真菌微生物检查及实验室检查对诊断的价值

真菌微生物检查及实验室

检查对诊断的价值临床医生对检验报告结果的解读存在困惑检验报告过度依靠检验报告，完全根据结果制定治疗方案.不参考检验报告，经验性治疗及时准确的检验报告可为疾病的诊断、治疗、预防提供依据，临床医生对检验报告的正确解读至关重要！主要内容12走进实验室，揭秘真菌的实验诊断方法为获取及时准确的检验报告，临床医生又该做些什么？直接镜检法组织病理学检查血清学方法分子生物学方法培养法及药敏试验走进实验室，揭秘真菌的实验诊断方法实验室诊断方法直接镜检是快速有效的真菌感染诊断方法将临床标本置于载玻片上，封固，在显微镜下观察杜艳,等.生物学免疫学进展.2009;37(1):67-71制片镜下观察不染色法KOH法：取病发、皮屑、甲屑等置于载玻片上，加1滴10%-20%KOH液，盖上盖玻片并微加热透化，镜下可见孢子、菌丝形态染色法常用墨汁染色，乳酸酚棉兰染色,革兰染色等真菌直接镜检形态特征念珠菌常单个出芽，有假菌丝者末端缩窄仍附于菌上，似香肠样连接，菌丝多有分隔白念珠菌革兰染色芽生孢子假菌丝PAS染色10%KOH直接压片培养阳性直接压片黄曲霉有隔菌丝、可见双义型的45℃分枝，菌丝较大分生孢子梗长，小分生孢子表面粗糙墨汁染色镜检芽生孢子荚膜内含物(反光颗粒)大小变异甚大，球形或橄榄球形，在墨汁黑背景下呈清晰的晕圈，且在晕圈内可见菌体细胞新型隐球菌黑曲霉黄曲霉念珠菌小结直接镜检是真菌学检查最经典的方法其优势在于快速且能为鉴定致病真菌类型提供最初线索，有时对形态特别的致病真菌甚至可以直接进行鉴定阳性率较低其阴性结果不能排除真菌感染，与培养检查结合才能确诊组织病理学检查血清学方法分子生物学方法走进实验室，揭秘真菌的实验诊断方法实验室诊断方法直接镜检法培养法及药敏试验白念珠菌的菌落特征和显微镜下形态白念珠菌呈圆形或卵圆形，菌体着色不均匀，还可观察到大量厚膜孢子和假菌丝白念珠菌在沙保弱葡萄糖琼脂培养基上呈乳白色偶见淡黄色，表面光滑有浓酵母味厚膜孢子假菌丝芽管芽管(芽管形成试验)白念珠菌在血平板上呈灰色或奶油色，表面光滑有浓酵母味白念珠菌在不同培养基上菌落特征不同白念珠菌在显微镜下特征其他念珠菌的菌落特征和显微镜下形态交叉分支菌丝，侧生芽生孢子较多，无厚壁孢子近平滑念珠菌乳酪样菌落，通常表面光滑，亦有菌落表面粗糙及皱褶热带念珠菌克柔念珠菌菌落平滑有光泽，白色，时间较久表面有皱纹，黏稠，甚至有毛样外观对称分枝菌丝，芽生孢子较少，无厚壁孢子菌落扁平，平滑、干燥，有时表面有皱折，通常乳白色到淡黄丰富的假菌丝及发育良好的芽生孢子，但无厚壁孢子菌落呈白色或奶油色乳酪样，表面平滑，稍有光泽卵圆形芽生孢子，单芽，位于孢子的细端，无荚膜，无子囊或菌丝光滑念珠菌念珠菌属的显色鉴别培养帮助明确菌种根据酶底物法，通过显色来区别不同念珠菌，37℃培养48小时后，有四种念珠菌可以得到鉴定：白念珠菌菌落显翠绿色热带念珠菌菌落显蓝灰色或铁蓝色光滑念珠菌菌落显紫色克柔念珠菌菌落显淡粉色其它念珠菌显白色CHROM-琼脂色原底物培养基：有助于从临床标本(例如尿液或血液)识别多种不同酵母菌型念珠菌徐红等.中国真菌学杂志.2006Oct;1(5):304-307.曲霉菌的菌落特征和显微镜下形态黄曲霉在Sabouraud葡萄糖琼脂培养基上的菌落：粗毛毯状或放射状皱纹，黄色-黄绿色-棕绿

