糖尿病的基因诊断课件

糖尿病的基因诊断Genediagnosisofdiabetesmellitus糖尿病的基因诊断Genediagnosisofdi基因突变线粒体基因突变胰岛素基因突变胰岛素受体基因突变其他基因突变葡萄糖激酶基因突变基因突变线粒体胰岛素胰岛素受体其他葡萄糖激酶

线粒体DNA(mtDNA)tRNAleu(UUR)基因的二氢尿嘧啶环上核苷酸nt3243A

G突变。nt3243AyG点突变常导致母系遗传糖尿病伴耳聋、MELAS(线粒体脑肌病、乳酸酸中毒、癫痫样发作综合征)

基因突变线粒体基因突变基因突变线粒体mtDNA突变影响ATP生成细胞内线粒体代谢水平特殊类型糖尿病基因突变线粒体基因突变mtDNA突变影响ATP生成细胞内线粒体代谢水平特殊类型糖尿基因突变胰岛素基因突变可以导致异常胰岛素病、永久性新生儿糖尿病(PNDM)、青少年成人起病型糖尿病(MODY)以及部分自身抗体阴性的1型糖尿病。胰岛素基因突变基因突变胰岛素基因突变

应用聚合酶链反应—单链构象多态性(PCR—SSCP)及等位基因特异性寡核苷酸斑点杂交技术对INS基因进行分析，发现有Arg65→His、Arg65→leu以及Hisl00→Asp等点突变。胰岛素基因突变基因突变胰岛素

对INSR基因的全部外显子筛查后发现，外显子2，3，8，9，13，17中有无义突变，外显子20中存在一个异质性点突变。

该突变位于酪氨酸激酶区内，影响受体细胞内亚基的结构，是引起遗传性胰岛素抵抗（insulinresistance，IR）的主要原因。基因突变胰岛素受体基因突变对INSR基因的全部外显子筛查后发现，外显

GCK突变失活突变完全性失活突变（PNDM）部分性失活突变（MODY2）激活突变持续性高胰岛素血症低血糖(PHHI)基因突变葡萄糖激酶基因突变GCK突变失活突变完全性失活突变部分性失活突变激活突变持续性基因突变

葡萄糖激酶基因突变从GCK的三维结构来看，突变的部位及功能的影响可分为突变位于酶活性区裂隙(GCK的活性区位于大小结构域间的裂隙内)及引伸人裂隙的肽链曲上。突变远离活性区在底物诱导酶的构象改变的部位，这一类突变对酶活性的影响较前一类突变为小。基因突变葡萄糖激酶从GCK的三维结构来看，突变的部位及功基因突变1．己糖激酶Ⅱ(hexokinaseⅡ，HK2)基因突变2．磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶基因突变3．糖原合成酶(glycogensynthetase，GSY)基因突变4．载脂蛋白基因群及低密度脂蛋白受体基因突变其他基因突变基因突变1．己糖激酶Ⅱ(hexokinaseⅡ，HK2)基因糖尿病相关基因诊断技术

＊C肽试验

＊PCR-SSCP

＊PCR-DGGE糖尿病相关基因诊断技术

C肽是胰岛β细胞的分泌产物，它与胰岛素有一个共同的前体——胰岛素原。一个分子的胰岛素原在PC2和PC3的作用下，裂解成一个分子的胰岛素和一个分子的C肽，因此在理论上C肽和胰岛素是等同分泌的，血中游离的C肽生理功能尚不很清楚，但C肽不被肝脏破坏，半衰期较胰岛素明显为长，故测定C肽水平更能反应β细胞合成与释放胰岛素功能。

C肽水平测定C肽是胰岛β细胞的分泌产物，它与胰岛素有一个共PCP-SSCP原理：

在非变性条件下，DNA单链可自身折叠形成具有一定空间结构的构象。这种构象由DNA单链碱基决定，其稳定性靠分子内局部顺序的相互作用（主要为氢键）来维持。相同长度的DNA单链其顺序不同，甚至单个碱基不同，所形成的构象不同，电泳迁移率也不同。PCR-SSCPPCP-SSCPPCR-SSCP步骤：

PCR-SSCP1PCR扩增2变性3非变性聚丙烯酰胺电泳步骤：PCR-SSCP1PCR扩增2变性3非变性聚丙烯酰胺电

PCR-DGGEDGGE(变性梯度凝胶电泳)

