特殊生境微生物资源及其应用课件

特殊生境微生物资源及其应用汇报人：黄加栋2014年12月4日特殊生境微生物资源及其应用汇报人：黄加栋1一、研究方向

我国国土幅员辽阔，各地生境差异较大。在一些盐碱、干旱、高温、高盐等特殊生境条件下，存在许多极有价值的微生物资源亟待研究。本课题组一直致力于微生物检测和特殊生境微生物菌种资源挖掘及应用研究，特殊生境菌株由于生长环境特殊而较普通生境微生物具有更为特殊的生物学活性，在微生物来源新药开发、污水处理及废弃物资源化利用方面具有广泛应用价值。

一、研究方向我国国土幅员辽阔，各地生境差2罗布泊海洋腾冲热泉高盐废水活性污泥罗布泊海洋腾冲热泉高盐废水活性污泥31.特殊生境中药用微生物筛选及检测

课题组与塔里木盆地生物资源保护利用省部共建国家重点实验室建立合作关系，从罗布泊等特殊生境中筛选获得具有不同生物学活性的菌株，通过分级沉淀、柱层析法分离纯化获得活性物质主要组分，经三氟乙酸水解、HPLC、GC、GS-MS、LC-MS、IR、NMR等技术鉴定并解析这些活性物质主要组分的结构，以人脐静脉血管内皮细胞以及ApoE-/-小鼠为模型，筛选能够调节血管内皮细胞凋亡、老化、炎性因子释放以及稳定动脉粥样硬化斑块的特殊生境来源微生物活性物质，初步阐明特殊生境微生物活性物质药物作用机制，构建微生物活性物质库，建立微生物活性物质筛选平台。1.特殊生境中药用微生物筛选及检测4多糖样品的纯化离子交换层析凝胶过滤层析多糖样品的纯化离子交换层析凝胶过滤层析5多糖样品HPLC纯度分析多糖样品HPLC纯度分析6多糖纯品酸水解后GC-MS分析多糖纯品NMR分析多糖纯品酸水解后GC-MS分析多糖纯品NMR分析72.剩余活性污泥的无害化及减量处理