分生孢子头疏松放射状、分生孢子梗长、顶囊、瓶梗、梗基、小分生孢子球形或洋梨状元烟曲霉在Sabouraud葡萄糖琼脂培养基上的菌落：绒状或絮状边缘，白色—烟绿色烟曲霉

(单列)分生孢子头、分生孢子梗光滑、顶囊倒烧瓶状、瓶梗单层、分生孢子呈球形黄曲霉烟曲霉曲霉菌的菌落特征和显微镜下形态菌落厚绒状，白色-黄色区域-黑色分生孢子头放射状或列柱状，分生孢子梗壁光滑，较厚，顶囊呈球形或近球形绒毛状，有浅放射状沟纹，表面肉桂色或黄褐色分生孢子头致密分生，孢子柄光滑无色，分生孢子小、光滑呈链状菌落绒毛状，粉末状，表面绿色或黄褐色分生孢子头呈密短圆柱形；分生孢子梗短，弯曲，光滑无色；顶囊呈半球形或烧瓶形，双层小梗构巢曲霉土曲霉黑曲霉葡萄糖蛋白胨琼脂培养基：25℃或37℃培养咖啡酸培养基(CAA):37℃培养

2-5d即长出乳白色黏液性菌落，呈不规则圆形，表面有蜡样光泽，以后菌落增厚，颜色由乳白、奶油转桔黄隐球菌的菌落特征和显微镜下形态Sabouraud培养基：室温或37℃培养3-4d可见菌落长出生成酵母型菌落，初呈白色，1周后转淡黄或棕黄、湿润粘稠，状似胶汁用于鉴定新型隐球菌；由于该菌含有靛酚氧化酶，在CAA中菌落呈黑色；CAA培养基对光敏感，应避光保存墨汁染色观察直接镜检部分已做详细介绍，此处不再赘述小结培养法可以：提高病原体检出的阳性率验证直接镜检的结果确定致病菌的种类但是，培养法耗时较长真菌体外药敏试验主要方法微量肉汤稀释法前10管：0.2mL氟康唑+1.8mL菌液2mL菌液1.8mLRPMI1640

