高效液相色谱法专家讲座

第10章液相色谱法第1页内容提纲基本原理经典液相色谱法高效液相色谱法高效液相色谱仪2第2页基本原理vanDeemter方程

3液体的Dm比气体小得多

第3页基本原理vanDeemter方程

4第4页基本原理vanDeemter方程

5静态流动相传质阻抗第5页基本原理vanDeemter方程

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第6页基本原理vanDeemter方程

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第7页基本原理液相色谱法经典液相色谱法

高效液相色谱法（HPLC）

超高效液相色谱法（UPLC）

8第8页基本原理9第9页内容提纲基本原理经典液相色谱法高效液相色谱法高效液相色谱仪10第10页液-固吸附柱色谱法吸附剂硅胶分离

酸性和中性物质氧化铝碱性

氧化铝分离

碱性和中性物质酸性

氧化铝分离

酸性物质和对酸稳定的中性物质中性

氧化铝分离

在酸、碱中不稳定的物质聚酰胺分离

易形成氢键的物质大孔吸附树脂应用广泛11第11页薄层色谱法12第12页薄层色谱法操作步骤制板点样展开检视定性定量13第13页比移值比移值Rf

相对比移值Rr

14第14页边沿效应定义同一组分在同一薄层板上，处于边缘的斑点的Rf

大于处于中心的斑点的Rf

的现象产生原因展开缸空间未被溶剂蒸气饱和，在展开过程中极性较弱或沸点较低的溶剂在薄层板的边缘较易挥发，造成边缘部分的展开剂中极性溶剂的比例增大，Rf

相应增大解决办法预饱和：用展开剂将展开缸及薄层板预先饱和后再进行展开15第15页分离条件旳选择综合考虑被分离组分吸附剂流动相一般原则分离极性大的物质，选择吸附能力弱的吸附剂、极性大的流动相分离极性小的物质，选择吸附能力强的吸附剂、极性小的流动相16第16页分离条件旳选择17第17页硅胶旳活性与含水量硅胶的吸附中心—Si—OH硅胶失活—Si—OH·H2O18硅胶含水量/%活性级数氧化铝含水量/%0Ⅰ05Ⅱ315Ⅲ625Ⅳ1038Ⅴ15第18页被分离组分和展开剂旳极性被分离组分的极性基本母核相同，基团的极性越强，分子的极性越大双键越多，极性越大基团的空间排列对极性也有影响烷烃<烯烃<醚<酯<酮<醛<巯基<胺基<酰胺<醇<酚<羧酸流动相的极性石油醚<环己烷<四氯化碳<苯<甲苯<乙醚<氯仿<乙酸乙酯<正丁醇<丙酮<乙醇<甲醇<水19第19页正相色谱法和反相色谱法正相色谱法固定相极性>流动相极性液-固吸附色谱法正相液-液分配色谱法反相色谱法固定相极性<流动相极性反相液-液分配色谱法20第20页检视办法有色物质直接在可见光下观察硅胶H（不含黏合剂的硅胶），铺板时另加黏合剂CMC-Na硅胶G（含煅石膏黏合剂）无色但有紫外吸收的物质使用荧光薄层板，在紫外灯下观察硅胶HF254、硅胶HF360、硅胶GF254、硅胶GF360无色且无紫外吸收的物质显色反应21第21页内容提纲基本原理经典液相色谱法高效液相色谱法高效液相色谱仪22第22页高效液相色谱法特点23高压高效高灵敏度分析速度快流动相选择范围广应用范围广：70%-80%有机化合物三高一少两广第23页高效液相色谱法类型24分类按分离机制键合相色谱正相键合相反相键合相反相离子抑制反相离子对手性色谱亲和色谱按实验目的分析色谱制备色谱第24页化学键合相色谱法化学键合相用化学反应的方法将固定液的官能团键合在载体表面上形成的固定相25第25页化学键合相色谱法反相化学键合相色谱法固定相：十八烷基（C18、ODS）键合相流动相：水+有机溶剂（甲醇、乙腈、四氢呋喃）分离机制：疏溶剂理论（溶质与极性分子的排斥力）极性大的组分先流出流动相极性增大，K增大，洗脱能力降低，tR增大应用最广：分离非极性至于中等极性的分子型化合物正