抗体工程蛋白质工程培训课件

抗体工程蛋白质工程抗体工程蛋白质工程1（优选）抗体工程蛋白质工程（优选）抗体工程蛋白质工程2淋巴细胞杂交瘤产生单克隆抗体淋巴细胞杂交瘤产生单克隆抗体3抗体工程蛋白质工程培训课件4如何大量生产单克隆抗体？利用B淋巴细胞产生抗体的功能。利用肿瘤细胞无限增殖的特性。利用细胞融合的技术将两种细胞融合获得具有B淋巴细胞和肿瘤细胞特性的杂交瘤细胞。利用动物细胞培养技术大量培养杂交瘤细胞。如何大量生产单克隆抗体？利用B淋巴细胞产生抗体的功能。5单克隆抗体的概念由单个杂交瘤细胞进行无性繁殖,也就是通过克隆，形成细胞群，这一细胞群所产生的化学性质单一、特异性强的抗体称为单克隆抗体。单克隆抗体的概念6

单克隆抗体制备过程

注射抗原B淋巴细胞骨髓瘤细胞细胞融合、筛选杂交瘤细胞细胞培养筛选，继续培养足够数量的、能产生特定抗体的细胞群体外培养注射到小鼠腹腔单克隆抗体如何获得融和细胞？如何得到单个融和细胞？如何筛选杂交瘤细胞？鉴别是否分泌所需抗体?单克隆抗体制备过程注射抗原B淋巴细胞骨髓瘤细胞细胞融7杂交瘤细胞的筛选(1)骨髓瘤细胞为HGPRT基因缺陷型细胞，不能合成DNA。需经应急途径合成DNA。HAT培养基含有次黄嘌呤，氨基喋呤和胸腺嘧啶。氨基喋呤可阻断骨髓瘤细胞的应急DNA合成。所以骨髓瘤细胞不能在HAT培养基中生长存活.B淋巴细胞具有HGPRT基因但不能在体外生长。利用这两种细胞各自的特点，筛选能在体外含HAT的培养基中生长的融合子。HGPRT:次黄嘌呤核糖磷酸转移酶

HAT：次黄嘌呤，氨基喋呤，胸腺嘧啶杂交瘤细胞的筛选(1)骨髓瘤细胞为HGPRT基因缺陷型细胞，8杂交瘤细胞的筛选(2)杂交瘤细胞的筛选(2)9抗体工程蛋白质工程培训课件10整个制备过程为何要经过两次筛选?第一次筛选：用特定的选择培养基筛选出多种杂交瘤细胞第二次筛选（克隆化培养和抗体检测）：筛选出能产生所需抗体的杂交瘤细胞。整个制备过程为何要经过两次筛选?第一次筛选：用特定的选择培养11思考：1、本过程利用了哪些原理？免疫原理，细胞融合原理和动物细胞培养原理2、为什么选用小鼠骨髓瘤细胞与B细胞融合？这样融合成的杂交瘤细胞，继承了双亲细胞的遗传物质，不仅具有B细胞分泌抗体的能力，而且还有无限增殖的本领，因而可以获得大量单克隆抗体思考：1、本过程利用了哪些原理？免疫原理，细胞融合原理和动物12鉴定后的杂交瘤细胞可大规模培养，收集上清提取单克隆抗体，也可免疫小鼠腹腔，抽取腹水来制备相应的McAb，但生产规模和产量均受限制。鉴定后的杂交瘤细胞可大规模培养，收集上清提取单克隆抗体，也可13单克隆抗体的优势1．高特异性，针对一个抗原靶点。。2．高纯度，成份均一，来自一个克隆。3．高效价，抗体的滴度高。4．高效益，国际上近100亿美元市场。5．易制备。6．前景好，McAb1995问世后，风糜全球，寄予厚望。单克隆抗体的优势1．高特异性，针对一个抗原靶点。。14单克隆抗体应用领域1．McAb作为诊断试剂应用这是目前应用最广的领域，目前已有许多成套的诊断试剂盒在诊断传染病，代谢病和免疫性疾病中应用，取得良好经济和社会效益，全世界有上百亿市场。举例早孕试纸，乙肝诊断试剂盒单克隆抗体应用领域1．McAb作为诊断试剂应用15（α-FcγRI-RicinA）从杂交瘤细胞分离出鼠MAb功能性可变区基因，与人Ig恒定区（决定免疫原性）基因连接，插入适当表达载体，转染宿主细胞，表达人鼠嵌合抗体。鉴定后的杂交瘤细胞可大规模培养，收集上清提取单克隆抗体，也可免疫小鼠腹腔，抽取腹水来制备相应的McAb，但生产规模和产量均受限制。直接法：直接测定多肽链的氨基酸顺序。选择目的抗体把含有抗体的噬菌体培养上清加到抗原固相柱上，使表面呈现特异性抗体的噬菌体与抗原特异性结合，洗去未结合的噬菌体。即可获得含量丰富、种类众多的单一抗体技术。2．噬菌体表达载体的构建蛋白质工程是在基因工程的基础上，延伸出来的第二代基因工程。化学交联法基因工程在原则上只能生产自然界已存在的蛋白质。Pr鼠VH人CHPr鼠VL人CL为了模拟此选择作用，在体外用固化抗原柱筛选噬菌表面抗体，再利用噬菌体能感染大肠杆菌特性，确重新感染细菌进行扩增。将编码一种蛋白质的部分基因移植到另一种蛋白质基因上，或将不同蛋白质基因的片段组合在一起，经基因克隆和表达，产生出新的融合蛋白质。将抗体VH和VL（重链和轻链可变区）通过一个连接肽连接而成的小分子抗体，以体外人结肠腺癌细胞和多形胶质瘤细胞为模型，采用3H－胸腺嘧啶核苷掺入法证明该融合蛋白抑制肿瘤细胞生长的活性显著高于单纯的IFN，通过竞争阻断实验证明，抑制活性的增高确由Enk导向区介导。核磁共振(NMR)光谱——研究处在溶液状态的蛋白质的结构。嵌合抗体由于这两部分在空间结构上相对独立，其独特的抗体亲和力保持得很好。肿瘤的影像分布用于肿瘤的导向治疗化学合成EnkN端5肽编码区，通过连接5肽编码区与人α1型IFN基因连接，在大肠杆菌中表达了这一融合蛋白。2．抗体导向治疗

