斯特氏菌广泛存在于自然界中，不易被冻72李斯特菌属共有七个种属：1、单核细胞增生李斯特菌(L.monocytohenes)2、绵羊李斯特菌(L.iuanuii)3、英诺克李斯特菌(L.innocua)4、威尔斯李斯特菌(L.innocua)5、西尔李斯特菌(L.seeligeri)6、格氏李斯特菌(L.grayi)7、默氏李斯特菌(L.murrayi)其中单增李斯特菌是唯一能引起人类疾病的。单核细胞增生李斯特氏菌是一种人畜共患病的病原菌。它能引起人、畜的李氏特菌病，感染后主要表现为败血症、脑膜炎和单核细胞增多。李斯特菌属共有七个种属：73单增李斯特菌是一种革兰氏阳性短杆菌，大小约为0.5μmх1.0-2.0μm,直或稍弯，两端钝圆，常呈V字型排列，偶有球状、双球状。兼性厌氧、无芽胞，一般不形成荚膜，但在营养丰富的环境中可形成荚膜，在陈旧培养中的菌体可呈丝状及革兰氏阴性。该菌有4根周毛和1根端毛，但周毛易脱落。单增营养要求不高，在20--25℃培养有动力，穿刺培养2－5天可见倒立伞状生长，肉汤培养物在显微镜下可见翻跟斗运动。该菌的生长范围为2--42℃（也有报道在0℃能缓慢生长），最适培养温度为35--37℃，在pH中性至弱碱性（pH9.6）生长良好，在pH3.8－4.4能缓慢生长，在6.5%NaCl肉汤中生长良好。单增无芽孢，适于低氧生长，对普通消毒剂、高温和乳链菌肽类抗菌剂敏感，其在常温下，生长能力竞争不过大肠菌群等正常菌群。单增李斯特菌是一种革兰氏阳性短杆菌，大小约为0.5μmх1.74典型生化特征包括：触酶阳性、氧化酶阴性、V－P阳性、水解七叶苷、发酵鼠李糖、葡萄糖、乳糖、水杨素、麦芽糖，不发酵木糖和甘露醇、肌醇、阿拉伯糖、侧金盏花醇、棉子糖、卫矛醇和纤维二糖。40%胆汁不溶解，吲哚、硫化氢、尿素、明胶液化、硝酸盐还原、赖氨酸、鸟氨酸均阴性，VP、甲基红试验和精氨酸水解阳性。血清型根据菌体（O）抗原和鞭毛(H)抗原，将单增李氏菌分成13个血清型，分别是1/2a、1/2b、1/2c、3a、3b、3c、4a、4b、4ab、4c、4d、4e和“7”13个血清型。致病菌株的血清型一般为1/2b、1/2c、3a、3b、3c、4a、1/2a和4b,后两型尤多。溶血：单增李斯特为β溶血，溶血环小于绵羊李斯特菌。

典型生化特征包括：75检样前增菌方法直接增菌方法消毒乳、乳制品、水产品等加工制品，25g样品加225mlhalfFraser肉汤生乳等未加工样品，25g样品加225mlEB肉汤1ml接种到10mlFraser肉汤OXA、PALCAM平板挑取可疑菌落，接种TSA-YETSB-YE蓝色菌落检验典型运动检验过氧化氢酶检验革兰氏菌染色溶血试验动力试验生化试验CAMP试验血清学试验小鼠毒力试验尿素酶水解，硝酸盐还原，MR-VP，TSI，葡萄糖，甘露醇，麦芽糖，鼠李糖，七叶苷、木糖报告结果检样前增菌方法直接增菌方法消毒乳、乳制品、水产品等加工制品，76微生物基础知识及检测技术培训班讲义课件77微生物基础知识及检测技术培训班讲义课件78糖酵解试验葡萄糖：左为阳性，右为阴性对照麦芽糖：左为阳性，右为阴性对照单增不发酵甘露醇糖酵解试验葡萄糖：左为阳性，右为阴性对照麦芽糖：左为阳性，右79单增发酵鼠李糖：左为阳性单增木糖实验，右为对照七叶苷试验，李斯特菌属都发酵七叶苷硝酸盐还原试验，左为阴性单增发酵鼠李糖：左为阳性单增木糖实验，右为对照七叶苷试验，李80菌落－平板－1滴3％的过氧化氢。左为阳性过氧化氢酶：过氧化氢酶又称接触酶，能催化过氧化氢分解成水和氧。菌落－平板－1滴3％的过氧化氢。过氧化氢酶：过氧化氢酶又称接81微生物基础知识及检测技术培训班讲义课件82