相化学键合相色谱法固定相：氰基（CN）或氨基（NH2）键合相流动相：正己烷+其他有机溶剂（氯仿、乙腈、醇）分离机制：范德华力的定向作用、诱导力、氢键作用极性大的组分后流出流动相极性增大，K减小，洗脱能力增加，tR减小氨基键合相：主要用于糖类物质的分离分析26第26页化学键合相色谱法反相离子对色谱法方法：流动相中加入离子对试剂机理：待测组分离子与离子对试剂（反离子）生成中性离子对适用对象：pKa<3的酸或pKa>8的碱离子对试剂：十二烷基磺酸钠（碱性试样）、四丁基氯化铵（酸性试样）反相离子抑制色谱法方法：流动相中加入少量弱酸、弱碱或缓冲盐机理：抑制组分解离，增加其在固定相中的溶解度适用对象：pKa3～7的弱酸或pKa7～8的弱碱pH调节范围：2~827第27页颗粒细而均匀耐高压（基体常用刚性SiO2）常用固定相和流动相28固定相总体要求第28页常用固定相和流动相29液-固吸附色谱固定相具有吸附活性的吸附剂：硅胶、氧化铝、多孔微球、分子筛、聚酰胺等硅胶：无定形全孔-YWG，5-10μm，载样量大，柱效高球形全孔-YQG，3-10μm，载样量大，柱效高，涡流扩散小，渗透性好堆积硅珠-YQG，3-5μm，载样量大，传质阻抗小高分子多孔微球第29页常用固定相和流动相30键合相色谱固定相类型：Si-O-Si-C型性能指标：覆盖率-决定分离机制（分配、吸附）封尾（封端）：减少残存硅羟基-三甲基氯硅烷（TMCS）、六甲基二硅胺（HMDS)含碳量（C%）-高、中、低优点：不流失、稳定性好、载样量大、适于梯度洗脱类型：按固定液与载体（全多孔硅胶）结合类型分Si-O-CSi-NSi-CSi-O-Si-C第30页化学性质稳定粘度小（传质快、柱压低）纯度高沸点低适应性好常用甲醇-水或乙腈-水体系常用固定相和流动相31流动相要求第31页等度洗脱与梯度洗脱等度洗脱用恒定配比的流动相进行洗脱适合于组分数目较少、性质差别不大的样品梯度洗脱在一个分析周期内，按一定程序，不断改变流动相的浓度配比进行洗脱可以使复杂样品中性质差异很大的组分，在各自适宜的容量因子下分离，改善分离效果和峰形32第32页内容提纲基本原理经典液相色谱法高效液相色谱法高效液相色谱仪33第33页仪器构成34高压输液系统进样系统色谱柱分离系统检测器数据处理系统第34页35第35页重要部件及功能36输液系统高压输液泵核心贮液罐在线过滤器梯度混合装置在线脱气装置第36页输液系统37高压输液泵类型恒流泵：螺旋注射泵、往复柱塞泵恒压泵：气动放大泵性能流量稳定流量范围宽输出压力大液缸容积小、适于梯度洗脱密封性好、耐腐蚀第37页输液系统38贮液罐玻璃或塑料溶剂0.5-2.0L无色或棕色在线微孔滤头第38页等度洗脱与梯度洗脱等度洗脱用恒定配比的流动相进行洗脱适合于组分数目较少、性质差别不大的样品梯度洗脱在一个分析周期内，按一定程序，不断改变流动相的浓度配比进行洗脱可以使复杂样品中性质差异很大的组分，在各自适宜的容量因子下分离，改善分离效果和峰形39输液系统第39页输液系统40梯度洗脱装置方式：低压梯度（外）、高压梯度（内）低压梯度-比例阀常压混合、高压泵输出流动相四元泵只需一个高压输液泵计算机控制比例阀溶剂混合易产生气泡，需在线脱气高压梯度-高压泵按设定比例分别输送流动相第40页输液系统41脱气装置气泡影响：损坏泵影响检测器灵敏度影响基线（稳定性、飘移）形成鬼峰方式：在线脱气离线脱气第41页进样器（六通阀）42第42页43进样器（六通阀）LoadInject第43页检测器通用型检测器蒸发光散射检测器（ELSD）可用于挥发性低于流动相的任何样品组分示差折光检测器（RID）主要用于糖类的检测44第44页检测器专属型检测器紫外检测器（UVD）

光电二极管阵列检测器（DAD）荧光检测器（FD）45第45页DAD46第46页检测器通用型检测器蒸发光散射检测器（ELSD）用于挥发性小于流动相的样品组