用特异性单抗为载体，将抗瘤药物、放射性核素以及毒素等毒性物质导向性携带至肿瘤灶局部，可特异性杀伤肿瘤细胞，而对正常细胞损伤较轻。将毒素与单抗连接常称为免疫毒素。常用的毒素包括植物毒素（如蓖麻毒素、苦瓜毒素等）和细菌毒素（如白喉外毒素、绿脓杆菌外毒素等）。（α-FcγRI-RicinA）2．抗体导向治疗16抗体工程蛋白质工程培训课件173．McAb作免疫抑制剂应用，应用于器官移植。当前McAb最具代表的是抗TNF单抗治疗类风湿和回肠炎有效，有20亿美元市场。其他在抗肿瘤，抗排异及抗血栓方面也很看好。3．McAb作免疫抑制剂应用，应用于器官移植。181980年后，其开发走向下坡路，临床实验失败，股票狂跌，损失以百万美元计。原因病人过敏及免疫性疾病加重病人病情，体内很快排异及对肾脏毒性。但到2000年又有回头，2001年被认为在免疫学上是“单克隆抗体年”，抗体研究将迅速发展，现单在治疗方面就有10种单抗进入市场，3种待批上市，近100种在进行临床试验阶段。当然，与McAb技术改进关系极大。1980年后，其开发走向下坡路，临床实验失败，股票狂跌，损失19资料：目前世界各国已经研制出数以百计的单克隆抗体。许多缺乏良好诊断手段的传染病、免疫性疾病、血液病、内分泌疾病和遗传病，用单克隆抗体作为诊断手段，是一个必然趋势。另外，用单克隆抗体做体内诊断，借以鉴别和定位体内“病灶”也引起人们的注意，目前，主要用于肿瘤追踪及心肌梗塞的诊断。资料：目前世界各国已经研制出数以百计的单克隆抗体。许多缺20

问题异源蛋白导致产生抗抗体，影响靶向性和效果在体内被清除速度快靶部位摄取的量太低效应功能弱产业化

对策抗体人源化抗体人源化改变抗体分子大小连接毒素、放射性同位素、药物体外表达抗体抗体治疗存在的问题及对策问题对21基因工程抗体通过基因重组改良抗体性能通过噬菌体抗体库技术研制新的抗体基因工程抗体通过基因重组改良抗体性能22免疫球蛋白分子的基本结构免疫球蛋白分子的基本结构23第二节