CAMP试验：左侧为马红球菌，右侧为β－溶血金黄色葡萄球菌，上为单核增生李斯特菌，中为英诺克李斯特菌，下为绵羊李斯特菌。

CAMP试验：左侧为马红球菌，右侧为β－溶血金黄色葡萄球菌83溶血实验：从左向右依次是：

1.单增，窄小的β溶血环。

2.绵羊，大的透明β溶血环。

3.无溶血环的李斯特溶血实验：从左向右依次是：

1.单增，窄小的β84六、生化反应的不确定性由于微生物变异现象的存在，故而同种微生物的生化特性不是一成不变的，它与该微生物的菌龄、血清型、营养环境、受损状况等都有着密切的联系。大肠杆菌、沙门氏菌的生化反应金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌的生化反应六、生化反应的不确定性由于微生物变异现象的存在，故而同种微生85第三部分：加工环境的微生物控制第三部分：加工环境的微生物控制86一、加工用水的微生物检测水样的采集1.采样量：0.5L/份；2.同一水源，同一时间采集几类检测样品时，优先采集微生物水样；3.采集过程要注意无菌操作；4.样品在运送过程中应保持密封；5.自来水采样：采集自来水水样时，待采样水龙头的材质应适于火焰消毒且没有附件。采样容器应直接放在水龙头下面并对闪水龙头，但不能与之接触。采样前，先用清洁布将水龙头内外擦干净，再用酒精灯灼烧水龙头进行灭菌。然后将水龙头完全打开，放水5－10分，再将水龙头关小即可开始采集水样。每次至少要采集两个水龙头的水样，至少一年内要包括全部水龙。如在清晨采样，管道中可能有沉淀物析出，因此采样前要先开水龙数分，以排除沉积物。一、加工用水的微生物检测水样的采集87耐热大肠菌群(ThermotoletantColiformOrganisms)：耐热大肠菌群是总大肠菌群的一部分。将总大肠菌群的培养温度提高到44～45℃，在此条件下仍能生长和发酵乳糖的菌群被称为耐热大肠菌群。它们由埃希氏菌属以及克雷伯菌属、肠杆菌属和柠檬酸杆菌属中的一些菌种组成。这些生物中．只有埃希氏大肠杆菌是粪便的特异性菌。检测方法同SN中的粪大肠菌群。耐热大肠菌群(ThermotoletantColif88二、空气微生物检测空气质量等级的划分1992年AL－DAGAL等对车间空气等级进行了划分。菌落总数<=100CFU/M3的优级，100－300的为中级，>=300的为空气质量较差。自然沉降法：虽然自然沉降法易受到空气流动等因素的影响，但由于其成本低，操作容易，故而仍为最广泛使用的方法。

公式的推导：奥梅尔良斯基根据经验设定，在面积为100CM2的营养琼脂表面，暴露5min后能降落约相当于10L空气中所含的菌落数。因此可用下式计算每立方米空气的细菌数