是一种根据DNA片段的熔解性质而使之分离的凝胶系统。核酸的双螺旋结构在一定条件下可以解链，称之为变性。当一双链DNA片段通过一变性剂浓度呈梯度增加的凝胶时，此片段迁移至某一点变性剂浓度恰好相当于此段DNA的低熔点区的Tm值，此区便开始熔解，而高熔点区仍为双链。这种局部解链的DNA分子迁移率发生改变，达到分离的效果。Tm的改变依赖于DNA序列，即使一个碱基的替代就可引起Tm值的升高和降低。 PCR-DGGE

PCR-DGGE步骤：1PCR反应2产物经琼脂糖凝胶电泳确认4平行变性梯度凝胶电泳5垂直变性梯度凝胶电泳 PCR-DGGE步骤：1PCR反应2产物经琼脂糖凝胶电泳确PAX6？？？PAX6？？？

PAX6PDLNKPDPDHDLNKLNKHDHDPSTHum-mutPAX6Mou-mutPAX6Wild-typePAX6240aa266aa269aa420aa PAX6PDLNKPDPDHDLNKLNKHDHDPST参与胰腺分泌高血糖素的α细胞分化、成熟β细胞的分化及其胰岛素的表达

PAX6参与胰腺分泌高血糖素的α细胞分化、成熟β细胞的分化及其胰岛素

PAX6胰腺的发育胰高血糖素生长激素抑制素胰多肽胰岛素αδβγ PAX6胰腺的发育胰高血糖素生长激素抑制素胰多肽胰岛素α

Pax6成对结构域PD和同源结构域HD高血糖素启动子反应元件G1和G3Pax6的转录活性被激活直接相连、相互作用,激发Pax6的活性空间构象HD的结合位点PD的结合位点+

PAX6Pax6对高血糖素的作用+Pax6成对结构域PD和同源结构域HD高血糖素启动子反应元

此外，过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxidaseproliferator—activatedreceptorγ，PPARγ)—

RXR异二聚体与转录激活因子Pax6相互作用可抑制Pax6的转录活性，从而抑制高血糖素基因的转录。Pax6对高血糖素的作用

PAX6Pax6对高血糖素的作用 PAX6

PAX6Pax6与糖代谢及糖尿病的关系Pax6突变对胰岛素分泌的影响Pax6突变对肠促胰岛素表达的影响 PAX6Pax6与糖代谢及糖尿病的关系Pax6突变对胰岛

PAX6突变基因携带者更易患糖尿病糖耐量实验中，突变基因携带者将血糖降至正常水平的能力比正常小鼠差胰岛素负荷实验中，突变基因携带者除了不能将血糖升至正常水平外，链脲霉素诱发糖尿病所需时间也比正常小鼠Pax6突变对胰岛素分泌的影响 PAX6突变基因携带者更易患糖尿病糖耐量实验中，突变基因

PAX6Pax6突变对胰岛素分泌的影响PAX6PC1/3启动子PC1/3被激活突变PC1/3表达上调PC1/3缺乏胰岛素原加工缺陷,胰岛素生成减少糖耐量异常 PAX6Pax6突变对胰岛素分泌的影响PAX6PC1/3

PAX6GLP-1GIP内源性Pax6或Pdx-1的抑制外源性Pax6或Pdx-1STC-1IEC-6GIP启动子活性高血糖素原基因Pax-6+Pax6突变对肠促胰岛素的影响 PAX6GLP-1GIP内源性Pax6外源性Pax6S刺激胰岛素分泌抑制高血糖素分泌延缓胃排空GLP-1的作用：Pax6突变对肠促胰岛素的影响刺激胰岛素分泌抑制高血糖素分泌延缓胃排空GLP-1的作用：P

Pax6是在胰腺发育、仅细胞分化、高血糖素基因的转录和激活、B细胞功能以及胰岛素的表达中起关键作用的转录因子，其突变或变异已成为糖耐量异常及早发糖尿病的致病原因或易感位点。随着对Pax6研究的深入，其可能成为糖尿病药物基因组学的靶点之一。

PAX6conclusion PAX6conclusion＊《Pax6基因突变与胰腺发育和糖尿病发生关系的研究进展》（陆玉凤、刘丽梅）《上海交通大学学报》2011年5月＊《Pax6突变杂合子小鼠糖代谢异常的分子机制》（陈园园、洪天配、文锦华、丁钧、高翔、李凌松）《中国糖尿病杂志》2009年5月＊《Pax6基因突变的无虹膜症患者中糖代谢异常的病理生理学特征》（陈园园、宋书娟、洪天配、刘英芝、任国成、李凌松）《中国糖尿病杂志》2009年5月＊Pairedbox6(PAX6)regulatesglucosemetabolismviaproinsulinprocessingmediatedbyprohormoneconvertase1/3(PC1/3)