鼠单抗人源化第二节

鼠单抗人源化24●恒定区人源化——人-鼠嵌合抗体●可变区人源化——人改型抗体●用抗体库技术进行人源化●恒定区人源化——人-鼠嵌合抗体25第一代的抗体人源化—嵌合抗体从杂交瘤细胞分离出鼠MAb功能性可变区基因，与人Ig恒定区（决定免疫原性）基因连接，插入适当表达载体，转染宿主细胞，表达人鼠嵌合抗体。嵌合抗体由于这两部分在空间结构上相对独立，其独特的抗体亲和力保持得很好。特点减少了鼠源性抗体的免疫原性，同时保留了亲本抗体特异性结合抗原的能力。缺点因鼠单抗可变区的存在，应用时仍有较强的免疫排斥反应第一代的抗体人源化—嵌合抗体26Pr鼠VH人CHPr鼠VL人CL免疫球蛋白基因载体的构建H链嵌合载体L链嵌合载体共转染细胞启动子人-鼠嵌合抗体基因工程改造策略Pr鼠VH人CH27鼠VH鼠VL人CL人CH抗体分泌细胞人-鼠嵌合基因工程抗体鼠VH鼠VL人CL人CH抗体分泌细胞人-鼠嵌合基因工程抗体28①定点突变注意尽量保护保守的残基，特别在高特异性、高活性蛋白操作时更应注意。②3ˊ端引物常选J区保守序列。从杂交瘤细胞分离出鼠MAb功能性可变区基因，与人Ig恒定区（决定免疫原性）基因连接，插入适当表达载体，转染宿主细胞，表达人鼠嵌合抗体。建立肽库（peptidelibrary）。2．噬菌体表达载体的构建4．高效益，国际上近100亿美元市场。利用B淋巴细胞产生抗体的功能。连接细胞毒性药物（C1027、柔红霉素）对天然蛋白质进行改造，你认为应该直接对蛋白质分子进行操作，还是通过对基因的操作来实现？基因定点诱变技术的常用方法是PCR法。基因工程在原则上只能生产自然界已存在的蛋白质。中改是对蛋白质分子中某些结构单元或肽段进行分子裁剪，通过基因操作，在不同的蛋白质分子之间替换结构单元，以期得到新的功能组合。比如TNFa抗体与TNFRFc●可变区人源化——人改型抗体将外源多肽或蛋白与噬菌体的衣壳蛋白融合表达，融合蛋白展示在病毒颗粒的表面，而编码该融合子的DNA则位于病毒粒子内。（优选）抗体工程蛋白质工程玉米中赖氨酸含量可提高数倍Met/Ala(222),成功地制备出具有耐碱、耐热以及抗氧化的各种新特性的蛋白酶。从杂交瘤细胞分离出鼠MAb功能性可变区基因，与人Ig恒定区（决定免疫原性）基因连接，插入适当表达载体，转染宿主细胞，表达人鼠嵌合抗体。3．抗肿瘤肿瘤和其他疾病的导向治疗和资料：目前世界各国已经研制出数以百计的单克隆抗体。第二代的抗体人源化——改型抗体在嵌合抗体的基础上进一步将鼠MAb可变区中相对保守的FR(frameworkregion)替换成人的FR，保留与抗原结合部位决定簇互补区（complementdeterminantregion)部位(即CDR移植)早期的改型抗体简单的CDR移植，通过点突变进行微调即更换某个位点上的氨基酸。①定点突变注意尽量保护保守的残基，特别在高特异性、高活性蛋29CDR序列CDR序列鼠单克隆抗体人抗体人源化抗体鼠单克隆V区人源化（CDR移植）CDR序列CDR序列鼠单克隆抗体人抗体人源化抗体鼠单克30第二代改型抗体：①应用了人抗体基因库；②引进计算机技术模拟抗体分子的立体结构(分子模拟法)；③使用了鼠人嵌合FR。其目的是获得具有高亲和力的治疗性抗体

第二代改型抗体：3132已批准上市的单抗适用病症靶抗原抗体名称抗体来源临床阶段移植排斥大肠癌冠心病淋巴瘤移植排斥炎症性肠病、类风湿CD317-1A血小板受体ⅡbⅢaCD20CD25TNF-аOKT3PanorexReoProRituxanSimulectRemicade鼠单抗鼠单抗人－鼠嵌合抗体人－鼠嵌合抗体人－鼠嵌合抗体人－鼠嵌合抗体19861995(德国)1994199719981998、199932已批准上市的单抗适用病症靶抗原抗体名称抗体来源临床阶段移3233适用病症靶抗原抗体名称抗体来源临床阶段移植排斥乳腺癌RVS感染AMLCLLCD25HER-2RSVF蛋白CD33CD52ZanapaxHerceptinSynagisMylotargCAMPATH人源化抗体人源化抗体人源化抗体人源化抗体－化疗药物交联物人源化抗体1997199819982000200133适用病症靶抗原抗体名称抗体来源临床阶段移植排斥CD25Z33第三节