计算公式：细菌数＝50000N/A.t(A-平皿面积，cm2);t时间，min;N菌落数）替代方法：撞击法

二、空气微生物检测空气质量等级的划分89采样点：3点5点9点室内面积不超过30m2，在对角线上设里、中、外三点，里、外点位置距墙1m；室内面积超过30m2，设东、西、南、北、中5点，周围4点距墙1m。9点采样时，另增加四个边角点，位置距墙1m。如建筑为不规则布局，在拐角点可适当增加采样点。采样时，将含营养琼脂的平皿（直径9cm）置采样点（约桌面高度），打开平皿盖，使平皿在空气中暴露5min。微生物基础知识及检测技术培训班讲义课件90三、接触面微生物控制工作台：将经灭菌的内径为5cm×5cm的灭菌规格板放在被检物体表面，用一浸有灭菌生理盐水的棉签在其内涂抹10次，然后剪去手接触部分棉棒，将棉签放入含10mL灭菌生理盐水的采样管内送检。计算公式：三、接触面微生物控制工作台：将经灭菌的内径为5cm×5cm的91微生物基础知识及检测技术培训班讲义课件92工人手：被检人五指并拢，用一浸湿生理盐水的棉签在右手指曲面，从指尖到指端来回涂擦10次，然后剪去手接触部分棉棒，将棉签放入含10mL灭菌生理盐水的采样管内送检。计算公式：

每只手表面细菌菌落总数（cfu/只手）＝平板上平均细菌菌落数×10工人手：93微生物基础知识及检测技术培训班讲义课件94第四部分：记录第四部分：记录95一、抽样记录抽样记录包含的内容应有1.抽样依据的标准；2.抽样的程序；3.抽样的环境条件；4.抽样的地点、需要时给出图示或其它等效方法；5.抽样的方法（统计学方法）；6.被抽样单位（或委托单位）7.抽样的时间；8.样品保存的条件，方法，封识标志；9.抽样用的器材、设备、仪器。一、抽样记录抽样记录包含的内容应有96二、结果报告a)实验室的名称和地址;b)检测报告或校准证书的唯一性标识；c)客户的名称和地址(如有）；d)检测方法；e)检测物品的描述、状态和明确的标识；f)样品接收日期和检测日期；g)检测结果；h)检测人、结果报告审批人；二、结果报告a)实验室的名称和地址;97微生物培训讲义

李磊微生物培训讲义

李磊98第一部分：基础理论第一部分：基础理论99一、食品中微生物的来源1.食品中微生物的八个主要来源：土壤、水——大肠杆菌、李斯特菌、弧菌、梭状芽孢杆菌等植物产品——不动杆菌、柠檬杆菌、肠杆菌、李斯特菌等器皿用具——芽孢杆菌、肠杆菌、肠球菌、嗜冷杆菌等动物肠道——弯曲杆菌、肠杆菌、埃希氏菌、沙门氏菌等生产者——金葡菌、欧文氏菌、微球菌、李斯特菌等畜及畜代谢物——梭状芽孢杆菌、乳球菌、明串珠菌等尘埃——产碱菌、芽孢杆菌、梭状芽孢杆菌、类芽孢杆菌等一、食品中微生物的来源1.食品中微生物的八个主要来源：100果蔬加工中有害微生物的污染源：

1.原料由于原料在收获贮藏和加工场所经常暴露于许多不卫生的环境中因此很有可能受到外部污染。2.污垢污染影响微生物数量的因素有风力、湿度、日光、温度以及饲养和野生的动物、灌溉用水、鸟兽粪、收割设备、工人等。3.空气污染4.害虫污染果蔬在生长过程中遭受到害虫的伤害部分易受到腐败菌和致病菌侵袭；部分传媒生物蜜蜂、蝴蝶、鸟类等携带的病菌也容易在害虫伤害部分生长。5.加工过程：分为人为原因和非人为原因6.贮藏和货架污染：贮藏的方式、温度湿度要求、外界环境、包装等果蔬加工中有害微生物的污染源：101二、影响微生物生长的内在和外在因素a)PH值：酸性具有很强的抑菌作用，当PH<2时多数微生物都不能生长;当PH<4.2时微生物可被抑制生长。大多数微生物生长的最适PH值是6.6～7.5,也有少数微生物在PH4.0以下也能够生长。常见的微生物及其生长的PH范围如图二、影响微生物生长的内在和外在因素a)PH值：102PH值对微生物生长的负面影响至少二方面：酶的作用细胞营养物质的输送其他环境因素也可与PH相互影响，如温度盐度b)含水量微生物对水分的要求通常用水分活度（Aw）来表示，水分活度是指食品中水的蒸气压和同温度下纯水的饱和蒸气压的比值---Aw=P/P0。纯水时Aw=1,完全无水时，Aw＝0,食品中结合水含量越高，水分活度就越低。PH值对微生物生长的负面影响至少二方面：103