①课题组以筛选获得的特殊生境微生物为基础，通过定向驯化及菌种改造，获得降解17α-乙炔基雌二醇等多种激素类污染物能力提高的菌株，为实现剩余活性污泥的无害化处理奠定研究基础。②课题组与企业合作，经多年驯化获得能够有效处理氯离子浓度超过20g/L的高盐度有机氯化物废水的活性污泥菌群，解决了非稀释条件下活性污泥法处理高盐度有机废水难以达标排放的行业难题。同时从这一超高盐度特殊生境的活性污泥中筛选得到产聚羟基脂肪酸酯（PHA）的菌株，可以利用经水解酸化的高盐度剩余活性污泥产物作为培养基发酵生产PHA，实现高盐度废水处理剩余活性污泥的资源化利用。2.剩余活性污泥的无害化及减量处理①课题组8皂化废水是以氯醇法合成环氧丙烷过程中所产生的废水，该方法以石灰乳或电石灰为皂化剂，因此废水中存有大量的饱和Ca(OH)2和皂化生成物CaCl2；该废水的特点是高温、高pH值、高盐、高SS、高COD。环氧丙烷产量200万吨/年，皂化废水：8000万m3/年。利用活性污泥法可有效处理皂化废水，但每年外排剩余活性污泥300,000m3，对环境造成二次污染。皂化废水是以氯醇法合成环氧丙烷过程中所产9高盐度环氧丙烷皂化废水有机物成分表MolecularformulaCASnumberNamePercentage(%)Concentration(mg/ml)C2H2Cl4O4885-02-3Bis(dichloromethyl)ether63.412.116CHCl367-66-3Trichloromethane25.710.537C11H22O2110-42-9Methyln-caprate6.42.624C11H22O224323-23-7methyldecanoicacid3.51.435C17H3614905-56-7Tetradecane,2,6,10-trimethyl-0.50.205C17H34O2506-12-7Heptadecanoicacid0.30.0573C17H34O2506-12-7Tetradecane,5,9,13-trimethyl-0.20.0382高盐度环氧丙烷皂化废水有机物成分表Molecularfor10SBR污泥驯化设备SBR污泥驯化设备11驯化污泥合成PHA策略驯化污泥合成PHA策略12驯化污泥合成PHA的过程污泥工厂短链脂肪酸废水PHAPHA污泥生产链驯化污泥合成PHA的过程污泥工厂短链脂肪酸废水PHAPHA污133.特殊生境微生物群落分析及功能基因资源挖掘提取来自不同特殊生境中各类样本的宏基因组DNA，通过T-RFLP、构建16SrDNA基因文库、DGGE等方法，分析样本中不同微生物的丰富度。今后拟对宏基因组DNA中16SrRNA的V4高变区直接测序。通过测序结果结合理化因素的分析揭示环境因素的变化是特殊生境中微生物群落组成差异的主导因素。并拟通过对样本宏基因组的全基因测序结合数据分析，深入挖掘样本中存在的特殊基因资源，为实现其体外高效表达奠定研究基础。3.特殊生境微生物群落分析及功能基因资源挖掘14利用27F-FAM和1492R荧光引物PCR电泳图1)T-RFLP活性污泥宏基因组DNA电泳图利用27F-FAM和1492R荧光引物PCR电泳图1)15T-RFLP结果分析T-RFLP结果分析16SamplingNo.MargalefindexShannonindexPielouindexSimpsonindexS11.30291.01050.51930.4381S20.86860.68740.42710.3029S30.65140.57590.41550.2657基于T-RFLP的微生物多样性分析SamplingMargalefShannonPielouS1716SrDNAPCR电泳图蓝白斑筛选平板2)构建16SrDNA基因文库16SrDNAPCR电泳图蓝白斑筛选平板2)构建16S183)16SrDNA-PCR-DGGEDGGE电泳图电泳条带DNA丰富度分析3)16SrDNA-PCR-DGGEDGGE电泳图电泳19二、学术队伍

团队成员9人，全部具有博士学位，其中1人为教授，5人为副教授，高职称人员比例达67%。团队中既有微生物检测方面的研究人员，也有微生物筛选及活性评价方面的研究人员，团队结构合理。二、学术队伍团队成员9人，全部具有博士学20团队学术队伍基本情况姓名出生年月学位专业技术职务研究方向工作单位黄加栋1974.2博士教授微生物检测生物科学与技术学院李强1977.1博士副教授环境微生物生物科学与技术学院刘素1981.7博士副教授微生物检测资源与环境学院葛慎光1980.2博士副教授微生物检测化学化工学院李玉梅1980.6博士副教授环境微生物生物科学与技术学院孟宁1982.10博士副教授化学生物学生物科学与技术学院王玉1982.6博士讲师分析化学生物科学与技术学院李连博1984.8博士讲师细胞生物学生物科学与技术学院罗琰1981.8博士讲师环境微生物生物科学与技术学院团队学术队伍基本情况姓名出生学位专业技研究方向工作单位黄加栋21三、科学研究