小分子抗体第三节

小分子抗体34

小分子抗体通过基因重组技术，可以在保持原有抗原结合活性的基础上，把完整的抗体分子改造成较小的分子，称为小分子抗体。根据其价数的不同可分为单价小分子抗体及多价小分子抗体两种。小分子抗体35单价小分子抗体一、Fab抗体

Fab段由重链V区及CH1功能区与整个轻链以二硫键形式连接而成，主要发挥抗体的抗原结合功能。Fab抗体只有完整IgG的1/3。单价小分子抗体36二、单链抗体(ScFv)

定义：用基因工程方法，将抗体VH和VL（重链和轻链可变区）通过一个连接肽连接而成的小分子抗体，功能：具有较好的抗原结合能力，且分子量小、穿透力强、免疫原性低等特性。可与其他效应分子构建成多种具有新功能的抗体分子，是构建免疫毒素和双特异抗体等的理想而基本的元件。Ag二、单链抗体(ScFv)Ag37三、单域抗体

抗体与抗原的结合主要由Ig的V区决定，因此只含V区基因片段的小分子抗体，即只有VH或VL一个功能结构域，也能保持原单克隆抗体的特异性。这种小分子的抗体片段就称为单域或单区抗体，其分子量仅为整个Ig分子的1／12，故也称之为小抗体。三、单域抗体38四.超变区多肽

抗体抗原结合是经过补体决定区（CDR）来实现。因此，CDR是构成抗原抗体结合的最小结构单位。根据这一特点，可以设计出那些在抗原识别及亲和力方面有重要意义的CDR多肽，直接用于诊断或治疗，可望获得理想的结果。这种只含有一个CDR多肽的抗体，称为超变区多肽，亦称为最小识别单位(minimalrecognitionunit,MRU)。四.超变区多肽39从杂交瘤细胞分离出鼠MAb功能性可变区基因，与人Ig恒定区（决定免疫原性）基因连接，插入适当表达载体，转染宿主细胞，表达人鼠嵌合抗体。从杂交瘤细胞分离出鼠MAb功能性可变区基因，与人Ig恒定区（决定免疫原性）基因连接，插入适当表达载体，转染宿主细胞，表达人鼠嵌合抗体。蛋白质工程(proteinengineering）另外，用单克隆抗体做体内诊断，借以鉴别和定位体内“病灶”也引起人们的注意，目前，主要用于肿瘤追踪及心肌梗塞的诊断。①5ˊ端引物选Ig前导肽保守序列，5ˊ端引物也可选Ig分子骨架区1(FR1)的保守序列。直接法：直接测定多肽链的氨基酸顺序。可与其他效应分子构建成多种具有新功能的抗体分子，是构建免疫毒素和双特异抗体等的理想而基本的元件。这种小分子的抗体片段就称为单域或单区抗体，其分子量仅为整个Ig分子的1／12，故也称之为小抗体。核磁共振(NMR)光谱——研究处在溶液状态的蛋白质的结构。将抗体VH和VL（重链和轻链可变区）通过一个连接肽连接而成的小分子抗体，（2）测定其氨基酸序列；将外源多肽或蛋白与噬菌体的衣壳蛋白融合表达，融合蛋白展示在病毒颗粒的表面，而编码该融合子的DNA则位于病毒粒子内。蛋白质工程(proteinengineering）连接植物或细菌毒素（ricin、PE40）基因工程在原则上只能生产自然界已存在的蛋白质。④α螺旋，β折叠区一般不会存在酶的活性中心及底物的结合中心，只是结构支架。●可变区人源化——人改型抗体如CD4免疫粘附素，就是由抗体的Fc段与2个CD4分子的Ig同源区重组而成

多价小分子抗体在ScFv的基础上，可以把两个或两个以上的ScFv重组在一起，由此可制备成多价小分子抗体即微型抗体（简称多价微抗）。其中包括双链抗体(diabody)，微型抗体（minibody），三链抗体(triabody)及四链抗体(tetrabody)等。

从杂交瘤细胞分离出鼠MAb功能性可变区基因，与人Ig恒定区（40AgAg双链抗体(diabody)

制备方法化学交联法粘性蛋白结构域融合法接头长度控制法。AgAg双链抗体(diabody)41微型抗体(minibody)