主要微生物生长的最低水分活度（Aw）

主要微生物生长的最低水分活度（Aw）104c)温度一方面随着温度的上升，细胞中的生物化学反应速率和生长速率加快。在一般情况下，温度每升高10℃，生化反应速率增加一倍；另一方面，机体的重要组成如蛋白质、核酸等对温度都较敏感，随着温度的增高而可能遭受不可逆的破坏。因此，只有在一定范围内，机体的代谢活动与生长繁殖才随着温度的上升而增加，当温度上升到一定程度，开始对机体产生不利影响，如再继续升高，则细胞功能急剧下降以至死亡。根据微生物对温度要求的不同，微生物可分为嗜冷微生物（最适生长温度在20℃～30℃之间），嗜温微生物（最适生长温度在30℃～40℃之间），而在45℃或以上能够生长，最适温度在55℃～65℃之间的微生物称为嗜热微生物。c)温度105根据微生物的生长特性，在食品加工过程中，我们可用高温杀灭微生物或采用低温方式来抑制微生物，对易腐食品而言，操作间的温度要控制在14℃以下，长时间存放半成品、成品的库温控制在0～4℃之间，冷藏温度一般在-2～-15℃之间，冻藏温度在-18～-21℃之间。根据微生物的生长特性，在食品加工过程中，我们可用高温杀灭微生106d)环境中的气体及其浓度在CO2浓度达到10%以上的气体中贮藏食品称为“可控气体”贮藏或气调（MA）贮藏。CO2的抑菌作用也与温度有关，抑制能力的大小随温度的降低而增加。革兰氏阴性菌要比革兰氏阳性菌更加敏感，其中假单孢菌最为敏感，而乳酸菌和厌氧菌则最具抗性。e)微生物的一般干涉（微生物的竞争性生长）微生物的一般干涉是批在同一环境或栖息地中其他微生物对某种微生物产生的一般性的、非特异的抑制或破坏。干涉菌通常是不同源微生物引起的，常见的干涉现象有乳酸拮抗作用、杀细菌素、PH抑制、有机酸、过氧化氢、双乙酰抑制作用等。d)环境中的气体及其浓度10715℃条件下熟制禽肉中啤酒足球菌与胚芽乳杆菌对金黄色葡萄球菌的抑制作用C－纯培养，P-与啤酒足球菌共同培养，L-与胚芽乳杆菌共同培养，M-混合培养干涉作用的机理主要有1、对营养物的竞争;2、吸附或附着点位的竞争;3、提供不良环境;4、上述几个因素的加成。15℃条件下熟制禽肉中啤酒足球菌与胚芽乳杆菌对金黄色葡萄球菌108三、微生物的营养要素微生物生长所需要的元素主要以相应的有机物与无机物的形式提供的，也有小部分可以由分子态的气体物质提供。