课题组近三年在国内外发70多篇高水平论文（其中影响因子5以上8篇，3以上31篇）。目前团队带头人已获2014年山东省自然科学杰出青年基金资助，力争在国家自然科学基金重点项目等有所突破。团队力争发表高水平科研论25-40篇，申请专利10-20项。三、科学研究课题组近三年在国内外发70多22代表性科研论文序号论文名称作者（*）发表时间发表刊物、会议名称或ISSN、检索号1Electrochemicalsensorusingneomycin-imprintedfilmasrecognitionelementbasedonchitosan-silvernanoparticles/graphene-multiwalledcarbonnanotubescompositesmodifiedelectrodeJiadongHuang(通信作者)2013BiosensorsandBioelectronics,2013,44:70-76.（SCI,IF=6.451）23.YuWang,Xiang-HuaDeng,ZhanWu,HaoTang,andJian-HuiJiang.SurfaceenhancedRamanscatteringbasedsensitivedetectionofhistonedemethylaseactivityusingformaldehyde-selectivereactiveprobe.YuWang2013ChemicalCommunications2013,49,8489-8491.(IF=6.169)3Electrochemicalsensorbasedongoldnanoparticlesfabricatedmolecularlyimprintedpolymerfilmatchitosan-platinumnanoparticles/graphene-goldnanoparticlesdoublenanocompositesmodifiedelectrodefordetectionoferythromycinJiadongHuang(通信作者)2012BiosensorsandBioelectronics,2012,38:163-169.（SCI,IF=5.361）4Anovellabel-freeelectrochemicalaptasensorbasedongraphene-polyanilinecompositefilmfordopaminedeterminationJiadongHuang(通信作者)2012BiosensorsandBioelectronics,2012,36:186-191.（SCI,IF=5.361）5Electrochemicalsensorbasedonmolecularlyimprintedfilmatpolypyrrole-sulfonatedgraphene/hyaluronicacid-multiwalledcarbonnanotubesmodifiedelectrodefordeterminationoftryptamineJiadongHuang(通信作者)2012BiosensorsandBioelectronics,2012,31:277-283.（SCI,IF=5.361）6StructuralInsightsontheBacteriolyticandSelf-protectionMechanismofMuramidaseEffectorTse3inPseudomonasaeruginosa，LianboLi（第一作者）2013JournalofBiologicalChemistry,0021-9258,288(42),30607-13.（SCI，IF=4.651）7Abutyrolactonederivativesuppressedlipopolysaccharide-inducedautophagicinjurythroughinhibitingtheautoregulatoryloopofp8andp53invascularendothelialcells.NingMeng（第一作者）2012IntJBiochemCellBiol,2012,44(2):311-9.

（SCI，IF=4.152）8Aptasensorbasedonthesynergisticcontributionsofchitosan-goldnanoparticles,grapheme-goldnanoparticlesandmulti-walledcarbonnanotubescobaltphthalocyaninenanocompositesforkanamycindetectionJiadongHuang(通信作者)2014Analyst,2014,139:299-308.（SCI，IF=3.906）9Amolecularly-imprintedelectrochemicalsensorbasedonagrapheme-Prussianbluecomposite-modifiedglassycarbonelectrodeforthedetectionofbutylatedhydroxyanisoleinfoodstuffsJiadongHuang(通信作者)2013Analyst,

2013,138:5949-5955.（SCI，IF=3.906）10OptimizationoffermentationconditionsandpropertiesofanexopolysaccharidefromKlebsiellasp.H-207andapplicationinadsorptionofhexavalentchromium.LiQiang（第一作者）.2013PLoSOne,

2013,8(1):e53542.（SCI,IF:3.73）代表性科研论文序号论文名称作者（*）发表时间发表刊物、会议名23代表性科研项目序号项目、课题名称（下达文件编号或项目编号）来源起讫时间承担人（*）经费（万元）1基于基因工程单链抗体的食品中小分子化学污染物快速检测压电免疫传感器研究(31171700)国家自然科学基金2012.01-2015.12黄加栋（主持）652基于纳米增效分子印迹膜的农药多残留高通量快速检测传感器微阵列研究（30972056）国家自然科学基金2010.01-2012.12黄加栋（主持）323基于糖基功能化分子印迹聚合物的细菌毒素检测生物传感器(30911140278)国家自然科学基金2009.06-2011.05黄加栋（主持）84农产品中痕量环境内分泌干扰物残留检测的纳米增效分子印迹仿生传感技术研究(30700535)国家自然科学基金2008.01-2010.12黄加栋（主持）185

