DB51∕T 2905-2022 猪A型塞内卡病毒分离鉴定技术规范

ICS11.220CCSB41DB51四川省地方标准DB51/T2905—2022猪A型塞内卡病毒分离鉴定技术规范TechnicalspecificationforisolationandidentificationforswinesenecavirusA2022-05-20发布2022-07-01实施DB51/T2905—2022目次前言.................................................................................II1范围...............................................................................12规范性引用文件.....................................................................13术语和定义.........................................................................14缩略语.............................................................................15试剂与设备.........................................................................15.1主要试剂.......................................................................15.2主要仪器设备...................................................................26样品的采集、保存与运输.............................................................26.1样品采集.......................................................................26.2保存与运输.....................................................................27病毒的细胞分离培养.................................................................27.1生物安全措施...................................................................27.2样品的处理.....................................................................27.3单层细胞制备...................................................................27.4样品接种.......................................................................37.5病毒收获.......................................................................38病毒核酸鉴定.......................................................................38.1RT-LAMP和RT-PCR引物...........................................................38.2核酸提取和反转录...............................................................38.3RT-LAMP反应....................................................................38.4RT-PCR反应.....................................................................48.5试验结果观察...................................................................49结果判定...........................................................................59.1RT-LAMP........................................................................59.2RT-PCR.........................................................................59.3病毒分离鉴定...................................................................5附录A（规范性）试剂配置.............................................................6附录B（资料性）猪A型塞内卡病毒VP1蛋白基因LAMP和RT-PCR扩增序列...................7I

DB51/T2905—2022前言本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。本文件首次发布。IIDB51/T2905—2022猪A型塞内卡病毒分离鉴定技术规范12范围本文件规定了猪A型塞内卡病毒分离鉴定方法、RT-LAMP及RT-PCR诊断方法。本文件适用于猪A型塞内卡病毒的病原分离和鉴定、实验室诊断、病毒检测、流行病学调查。规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和实验方法GB19489实验室生物安全通用要求NY/T541兽医诊断样本采集、保存与运输技术规范34术语和定义本文件没有需要界定的术语和定义。缩略语下列缩略语适用于本文件。CPE：细胞病变DMEM：细胞营养液DNAmarker：DNA相对分子质量标记FBS：胎牛血清HEPES：4-羟乙基哌嗪乙磺酸PBS：磷酸缓冲液PK-15：猪肾细胞RT-LAMP：逆转录环介导等温扩增RT-PCR：反转录-聚合酶链式反应SVA：猪A型塞内卡病毒5试剂与设备主要试剂5.15.1.1所用生化试剂均为分析纯。5.1.2实验用水应符合GB/T6682一级水要求或采用超纯水，并经高温灭菌。5.1.3PK-15细胞、DMEM培养基、胰蛋白酶、HEPES缓冲液(1mol/L储存液)、0.01mol/LpH7.0~7.41

DB51/T2905—2022PBS（参见附录A）；RNA提取试剂盒、反转录试剂盒、PCR反应混合液（2×）、LAMP反应各组分试剂。5.2主要仪器设备微量可调移液器、二氧化碳恒温箱、组织破碎仪、高速离心机、恒温水浴槽或恒温金属浴、PCR仪、稳压稳流电泳仪和水平电泳槽、凝胶成像仪、倒置生物显微镜。6样品的采集、保存与运输样品采集6.16.1.1水泡液采集用一次性注射器吸取临床发病猪只水泡液0.5mL~1mL，并将水泡液装入保存管，加青霉素至终浓度1000IU/mL、链霉素至终浓度500IU/mL，不能立即使用应置于-70℃冷冻保存；6.1.2水泡皮采集用0.01mol/LPBS（pH7.4）清洗水泡表面，然后用灭菌手术剪刀剪取水泡皮2g~5g，装入样品保存管，加适量50%甘油-PBS保存液，使保存液液面没过样品，不能立即使用应置于-70℃冷冻保存；6.1.3其他组织样品采集若采集不到典型的水泡皮，则采集病灶周围破溃组织或淋巴结、肺脏、扁桃体、肠道等组织5g~10g，装入样品保存管，加适量50%甘油-PBS保存液，使保存液液面没过样品，加盖封口，不能立即使用即放于-70℃冷冻保存。6.2保存与运输采集的样品应按照NY/T541要求包装和运输。7病毒的细胞分离培养7.1生物安全措施SVA分离鉴定时，应在高等级生物安全实验室操作，按照GB19489（所有部分）的规定执行。7.2样品的处理7.2.1水泡液样品处理水泡液4℃3000r/min离心10min，以0.22μm无菌滤膜过滤除菌后，-70℃保存备用；7.2.2水泡皮及其他组织样品处理取0.5g待检组织样品，加入1mL~1.5mLPBS，用组织破碎仪充分破碎，用含青、链霉素的DMEM作3:1（V/W）稀释。反复冻融3次后，4℃3000r/min离心10min，取上清液，以0.22μm无菌滤膜过滤除菌后，转入1.5mL离心管中，-70℃保存备用。7.3单层细胞制备2