营养物质按照它们在机体中的生理作用不同，可以将它们区分成碳源、氮源、能源、生长因子、无机盐和水。1. 碳源在微生物生长过程中能为微生物提供碳素来源的物质称为碳源。碳源物质在细胞内经过一系列复杂的化学变化后成为微生物自身的细胞物质（如糖类、脂类、蛋白质等）和代谢产物，碳可占一般细菌细胞干重的一半。同时绝大部分碳源物质在细胞内生化反应过程中还能为机体提供维持生命活动所需的能源，因此碳源物质通常也是能源物质。三、微生物的营养要素微生物生长所需要的元素主要以相应的有机109微生物利用碳源物质具有选择性，糖类是一般微生物较容易利用的良好碳源和能源物质，但不同微生物对不同糖类物质的利用有其选择性。微生物利用的碳源物质主要有糖类、有机酸、醇、脂类、烃、CO2及碳酸盐等。2.氮源--凡是能被用来构成菌体物质中或代谢产物中氮素来源的营养物质称为氮源。氮对微生物的生长发育有重要的作用，它们主要用来合成细胞中的含氮物质，如蛋白质、核酸等。一般不作为能量。能被微生物利用的氮源物质包括蛋白质及其不同程度的降解产物（胨、肽、氨基酸等）、铵盐、硝酸盐、分子氮、嘌呤、嘧啶、脲、胺、酰胺、氰化物等。微生物利用碳源物质具有选择性，糖类是一般微生物较容易利用的良1103．能源能为微生物的生命活动提供最初能量来源营养物或辐射能。化能异养微生物的能源就是碳源。所有真菌、放线菌和大部分细菌是化能异养型微生物。化能自养微生物的能源主要是无机物，如细菌、硝化细菌、硫细菌、氢细菌等。光能自养和异养微生物的能源主要是太阳能，如蓝细菌、紫色非硫细菌等。4．生长因子：通常指那些微生物生长所必需而且需要量很小，但微生物自身不能合成的或合成量不足以满足机体生长需要的有机化合物。各种微生物需求的生长因子的种类和数量是不同的。3．能源能为微生物的生命活动提供最初能量来源营养物或辐射111生长因子分为维生素、氨基酸及和嘌呤及嘧啶碱基三大类。5．无机盐：①参加微生物中氨基酸和酶的组成。②调节微生物的原生质胶体状态，维持细胞的渗透与平衡。③酶的激活剂。根据微生物对矿质元素需要量大小可以把它分成大量元素和微量元素。大量元素：Na、K、Mg、Ca、S、P等。微量元素是指那些在微生物生长过程中起重要作用，而机体对这些元素的需要量极其微小的元素，通常需要量在10-6--10-8mol/L：锌、锰、钠、氯、钼、硒、钴、铜、钨、镍、硼等。