土壤杆菌M503低分子量β-1，3-葡聚糖生物絮凝剂合成相关基因的克隆及功能分析（31100088）国家自然科学基金2012.01-2014.12李强（主持）226利用节杆菌B4胞外多糖研究多糖抑制铜绿假单胞菌生物膜形成的关键机制(31300045)国家自然科学基金2014.01-2016.12李玉梅（主持）237利用新型吡唑衍生物研究血管内皮细胞自噬与血管生成的关联机制(31200859)国家自然科学基金2013.1-2015.12孟宁（主持）238基于核酸适配子的海产品中有机砷检测分子印迹压电传感器国家自然科学基金2012.01-2014.12刘素（主持）249基于点击化学的微囊藻毒素化学传感器构建国家自然科学基金2013.01-2015.12葛慎光（主持）2510加工食品中生物危害物多元识别与控制技术科技部863项目2012.01-2015.12黄加栋（子课题负责人）64代表性科研项目序号项目、课题名称来源起讫时间承担人（*）经费24四、教学与人才培养

团队有6位成员具有指导研究生资格。在三年建设期中，力争指导研究生发表SCI收录论文20篇以上，指导学生参加挑战杯、国家级大学生科技创新计划、SRT等项目，并获得相应奖励。

四、教学与人才培养团队有6位成员具25五、学术交流

积极参加国际、国内学术会议。团队成员参加国际或国内高水平学术会议15-20人次以上，做大会报告5-8次或主办1次以上国内学术会议。五、学术交流积极参加国际、国内学术会议26六、条件建设

学院将根据团队建设发展需要，购置变性梯度凝胶电泳仪（DGGE）、实时定量PCR仪、荧光倒置显微镜等仪器设备，为团队发展提供良好的实验平台。六、条件建设学院将根据团队建设发27请各位领导和专家批评指正！谢谢！特殊生境微生物资源及其应用课件28特殊生境微生物资源及其应用汇报人：黄加栋2014年12月4日特殊生境微生物资源及其应用汇报人：黄加栋29一、研究方向

我国国土幅员辽阔，各地生境差异较大。在一些盐碱、干旱、高温、高盐等特殊生境条件下，存在许多极有价值的微生物资源亟待研究。本课题组一直致力于微生物检测和特殊生境微生物菌种资源挖掘及应用研究，特殊生境菌株由于生长环境特殊而较普通生境微生物具有更为特殊的生物学活性，在微生物来源新药开发、污水处理及废弃物资源化利用方面具有广泛应用价值。

一、研究方向我国国土幅员辽阔，各地生境差30罗布泊海洋腾冲热泉高盐废水活性污泥罗布泊海洋腾冲热泉高盐废水活性污泥311.特殊生境中药用微生物筛选及检测

课题组与塔里木盆地生物资源保护利用省部共建国家重点实验室建立合作关系，从罗布泊等特殊生境中筛选获得具有不同生物学活性的菌株，通过分级沉淀、柱层析法分离纯化获得活性物质主要组分，经三氟乙酸水解、HPLC、GC、GS-MS、LC-MS、IR、NMR等技术鉴定并解析这些活性物质主要组分的结构，以人脐静脉血管内皮细胞以及ApoE-/-小鼠为模型，筛选能够调节血管内皮细胞凋亡、老化、炎性因子释放以及稳定动脉粥样硬化斑块的特殊生境来源微生物活性物质，初步阐明特殊生境微生物活性物质药物作用机制，构建微生物活性物质库，建立微生物活性物质筛选平台。1.特殊生境中药用微生物筛选及检测32多糖样品的纯化离子交换层析凝胶过滤层析多糖样品的纯化离子交换层析凝胶过滤层析33多糖样品HPLC纯度分析多糖样品HPLC纯度分析34多糖纯品酸水解后GC-MS分析多糖纯品NMR分析多糖纯品酸水解后GC-MS分析多糖纯品NMR分析352.剩余活性污泥的无害化及减量处理