摘自Diabetologia2009年＊《Pax6基因突变与胰腺发育和糖尿病发生关系的研究进展》＊《线粒体基因突变所致糖尿病发生机制及治疗进展》（马丽晶、徐勉）《医学综述》2010年1月＊《胰岛素基因突变与糖尿病关系的研究进展》（李灿、刘丽梅）

《上海交通大学学报》2013年3月＊《胰岛素受体基因在二型糖尿病的研究进展》（毛晓明、张家庆）《国外医学》1993年6月＊《葡糖糖激酶基因突变与功能学研究进展》（沈云峰、翁建平）《国际内科学杂志》2008年12月＊《线粒体基因突变所致糖尿病发生机制及治疗进展》（马丽晶、Thankyou!组员：苏文杰王俊翔陈天文解心怡朱馨玉沈杰夏波高进陈颖曹倩QQ:1270939493Telhankyou!组员：苏文杰沈杰QQ:12709

糖尿病的基因诊断Genediagnosisofdiabetesmellitus糖尿病的基因诊断Genediagnosisofdi基因突变线粒体基因突变胰岛素基因突变胰岛素受体基因突变其他基因突变葡萄糖激酶基因突变基因突变线粒体胰岛素胰岛素受体其他葡萄糖激酶

线粒体DNA(mtDNA)tRNAleu(UUR)基因的二氢尿嘧啶环上核苷酸nt3243A

G突变。nt3243AyG点突变常导致母系遗传糖尿病伴耳聋、MELAS(线粒体脑肌病、乳酸酸中毒、癫痫样发作综合征)

基因突变线粒体基因突变基因突变线粒体mtDNA突变影响ATP生成细胞内线粒体代谢水平特殊类型糖尿病基因突变线粒体基因突变mtDNA突变影响ATP生成细胞内线粒体代谢水平特殊类型糖尿基因突变胰岛素基因突变可以导致异常胰岛素病、永久性新生儿糖尿病(PNDM)、青少年成人起病型糖尿病(MODY)以及部分自身抗体阴性的1型糖尿病。胰岛素基因突变基因突变胰岛素基因突变

应用聚合酶链反应—单链构象多态性(PCR—SSCP)及等位基因特异性寡核苷酸斑点杂交技术对INS基因进行分析，发现有Arg65→His、Arg65→leu以及Hisl00→Asp等点突变。胰岛素基因突变基因突变胰岛素

对INSR基因的全部外显子筛查后发现，外显子2，3，8，9，13，17中有无义突变，外显子20中存在一个异质性点突变。

该突变位于酪氨酸激酶区内，影响受体细胞内亚基的结构，是引起遗传性胰岛素抵抗（insulinresistance，IR）的主要原因。基因突变胰岛素受体基因突变对INSR基因的全部外显子筛查后发现，外显

GCK突变失活突变完全性失活突变（PNDM）部分性失活突变（MODY2）激活突变持续性高胰岛素血症低血糖(PHHI)基因突变葡萄糖激酶基因突变GCK突变失活突变完全性失活突变部分性失活突变激活突变持续性基因突变

葡萄糖激酶基因突变从GCK的三维结构来看，突变的部位及功能的影响可分为突变位于酶活性区裂隙(GCK的活性区位于大小结构域间的裂隙内)及引伸人裂隙的肽链曲上。突变远离活性区在底物诱导酶的构象改变的部位，这一类突变对酶活性的影响较前一类突变为小。基因突变葡萄糖激酶从GCK的三维结构来看，突变的部位及功基因突变1．己糖激酶Ⅱ(hexokinaseⅡ，HK2)基因突变2．磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶基因突变3．糖原合成酶(glycogensynthetase，GSY)基因突变4．载脂蛋白基因群及低密度脂蛋白受体基因突变其他基因突变基因突变1．己糖激酶Ⅱ(hexokinaseⅡ，HK2)基因糖尿病相关基因诊断技术

＊C肽试验

＊PCR-SSCP

＊PCR-DGGE糖尿病相关基因诊断技术

C肽是胰岛β细胞的分泌产物，它与胰岛素有一个共同的前体——胰岛素原。一个分子的胰岛素原在PC2和PC3的作用下，裂解成一个分子的胰岛素和一个分子的C肽，因此在理论上C肽和胰岛素是等同分泌的，血中游离的C肽生理功能尚不很清楚，但C肽不被肝脏破坏，半衰期较胰岛素明显为长，故测定C肽水平更能反应β细胞合成与释放胰岛素功能。