培养液念珠菌属35℃孵育48h隐球菌孵育72h读取MIC结果常量肉汤稀释法氟康唑：1-10孔分别为100μL菌悬液：1-10孔分别为100μL200μL菌悬液200μLRPMI汤隐球菌35℃孵育72h其他菌属孵育48h读取MIC结果Etest法菌悬液均匀布于药敏板上，35℃培养24h读取结果，从抑菌环与试剂条交界处可定量读出MIC值纸片扩散法菌悬液均匀涂布于药敏板上，35-37℃培养18-24h读取结果,读取抑菌圈直径CLSIM44-P(仅限于氟康唑)CLSIM44-A(仅限于氟康唑和伏立康唑)抗真菌药物MIC值与临床疗效:90-60原则药敏试验敏感菌株：90%对治疗有效药敏试验耐药菌株：60%对治疗有效需要考虑的影响因素药敏可能有误药物PD/PK宿主反应毒素反应MahmoudA.G,JCM1996,34:489-495RexJH,CID2002,35:982-989不能仅靠药敏结果选择药物，还应综合考虑其他因素小结药敏试验现状：按照CLSI推荐的采用稀释法，操作繁琐纸片扩散法仅限氟康唑和伏立康唑Etest法有较好的重复性和稳定性，价钱太贵药敏孵育时间因菌种而不同选择抗真菌药物不能仅依靠药敏试验结果：90%敏感菌株对治疗有效60%耐药菌株对治疗有效还需要充分考虑药物的PK/PD等因素选择药物血清学方法分子生物学方法走进实验室，揭秘真菌诊断背后的方法实验室诊断方法直接镜检法组织病理学检查培养法及药敏试验组织病理学检查是侵袭性真菌感染的确诊依据组织病理学检查对于确定致病菌在组织内寄生的情况、了解宿主的反应十分重要但也存在一定的局限性：组织穿刺往往不易被患者接受穿刺部位及所取组织量也会影响诊断结果临床开展受到一定的限制有待进一步提高其敏感性文兴东.亚太传统医药.2012;8(5):219-220组织病理切片特征肺组织中的曲霉菌丝肺组织中的曲霉菌分生孢子头食道念珠菌病患者的组织切片，可见假菌丝和芽生孢子组织病理切片特征H&EMucicarmineAlcianblueImmuno-chemistryPASGMS荚膜被染成胭脂红色胞壁呈红色胞壁呈浅蓝色隐球菌呈淡红色，荚膜透亮胞壁呈银黑色隐球菌病理组织切片染色特征分子生物学方法走进实验室，揭秘真菌诊断背后的方法实验室诊断方法直接镜检法培养法及药敏试验组织病理学检查血清学方法G试验的原理和临床价值G试验检测底物：(1-3)--D-葡聚糖(真菌细胞壁成分>50%)G试验的原理：鲎试验：级联凝固反应G试验可检测念珠菌、毛孢子菌、曲霉、镰刀霉、支顶孢霉、卡氏肺孢子菌，不能检测隐球菌、接合菌G试验的临床价值：G试验目前主要用于侵袭性念珠菌和曲霉感染的诊断、高危人群的监测以及对疗效、预后的评价G试验对于区分确诊或拟诊侵袭性真菌感染与非侵袭性真菌感染患者，有良好的准确性连续检测可动态反应真菌感染程度和抗真菌治疗疗效G因子亚基亚基(丝氨酸蛋白酶原)(1-3)--D-葡聚糖结合丝氨酸蛋白酶比浊法测定比色法测定激活KędzierskaA,etal.EurJClinMicrobiolInfectDis.2007,26:755.乳胶凝集试验检测底物：新型隐球菌荚膜多糖抗原乳胶凝集试验的原理：以乳胶颗粒作为载体的一种间接凝集试验。即吸附新型隐球菌荚膜多糖抗原于其表面，特异性抗体与之结合后，产生凝集反应乳胶凝集试验可检测新型隐球菌乳胶凝集试验的临床价值：作为隐球菌病的确诊标准，其敏感性和特异性高国外研究其灵敏度和特异度为93％～100%，国内报道其灵敏度和特异度均为100％抗原滴度与疾病转归呈正相关，可指导治疗与判断预后乳胶凝集试验的原理和临床价值阴性阳性GM试验的临床价值GM试验检测底物：曲霉细胞壁成分半乳甘露聚糖(菌丝在组织生长过程中释放)GM试验可检测曲霉菌属、隐球菌属和青霉/拟青霉GM试验的临床价值：GM试验目前主要用于侵袭性曲霉感染的诊断、早期、快速、特异性高半乳甘露聚糖水平的动态变化反应抗真菌药物疗效，指导抗真菌药物使用推荐用于恶性血液肿瘤患者和造血干细胞移植患者，不推荐用于实体器官移植(SOT)患者美国FDA于2003年批准将检测血清曲霉GM抗原作为侵袭性曲霉感染的诊断指标吕沛华,等.中国感染与化疗杂志.2006;6(4):284-287小结G试验和GM试验，为临床增加了侵袭性真菌感染的诊断手段，但不能完全依赖动态监测可反应真菌感染程度和抗真菌治疗疗效注意分析假阳性、假阴性影响因素结合患者临床情况综合分析走进实验室，揭秘真菌诊断背后的方法实验室诊断方法直接镜检法培养法及药敏试验组织病理学检查血清学方法分子生物学方法PCR技术对真菌诊断提供有益帮助分子生物学诊断技术因具有高检出率和鉴定特异性致病真菌的能力而成为许多实验室越来越感兴趣的课题目前一些改进的PCR技术在较大程度上增加灵敏度与特异度，在鉴别真菌定植和感染以及真菌种属的鉴定方面能提供有益的帮助吕沛华,等.中国感染与化疗杂志.2006;6(4):284-287AgnèsFerronietal,