①课题组以筛选获得的特殊生境微生物为基础，通过定向驯化及菌种改造，获得降解17α-乙炔基雌二醇等多种激素类污染物能力提高的菌株，为实现剩余活性污泥的无害化处理奠定研究基础。②课题组与企业合作，经多年驯化获得能够有效处理氯离子浓度超过20g/L的高盐度有机氯化物废水的活性污泥菌群，解决了非稀释条件下活性污泥法处理高盐度有机废水难以达标排放的行业难题。同时从这一超高盐度特殊生境的活性污泥中筛选得到产聚羟基脂肪酸酯（PHA）的菌株，可以利用经水解酸化的高盐度剩余活性污泥产物作为培养基发酵生产PHA，实现高盐度废水处理剩余活性污泥的资源化利用。2.剩余活性污泥的无害化及减量处理①课题组36皂化废水是以氯醇法合成环氧丙烷过程中所产生的废水，该方法以石灰乳或电石灰为皂化剂，因此废水中存有大量的饱和Ca(OH)2和皂化生成物CaCl2；该废水的特点是高温、高pH值、高盐、高SS、高COD。环氧丙烷产量200万吨/年，皂化废水：8000万m3/年。利用活性污泥法可有效处理皂化废水，但每年外排剩余活性污泥300,000m3，对环境造成二次污染。皂化废水是以氯醇法合成环氧丙烷过程中所产37高盐度环氧丙烷皂化废水有机物成分表MolecularformulaCASnumberNamePercentage(%)Concentration(mg/ml)C2H2Cl4O4885-02-3Bis(dichloromethyl)ether63.412.116CHCl367-66-3Trichloromethane25.710.537C11H22O2110-42-9Methyln-caprate6.42.624C11H22O224323-23-7methyldecanoicacid3.51.435C17H3614905-56-7Tetradecane,2,6,10-trimethyl-0.50.205C17H34O2506-12-7Heptadecanoicacid0.30.0573C17H34O2506-12-7Tetradecane,5,9,13-trimethyl-0.20.0382高盐度环氧丙烷皂化废水有机物成分表Molecularfor38SBR污泥驯化设备SBR污泥驯化设备39驯化污泥合成PHA策略驯化污泥合成PHA策略40驯化污泥合成PHA的过程污泥工厂短链脂肪酸废水PHAPHA污泥生产链驯化污泥合成PHA的过程污泥工厂短链脂肪酸废水PHAPHA污413.特殊生境微生物群落分析及功能基因资源挖掘提取来自不同特殊生境中各类样本的宏基因组DNA，通过T-RFLP、构建16SrDNA基因文库、DGGE等方法，分析样本中不同微生物的丰富度。今后拟对宏基因组DNA中16SrRNA的V4高变区直接测序。通过测序结果结合理化因素的分析揭示环境因素的变化是特殊生境中微生物群落组成差异的主导因素。并拟通过对样本宏基因组的全基因测序结合数据分析，深入挖掘样本中存在的特殊基因资源，为实现其体外高效表达奠定研究基础。3.特殊生境微生物群落分析及功能基因资源挖掘42利用27F-FAM和1492R荧光引物PCR电泳图1)T-RFLP活性污泥宏基因组DNA电泳图利用27F-FAM和1492R荧光引物PCR电泳图1)43T-RFLP结果分析T-RFLP结果分析44SamplingNo.MargalefindexShannonindexPielouindexSimpsonindexS11.30291.01050.51930.4381S20.86860.68740.42710.3029S30.65140.57590.41550.2657基于T-RFLP的微生物多样性分析SamplingMargalefShannonPielouS4516SrDNAPCR电泳图蓝白斑筛选平板2)构建16SrDNA基因文库16SrDNAPCR电泳图蓝白斑筛选平板2)构建16S463)16SrDNA-PCR-DGGEDGGE电泳图电泳条带DNA丰富度分析3)16SrDNA-PCR-DGGEDGGE电泳图电泳47二、学术队伍