生长因子分为维生素、氨基酸及和嘌呤及嘧啶碱基三大类。112微量元素一般参与酶的组成或使酶活化（见下表）6．水：①起到溶剂与运输介质的作用，营养物质的吸收与代谢产物的分泌必须以水为介质才能完成；②参与细胞内一系列化学反应；③维持蛋白质、核酸等生物大分子稳定的天然构象；④因为水的比热高，是热的良好导体，能有效地吸收代谢过程中产生的热并及时地将热迅速散发出体外，大而有效地控制细胞内温度的变化；⑤通过水合作用与脱水作用控制由多亚基组成的结构，如微管、鞭毛的组装与解离。微量元素一般参与酶的组成或使酶活化（见下表）6．水：①113对数期迟缓期分为四期：迟缓期、对数期、稳定期、衰退期细菌生长曲线0515202530105.56.08.58.07.57.06.59.0衰退期总菌数活菌数细菌数的对数次小时稳定期细菌生长繁殖的四个时期对数期迟缓期分为四期：迟缓期、对数期、稳定期、衰退114四、培养基的分类：1．按成分不同划分（1）天然培养基：常用的天然有机营养物质包括牛肉膏、蛋白胨、酵母浸膏、豆芽汁、玉米粉、牛奶等。（2）合成培养基：是人工添加化学成分完全了解的物质配制而成的培养基。2．根据物理状态划分（1）固体培养基在液体培养基中加入一定量凝固剂，使其成为固体状态即为固体培养基。培养基中的琼脂含量一般为1.5%-2.0%。在实验室中，固体培养基一般加入平皿或试管中，制成培养微生物的平板或斜面。固体培养基常用来进行微生物的分离、鉴定、活菌计数及菌种保藏。四、培养基的分类：1．按成分不同划分115（2）半固体培养基半固体培养基中凝固剂的含量少比固体培养基少，培养基中琼脂含量一般为0.2%-0.7%。半固体培养常用来观察微生物的运动特征、分类鉴定及噬菌体效价滴定等。（3）液体培养基液体培养基常用于大规模工业生产及在实验室进行微生物增菌、生化、传代等。3．按用途划分（1）基础培养基尽管不同微生物的营养需求不同，但大多数微生物所需的基本营养物质是相同的。基础培养基是含有一般微生物生长繁殖所需的基本营养物质的培养基。（2）半固体培养基半固体培养基中凝固剂的含量少比固体培养116（2）加富培养基也称为营养培养基、富集培养基，即在基础培养基中加入某些特殊营养物质制成的一类营养丰富的培养基。这些特殊营养物质包括血液、血清、酵母浸膏、动植物组织液等。（3）鉴别培养基用于鉴别不同类型微生物的培养基。在培养基加入某种特殊化学物质，某种微生物在培养基中生长后能产生某种代谢产物，而这咱代谢产物可以与培养基中的特殊化学物质发生特定的化学反应，产生明显的特征变化，根据这种特征性变化，可将该种微生物与其他微生物区别开来。（4）选择培养基用来将某种或某类微生物从混杂的微生物群体中分离出来的培养基。根据不同种类微生物的特殊营养需求或对某种化学物质的敏感不同，在培养基中加入相应的特殊营养物质或化学物质，抑制不需要的微生物的生长，有利于所需微生物的生长。（2）加富培养基也称为营养培养基、富集培养基，即在基础培117五、微生物基础实验技术（1）消毒与灭菌消毒：消灭病原菌和有害微生物的营养体灭菌：杀灭一切微生物的营养体，芽胞和孢子。灭菌方法：一、物理的方法：加热、过滤、辐射二、化学的方法：用化学试剂抑制或杀灭微生物。主要破坏细菌代谢机能。如重金属离子，磺胺类药物及抗生素等。五、微生物基础实验技术（1）消毒与灭菌118干热法：火焰灼烧灭菌和热空气灭菌。1、火焰灼烧适用于接种环、接种针和金属用具如镊子等，试管口和瓶口，涂布用玻璃棒。2、热空气灭菌利用高温干燥空气（160－170C）加热灭菌1－2h，适用于玻璃器皿和培养皿等。