DB51/T2905—2022按常规方法将PK-15细胞分装在25cm2细胞培养瓶中，每瓶加入含8%FBS的DMEM培养基5mL，细胞浓度应为2×105个/mL~3×105个/mL，培养48h。，37℃、5%CO2条件下培养48h。7.4样品接种取处理后的样品上清液0.2mL接种到生长状况良好的单层PK-15细胞上（5mL工作体积）。每份样品接种2瓶~4瓶细胞，另设细胞对照2瓶~4瓶。37°C吸附1h，弃上清，加入5mL含2%FBS的DMEM培养基，37°C、5%CO2条件下培养48h。7.5病毒收获每天观察记录CPE，通常在接种48h后可出现CPE，主要呈现细胞变圆，空泡增加，有死细胞漂浮在液面，最后溶解脱落。对照细胞单层应完好，细胞形态基本正常或稍有衰老。若出现CPE，将接毒细胞反复冻融三次，4°C3000r/min离心10min，收获病毒上清液，置-70°C保存，进行病毒核酸鉴定。若接种细胞第1代72h后未出现明显CPE，按上述收毒方法收获细胞/病毒液再接种生长良好的单层PK-15细胞进行盲传，即1mL第一代细胞/病毒液加4mL细胞维持液，37°C培养。如此盲传3代~5代，再进行鉴定。8病毒核酸鉴定8.1RT-LAMP和RT-PCR引物RT-LAMP和RT-PCR引物针对SVAVP1蛋白基因保守区域，引物序列见表1。表1引物序列检测方法引物序列(5′→3′)位置(bp)SVVF3SVVB3CCGATCTCGACTACTGAATGGAGAACGCCACTGTCAGAC2866～28863017～3036RT-LAMPCATCGTCCTGCTGTGCACCT-AGAAGGACGCCGTCTTCCTTCTAACACCCCGCCCAACA-TTGACGTACAGGCCGAAACSVVFIPSVVBIP2881～29412953～3013SVVFSVVRTACAGTTTGGCCTGTTTCACTCGCCCAGTAAAGTGGTAGGG3063～30833210～3229RT-PCR8.2核酸提取和反转录采用RNA提取试剂盒提取处理后的临床样品或收集到的细胞/病毒液核酸，或用自动化核酸提取仪提取，并使用反转录试剂盒将提取核酸反转录成cDNA，于-20℃保存备用。8.3RT-LAMP反应8.3.1RT-LAMP反应体系反应体系中各组分见表2，反应体系可根据表中各组分比例适当调整。3DB51/T2905—2022表2RT-LAMP反应体系反应试剂BstDNA聚合酶缓冲液RNA酶抑制剂（40U/μL）反转录酶（200U/μL）BstDNA聚合酶体积（µL）2.50.50.751甜菜碱（1mmol/L）MgSO4（8mmol/L）引物F3/B3（0.2μmol/L）引物FIP/BIP（1.6μmol/L）dNTPs（1.4mmol/L）RNA模板22各2各421ddH2O1.258.3.2RT-LAMP反应程序将8.4.1配制的反应体系置于65°C水浴或金属浴中反应45min，再置于80°C反应10min，产物4°C保存。8.4RT-PCR反应8.4.1RT-PCR反应体系反应体系见表3，反应体系可根据表中各组分比例适当调整。表3RT-PCR反应体系PCR反应试剂2×TaqPCRmasterMix上游引物：F（10µmol/L）下游引物：R（10µmol/L）cDNA模板体积（µL）50.50.51ddH2O38.4.2RT-PCR反应程序反应程序见表4。表4RT-PCR反应程序步骤预变性变性时间和温度(min、s/°C)5min、95°C30s、95°C循环数(个)1退火30s、56°C35延伸30s、72°C延伸7min、72°C18.5试验结果观察8.5.1RT-LAMP显色反应在每个RT-LAMP反应管内加入荧光染料SYBRGreenI0.5μL，涡旋混匀，在紫外光下观察。8.5.2琼脂糖凝胶电泳成像4DB51/T2905—2022取适量扩增产物在1%的琼脂糖凝胶中电泳，在凝胶成像仪中观察结果。9结果判定9.1RT-LAMP阳性对照出现1条梯状条带并发出绿色荧光，阴性对照无条带不显色，说明对照成立。若样品电泳结果出现与阳性对照一致条带，且显色反应样品管发出绿色荧光，判定为SVA核酸阳性；若样品电泳结果无条带，显色反应样品管无绿色荧光变化，判定为SVA核酸阴性。9.2RT-PCR阳性对照出现大小为167bp的特异性扩增条带，阴性对照无条带，说明对照成立。若样品电泳结果出现与阳性对照大小一致的特异性扩增条带，则判定为SVA核酸阳性；若样品电泳结果未出现特异性扩增条带，则判定为SVA核酸阴性。9.3病毒分离鉴定9.3.1对核酸阳性扩增产物进行测序，并将测序结果与附录B.2序列比对，进行确认；9.3.2若细胞发生CPE，同时8.1或8.2鉴定结果为阳性，且测序比对结果正确，则判定为SVA分离鉴定阳性。9.3.3若盲传3代后，细胞并未发生CPE，但8.1或8.2鉴定结果为阳性，则继续盲传至5代后，再进行RT-LAMP或RT-PCR核酸鉴定，若8.1或8.2鉴定结果仍为阳性，且测序比对结果正确，则判定为SVA分离鉴定阳性；若8.1或8.2鉴定结果变为阴性，则判定为SVA分离鉴定阴性。9.3.4若盲传3代后，细胞并未发生CPE，且8.1或8.2鉴定结果为阴性，则判定为SVA分离鉴定阴性。5

DB51/T2905—2022附录A（规范性）试剂配置A.1.01mol/LpH7.0~7.4PBSNaCl8gKCl0.2gNa2HPO4∙12H2OKH2PO4灭菌双蒸水3.58g0.27g800mLNaOH或者HCl调pH值7.0~7.4，灭菌双蒸水定容至1000mL,121℃、15min高压锅灭菌冷却，置常温或4℃备用。A.2电泳缓冲液TAE（50倍）三羟甲基甲烷碱（Trisbase）242g冰乙酸57.1mL10