团队成员9人，全部具有博士学位，其中1人为教授，5人为副教授，高职称人员比例达67%。团队中既有微生物检测方面的研究人员，也有微生物筛选及活性评价方面的研究人员，团队结构合理。二、学术队伍团队成员9人，全部具有博士学48团队学术队伍基本情况姓名出生年月学位专业技术职务研究方向工作单位黄加栋1974.2博士教授微生物检测生物科学与技术学院李强1977.1博士副教授环境微生物生物科学与技术学院刘素1981.7博士副教授微生物检测资源与环境学院葛慎光1980.2博士副教授微生物检测化学化工学院李玉梅1980.6博士副教授环境微生物生物科学与技术学院孟宁1982.10博士副教授化学生物学生物科学与技术学院王玉1982.6博士讲师分析化学生物科学与技术学院李连博1984.8博士讲师细胞生物学生物科学与技术学院罗琰1981.8博士讲师环境微生物生物科学与技术学院团队学术队伍基本情况姓名出生学位专业技研究方向工作单位黄加栋49三、科学研究

课题组近三年在国内外发70多篇高水平论文（其中影响因子5以上8篇，3以上31篇）。目前团队带头人已获2014年山东省自然科学杰出青年基金资助，力争在国家自然科学基金重点项目等有所突破。团队力争发表高水平科研论25-40篇，申请专利10-20项。三、科学研究课题组近三年在国内外发70多50代表性科研论文序号论文名称作者（*）发表时间发表刊物、会议名称或ISSN、检索号1Electrochemicalsensorusingneomycin-imprintedfilmasrecognitionelementbasedonchitosan-silvernanoparticles/graphene-multiwalledcarbonnanotubescompositesmodifiedelectrodeJiadongHuang(通信作者)2013BiosensorsandBioelectronics,2013,44:70-76.（SCI,IF=6.451）23.YuWang,Xiang-HuaDeng,ZhanWu,HaoTang,andJian-HuiJiang.SurfaceenhancedRamanscatteringbasedsensitivedetectionofhistonedemethylaseactivityusingformaldehyde-selectivereactiveprobe.YuWang2013ChemicalCommunications2013,49,8489-8491.(IF=6.169)3Electrochemicalsensorbasedongoldnanoparticlesfabricatedmolecularlyimprintedpolymerfilmatchitosan-platinumnanoparticles/graphene-goldnanoparticlesdoublenanocompositesmodifiedelectrodefordetectionoferythromycinJiadongHuang(通信作者)2012BiosensorsandBioelectronics,2012,38:163-169.（SCI,IF=5.361）4Anovellabel-freeelectrochemicalaptasensorbasedongraphene-polyanilinecompositefilmfordopaminedeterminationJiadongHuang(通信作者)2012BiosensorsandBioelectronics,2012,36:186-191.（SCI,IF=5.361）5Electrochemicalsensorbasedonmolecularlyimprintedfilmatpolypyrrole-sulfonatedgraphene/hyaluronicacid-multiwalledcarbonnanotubesmodifiedelectrodefordeterminationoftryptamineJiadongHuang(通信作者)2012BiosensorsandBioelectronics,2012,31:277-283.（SCI,IF=5.361）6StructuralInsightsontheBacteriolyticandSelf-protectionMechanismofMuramidaseEffectorTse3inPseudomonasaeruginosa，LianboLi（第一作者）2013JournalofBiologicalChemistry,0021-9258,288(42),30607-13.（SCI，IF=4.651）7Abutyrolactonederivativesuppressedlipopolysaccharide-inducedautophagicinjurythroughinhibitingtheautoregulatoryloopofp8andp53invascularendothelialcells.NingMeng（第一作者）2012IntJBiochemCellBiol,2012,44(2):311-9.

（SCI，IF=4.152）8Aptasensorbasedonthesynergisticcontributionsofchitosan-goldnanoparticles,grapheme-goldnanoparticlesandmulti-walledcarbonnanotubescobaltphthalocyaninenanocompositesforkanamycindetectionJiadongHuang(通信作者)2014Analyst,2014,139:299-308.（SCI，IF=3.906）9Amolecularly-imprintedelectrochemicalsensorbasedonagrapheme-Prussianbluecomposite-modifiedglassycarbonelectrodeforthedetectionofbutylatedhydroxyanisoleinfoodstuffsJiadongHuang(通信作者)2013Analyst,

2013,138:5949-5955.（SCI，IF=3.906）10Optimizationoffermentationconditionsandpropertiesofanexop