JCM,2010A.Bizzinietal,

JCM,2010基质辅助激光解析电离-飞行时间质谱法

MALDI-TOFMS原理：用特异性的多肽、蛋白质谱进行菌种鉴定优势：快速：20min之内即可得到结果，是现有方法中最快的阳性血培养鉴定法、纯菌株大约10分钟高特异性和敏感性：接近100%对部分混合感染样本的准确鉴定不足：多报道用于鉴定细菌，酵母菌及分枝杆菌需要建立严格的标准数据库体系进行比对分析应用范围：纯培养菌株、或报警阳性的血培养瓶检测分子生物学技术：快速，敏感，特异，准确直接对临床标本进行检测，各步骤优化严格规范操作，避免假阳性无法区分定植还是感染，需要结合其他诊断方法综合分析小结主要内容12走进实验室，揭秘真菌诊断背后的方法为获取及时准确的检验报告，临床医生又该做些什么？如何提供合格的检验标本？实验室检验人员就是通过上述的各类诊断方法得出准确的结果，报告给临床医生想要获得一份及时、准确的检验报告，检验人员非常重要！但是准确的检验报告仅靠检验人员就可以了吗？临床医生与实验室检验人员同样重要实验室检验人员的职责遵守基本操作规范，术语准确回报结果及时、准确认识检验结果的重要意义能够与临床医生加强沟通临床医生的职责提高微生物标本的送检率提供合格的检验标本开具合格的检验申请单充分合理利用检验结果？获得准确结果的重要环节：分析前质量控制血培养标本的采集要点采集血培养样本的最佳时间尽可能在患者抗生素应用效果不佳，再次发热时采血在患者接受抗真菌治疗前采血如患者已经接受抗真菌治疗，应在下一次用药之前采血培养血培养采血量与采血部位对于疑有各类血行性感染病人采样应在给予抗菌药物治疗前多次(至少3次)抽血送培养成人每次采血量不应少于16-20ml（1套2瓶）初发患者，采多套血（2-3套）多个穿刺部位采血另外，采血过程必须严格无菌操作，避免污染，采集的血液需尽快送培养如果未能及时送到检验科，存放在室温即可，不能冷藏

呼吸道标本的采集要点—痰标本咳痰标本的采集方法医师或护士直视下采集标本病人先用无菌生理盐水漱口，去除表面的菌群教育病人深咳，收集从下呼吸道咳出的痰液时间要求清晨的痰含菌量最多，是最佳采集时间在抗生素应用前采集痰标本标本采集后1～2h内必须立即进行实验室处理如果无痰可用3％～5％NaCl5ml雾吸约5min导痰，也可用物理疗法、体位引流、鼻导管抽吸等法取痰不建议24h内多次采集，除非痰液外观性状出现改变一份合格的痰标本应该是痰涂片镜检每低倍视野<10个鳞状上皮细胞，>25个多核白细胞支气管肺泡灌洗术(bronchoalceolarlavage,BAL)按照标准严格操作，回收液量，至少应回收30-40%以上，BALF方能进行分析第一份回收的标本往往混支气管内成分，为防止其干扰，也可将第一份标本与其它标本分开检查术后回收灌洗液处理首先用单层纱布过滤以除去粘液，将滤液离心后分离上清液供生化检查和免疫学测定，沉淀物供细胞检查微生物学检查的标本须严格遵守无菌操作；合适的BALF应要求：达到规定的回收比例不