灭菌原理：加热使蛋白质变性。灭菌效率与水的含量有关，当环境和细胞含水量越大，凝固越快。

注意事项：1）培养基、橡胶制品、塑料制品不能用此法；2）玻璃器皿不要与箱壁、箱底接触，以防暴裂；3）物品不能太挤；4）灭菌过程中不要开箱，灭菌结束后要等温度降至70°时再开箱门，防止器皿骤冷碎裂。干热法：火焰灼烧灭菌和热空气灭菌。119湿热法：1.原理：湿热灭菌作用要强于干热灭菌，主要因为水分有利于蛋白质的凝固，水分越多，凝固蛋白质所需的温度越低。另外，湿热灭菌的穿透性比干热强，因为水的比热（1.0）比空气的比热（0.24）要大，还由于蒸气在凝结时是一个放热过程，要增加额外的热量。所在灭菌效果好。湿热灭菌的方式：1.煮沸法；2.间歇灭菌法；3.巴氏灭菌法；4.高压蒸气灭菌法；5.超高温杀菌（135-150°C和2-8s对牛乳和其它液态食品）。湿热法：120高压蒸气灭菌法

适用范围：培养基、工作服、橡胶物品等、玻璃器皿。

注意的问题：1.冷空气的排放要彻底压力表读数蒸气温度0.07MPA1150.105MPA1210.210MPA132饱和蒸气压力与温度的对应关系但如果冷空气只排除50%，0.105MPA时，温度只能升至112度，为保证冷空气的彻底排除，要求灭菌器的密封性要好、排气管道通畅、排气时间充分。高压蒸气灭菌法压力表读数蒸气温度0.07MPA1150.101212.物品的包装要正确灭菌物品的包装材料要具有良好的通透性，并可防止各种微生物的进入。可采用的包装材料有双层细棉布、牛皮纸等。也可使用专门的容器。3.灭菌物品的摆放要合理灭菌物品间要留有间隙，空玻璃管要侧放或倒放。如有金属物品，要放置于底层。灭菌对培养基成分的影响：a.pH值普遍下降。b.产生混浊或沉淀，这主要是由于一些离子发生化学反应而产生混浊或沉淀。例如Ca2＋与PO43-化合，就会产生磷酸钙沉淀。c.不少培养基颜色加深。d.体积和浓度有所变化。e.营养成分有时受到破坏。部分添加物质（如受热易分解的抗生素）不能采用这种方法。2.物品的包装要正确122高压蒸汽灭菌效果的监测（一般性了解）生物法：（GB15981－1995）菌株选择：选用耐热的非致病性细菌芽胞作指示菌。一般选用嗜热脂肪杆菌，本菌芽胞对热的抗力较强，其热死亡时间与病原微生物中抗力最强的肉毒杆菌芽胞相似。检测时应使用标准试验包，每个包中心部位置生物指示剂2个，放在灭菌柜室的5个点，即上、中层的中央各一个点，下层的前、中、后各一个点。灭菌后，取出生物指示剂，接种于溴甲酚紫葡萄糖蛋白胨水培养基中，置55－60℃温箱中培养48小时至7天，观察最终结果。若培养后颜色未变，澄清透明，说明芽胞已被杀灭。达到了灭菌要求。若变为黄色混浊，说芽胞未被杀灭，灭菌失败。化学法：灭菌指导胶带、化学指示剂等。高压蒸汽灭菌效果的监测（一般性了解）123

（2）微生物的分离、纯化及培养技术分离与纯化：从混杂的微生物群体中获得只含某一种或某一株微生物的过程。纯培养的目的：纯化菌落，使其有唯一正确的生化、血清反应。

方法：点植、划线、倾注平板、涂布等

（2）微生物的分离、纯化及培养技术124保藏的菌种通过斜面、穿刺或疱肉培养基（用于厌氧细菌）培养好后，待其充分生长后，用牛皮纸将棉塞部分包扎好（棉塞换成胶塞效果更好），置4C˚冰箱中包藏。保藏时间：霉菌、放线菌及芽孢菌保存2－4个月移种一次，酵母菌间隔两个月，普通细菌一个月，假单胞菌两周传代一次。此法优点是操作简单、使用方便，缺点是保藏时间短、易被污染。附加石蜡：附加石蜡可延长菌种保藏时间。将无菌石蜡加在已长好菌的斜面上，其用量以高出斜面顶端1CM为准，使菌种与空气隔绝。霉菌、放线菌、芽孢菌可保藏两年以上，酵母菌可保藏1－2年，普通细菌也可保藏1年左右。1、传代培养法

