分子生物学实验DNA片段扩增及DNA连接-实验操作

上次实验回顾实验一RNA的提取、变性电泳、逆转录反应1、提取真核细胞的总RNA（避免RNA酶污染）2、逆转录反应（目的是得到cDNA模板）3、RNA的甲醛变性凝胶电泳（打开RNA二级结构）RNA电泳结果rRNA可以作为内部Marker分子，通过观察rRNA的两条带（28S和18S）的比例，可以判断所提取mRNA是否存在降解。RNA电泳并不能判断mRNA是否提取成功，也不作为鉴定RNA提取质量的常规方法，因为在电泳过程中RNA可能发生降解。一、PCR实验背景二、PCR基本原理三、PCR引物设计原则四、PCR反应注意事项五、常见问题与对策六、PCR技术的应用讲解内容

一、PCR反应二、PCR产物电泳及回收三、DNA连接四、LB培养基琼脂平板的制备实验内容第二次实验课、DNA片段扩增及DNA连接模板（DNA或cDNA）2

l10PCRbuffer（含MgCl2）

5ldNTPs(10mmol/L)1l5’引物

(10mol/L)1l3’引物

(10mol/L)1l去离子水（补足反应体系）

39lTaqDNApol.(2U/l)1l

轻弹管底混合（用离心机甩一下）50l在一微量离心管中依次加入下列试剂：加各种成分最好在冰上进行。加入顺序不是随机的：DNA聚合酶一定要最后加入。实验操作一、PCR注意：PCR产物一定要从胶上回收后再用。蛋白胨：10g酵母提取物：5gNaCl：10g琼脂：15g蒸馏水：800ml终体积：1L高压灭菌20分钟，待冷却至50oC时，加入抗生素，铺琼脂平板实验操作二、LB培养基琼脂平板的制备无菌超净工作台的使用实验操作三、PCR产物的电泳及回收电泳：1.15μlPCR产物+3μl上样液，混匀；2.上样，1%琼脂糖凝胶，100V，30min。挤胶法回收PCR产物：（1）在UV灯下，用手术刀片将含DNA片段的琼脂糖凝胶切下，放入封口膜中；

（2）将切下来的胶块，标记好姓名，-20℃冰箱中。（3）放在封口膜内直接挤压，用加样器吸取挤压后得到的液体。PCR电泳结果本次实验扩增GAPDH基因(746bp)TA连接原理：1、TaqDNA聚合酶：PCR产物的3`端突出一个A3`

AA3`5`5`3`

TT3`5`5`2、商业设计的T载体：在3`端多出一个T3、两者的互补碱基先退火结合(粘性末端连接)，然后连接酶在缺口形成磷酸二酯键。应用时避免反复冻融，防止T的断裂丢失。如果与T载体连接后主要以自身环化为主，要考虑‘T’可能已经丢失。实验操作四、DNA连接（PCR产物与T载体的连接）连接反应的关键是目的基因片段与载体的比例，一般片段与载体的比例为2:1或3:1（摩尔比）。平端连接通常需将载体的5端磷酸先去掉再进行连接，这样可防止载体的自身环化。载体的5端磷酸去掉后：片段与载体的连接就会留下一个缺口，连接酶由于载体5端缺乏磷酸而无法形成磷酸二酯键；转化入细胞后，细胞内的酶会将缺乏的磷酸基团加上，再形成磷酸二酯键。

其他说明：可按下列配方进行连接反应：

回收的PCR产物（DNA片段）7lT载体

1lT4DNA连接酶buffer1lT4DNAligase1l

终体积10l实验操作：TA连接T载体一般从公司购买，载体DNA的含量和浓度已知。因此，连接反应成败的关键是估计目的DNA的量。轻弹管底混合，离心机甩一下，置25oC水浴1h，-20oC保存备用连接产物可以直接用于转