C肽水平测定C肽是胰岛β细胞的分泌产物，它与胰岛素有一个共PCP-SSCP原理：

在非变性条件下，DNA单链可自身折叠形成具有一定空间结构的构象。这种构象由DNA单链碱基决定，其稳定性靠分子内局部顺序的相互作用（主要为氢键）来维持。相同长度的DNA单链其顺序不同，甚至单个碱基不同，所形成的构象不同，电泳迁移率也不同。PCR-SSCPPCP-SSCPPCR-SSCP步骤：

PCR-SSCP1PCR扩增2变性3非变性聚丙烯酰胺电泳步骤：PCR-SSCP1PCR扩增2变性3非变性聚丙烯酰胺电

PCR-DGGEDGGE(变性梯度凝胶电泳)

是一种根据DNA片段的熔解性质而使之分离的凝胶系统。核酸的双螺旋结构在一定条件下可以解链，称之为变性。当一双链DNA片段通过一变性剂浓度呈梯度增加的凝胶时，此片段迁移至某一点变性剂浓度恰好相当于此段DNA的低熔点区的Tm值，此区便开始熔解，而高熔点区仍为双链。这种局部解链的DNA分子迁移率发生改变，达到分离的效果。Tm的改变依赖于DNA序列，即使一个碱基的替代就可引起Tm值的升高和降低。 PCR-DGGE

PCR-DGGE步骤：1PCR反应2产物经琼脂糖凝胶电泳确认4平行变性梯度凝胶电泳5垂直变性梯度凝胶电泳 PCR-DGGE步骤：1PCR反应2产物经琼脂糖凝胶电泳确PAX6？？？PAX6？？？

PAX6PDLNKPDPDHDLNKLNKHDHDPSTHum-mutPAX6Mou-mutPAX6Wild-typePAX6240aa266aa269aa420aa PAX6PDLNKPDPDHDLNKLNKHDHDPST参与胰腺分泌高血糖素的α细胞分化、成熟β细胞的分化及其胰岛素的表达

PAX6参与胰腺分泌高血糖素的α细胞分化、成熟β细胞的分化及其胰岛素

PAX6胰腺的发育胰高血糖素生长激素抑制素胰多肽胰岛素αδβγ PAX6胰腺的发育胰高血糖素生长激素抑制素胰多肽胰岛素α

Pax6成对结构域PD和同源结构域HD高血糖素启动子反应元件G1和G3Pax6的转录活性被激活直接相连、相互作用,激发Pax6的活性空间构象HD的结合位点PD的结合位点+

PAX6Pax6对高血糖素的作用+Pax6成对结构域PD和同源结构域HD高血糖素启动子反应元

此外，过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxidaseproliferator—activatedreceptorγ，PPARγ)—

RXR异二聚体与转录激活因子Pax6相互作用可抑制Pax6的转录活性，从而抑制高血糖素基因的转录。Pax6对高血糖素的作用

PAX6Pax6对高血糖素的作用 PAX6

PAX6Pax6与糖代谢及糖尿病的关系Pax6突变对胰岛素分泌的影响Pax6突变对肠促胰岛素表达的影响 PAX6Pax6与糖代谢及糖尿病的关系Pax6突变对胰岛

PAX6突变基因携带者更易患糖尿病糖耐量实验中，突变基因携带者将血糖降至正常水平的能力比正常小鼠差胰岛素负荷实验中，突变基因携带者除了不能将血糖升至正常水平外，链脲霉素诱发糖尿病所需时间也比正常小鼠Pax6突变对胰岛素分泌的影响 PAX6突变基因携带者更易患糖尿病糖耐量实验中，突变基因

PAX6Pax6突变对胰岛素分泌的影响PAX6PC1/3启动子PC1/3被激活突变PC1/3表达上调PC1/3缺乏胰岛素原加工缺陷,胰岛素生成减少糖耐量异常 PAX6Pax6突变对胰岛素分泌的影响PAX6PC1/3

PAX6GLP-1GIP内源性Pax6或Pdx-1的抑制外源性Pax6或Pdx-1STC-1IEC-6GIP启动子活性高血糖素原基因Pax-6+Pax6突变对肠促胰岛素的影响 PAX6GLP-1GIP内源性Pax6外源性Pax6S刺激胰岛素分泌抑制高血糖素分泌延缓胃排空GLP-1的作用：Pax6突变对肠促胰岛素的影响刺激胰岛素分泌抑制高血糖素分泌延缓胃排空GLP-1的作用：P

Pax6是在胰腺发育、仅细胞分化、高血糖素基因的转录和激活、B细胞功能以及胰岛素的表达中起关键作用的转录因子，其突变或变异已成为糖耐量异常及早