（3）菌种保藏保藏的菌种通过斜面、穿刺或疱肉培养基（用于厌氧细菌）培养好后1252、载体法使生长合适的微生物吸附在一定的载体上进行干燥。常用的载体有土壤、砂土、硅胶、明胶、麸皮、磁珠和滤纸片等。3、悬液法将细菌、酵母菌细胞悬浮在一定的溶液中保存。溶液包括蒸馏水、糖溶液、磷酸缓冲液、食盐水等。4、冷冻法使菌种始终存放在低温环境下的保藏方法。包括低温法和液氮法。5、真空干燥法这类方法包括冷冻真空干燥法和L－干燥法。冷冻真空干燥法是将要保藏的微生物样品先经低温预冻，然后在低温状态下进行减压干燥。L-干燥法则不需要低温预冻样品，只是使样品维持在10－20C˚范围内进行真空干燥。2、载体法126（4）染色：

1、革兰氏复染色法所用试剂：结晶紫、乙醇脱色剂、碘液媒染剂、沙黄（蕃红花红）原理：细菌基于细胞壁多糖结构的不同吸附电荷的能力不同。步骤：固定→结晶紫(60S)→碘液媒染（60S）→乙醇脱色（30S）→沙黄复染（60S）→镜检（4）染色：

1、革兰氏复染色法1272、芽孢染色：芽孢染色法是利用细菌的芽孢和菌体对染料的亲合力不同的原理，用不同染料进行着色，使芽孢和菌体呈不同的颜色而便于区别。通常可用孔雀绿或碱性品红对菌体和芽孢进行染色。水洗使菌体脱色，再用复染液沙黄等进行菌体着色。2、芽孢染色：1283、荚膜染色由于荚膜与染料间的亲和力弱，不易着色，通常采用负染色法染荚膜，即设法使菌体和背景着色而荚膜不着色，从而使荚膜在菌体周围呈一透明圈。由于荚膜的含水量在90%以上，故染色时一般不加热固定，以免荚膜皱缩变形。3、荚膜染色129

1.一般质量检查生产厂必须提供的文件：—培养基名称、各种成分名称和增补剂名称以及产品编号；—培养基使用前的pH；—储藏条件和有效期；—所有性能评价和所用的测试菌种；—技术数据清单；—质控证书；—必要的安全及危害数据。2.实验室检查项目：—培养基的名称和批号；—接收日期；—有效期；—包装的情况和完整性验收记录应包括上述信息。（5）培养基的验收与制备1.一般质量检查（5）培养基的验收与制备1303.培养基的使用前应进行的实验室测试：包括：PH值、色泽、透明度、杂质、稳定性、湿度。根据培养基批号的不同，同批培养基还要进行相应的菌株测试，测试菌株必须是来自标准菌种保藏中心或其认可的机构如(ATCC)等提供的标准测试菌株，菌株必须在其活性有效期限内，最好采用非特异性菌株以保证生化反应的正常进行。如有必要或条件许可，可同时接种一两种干扰菌株作空白对照。测试菌株在所用培养基上至少可分离出一株活菌。不能分离出活性菌株或分离过程中产生其它非正常菌株的培养基视为不合格产品。《培养基验收记录》3.培养基的使用前应进行的实验室测试：131例子：以EMB平板验收为例此培养基呈紫色，可有细微沉淀。接种质控菌株后，35℃培养18～24小时，观察结果应如下表所示：例子：以EMB平板验收为例此培养基呈紫色，可有细微沉淀。接种1324、培养基的制备记录培养基在每次时要保有记录，记录内容包括：培养基名称批号及其来源最终pH值消毒的温度和制备时间、日期制备者记录应随制好的培养基一同存放4、培养基的制备记录1335、培养基的异常现象和可能原因培养基不能凝固：—制备过程中过度加热—低pH值造成培养基发生酸水解—称量不正确—琼脂未完全溶解—培养基成分未充分混匀pH值不正确：—制备过程中过度加热—水质不佳—外部化学物质污染—测Ph值时温度不正确—pH计未正确校准5、培养基的异常现象和可能原因134颜色异常：—制备过程中加热过度—水质不佳—脱水培养基质量差—外部化学物质污染pH不正确产生沉淀：—制备过程中过度加热—水质不佳—脱水培养基质量