通过基因工程手段采用不同的接头把单链抗体(VL-VH)的VH结构域与IgG的CH3结构域融合，形成VL-VH-CH3的结构，称之为微型抗体（minibody）。此种抗体合成后通过CH3结构域形成稳定二聚体式，发挥其双价微抗作用。微型抗体通过基因工程手段采用不同的接头把单链抗42

小分子抗体的应用：用于肿瘤的导向治疗肿瘤的影像分布基因治疗研究基因结构与功能的关系小分子抗体的应用：43第四节

抗体融合蛋白第四节

抗体融合蛋白44抗体融合蛋白将抗体分子片段与其他蛋白融合，所形成的具有新的特性融合蛋白。根据构建方式的不同，主要分为两种形式Fc融合蛋白（Fcfusionprotein,FcFP）由抗体的Fc段与某些具有特定功能的蛋白结构域融合而成。如CD4免疫粘附素，就是由抗体的Fc段与2个CD4分子的Ig同源区重组而成抗原结合融合蛋白（antigenBindingfusionprotein,ABFP）由具有抗原结合功能的抗体结构与其他功能性蛋白融合构成。如免疫毒素，抗体部分主要包括嵌合抗体、单链抗体形式。抗体融合蛋白将抗体分子片段与其他蛋白融合，所形成的具有新的特45免疫毒素又称生物导弹，是由导向性的载体分子（抗体部分）与具有毒性的弹头蛋白交联而制成，属于导向药物的一种。免疫毒素又称生物导弹，是由导向性的载体分子（抗体部分）与具有46免疫毒素CCVCVCCCSPDPSPDPRicinARicinA（α-FcγRI-RicinA）RicinA:蓖麻毒素A,对肿瘤细胞具有毒性作用免疫毒素CCVCVCCCSPDPSPDPRicinARic47CH1CH2CH3IL-2scFvIL-2

免疫细胞因子(Immunocytokine)CH1CH2CH3IL-2scFvIL-2免疫细胞48偶连细胞毒物质连接放射性同位素(131I、99mTc）连接植物或细菌毒素（ricin、PE40）连接细胞毒性药物（C1027、柔红霉素）偶连细胞毒物质连接放射性同位素(131I、99mTc）49免疫粘附素(immunoadhension)将人抗体恒定区(主要是Fc段)N端连接于人细胞表面的受体分子或细胞粘附分子上，在真核细胞中表达出正确折叠的融合抗体蛋白分子。Fc段发挥的作用（1）增加融合蛋白在血液中的稳定性。（2)Fc的生物学效应引导向特定细胞。比如TNFa抗体与TNFRFc

免疫粘附素(immunoadhension)50第五节

噬菌体抗体库技术(phageantibodylibrary)第五节

噬菌体抗体库技术(phageantibodyl51一、噬菌体展示系统将外源多肽或蛋白与噬菌体的衣壳蛋白融合表达，融合蛋白展示在病毒颗粒的表面，而编码该融合子的DNA则位于病毒粒子内。一、噬菌体展示系统将外源多肽或蛋白与噬菌体的衣壳蛋白融合表达52Smith在1985年首次证实外源DNA可以插入丝状噬菌体基因III中，并与pIII蛋白融合展示。SmithGP.Science1985;228:1315-7噬菌体展示技术Smith在1985年首次证实外源DNA可以插入丝53抗体工程蛋白质工程培训课件541Panlibrarywithimmobilizedtargets2Washoffunboundphage3Eluteboundphage4Amplifyovernight5Panelutedphage6Isolateindividualcolony3-4©2004MontaropYamabhai1234563-4©2004MontaropYama55二、噬菌体抗体库运用DNA重组技术把人抗体基因与噬菌体载体DNA相连，在噬菌体表面呈现并制备人类全套抗体的技术。

phageantibodylibraryphageantibodybank

二、噬菌体抗体库56

1990年McCafferty等成功地建立了噬菌体表面展示系统，通过将抗溶菌酶单链抗体基因克隆于fd噬菌体基因3的下游，使ScFv以融合蛋白的形式展示于噬菌体表面，利用亲和层析，两轮富集达106倍。该技术的成功给抗体基因的筛选工作带来了革命性的变革。1990年McCafferty等成功地建立了噬菌体表面57

因此,噬菌体抗体库技术不经免疫不经细胞融合技术即可获得含量丰富、种类众多的单一抗体技术。因此,噬菌体抗体库技术58外源基因表达多肽以融合蛋白形式展示在外壳蛋白N端将基因组合文库插入噬菌体编码膜蛋白的基因g3或g8的先导系列的紧靠下游

随机克隆入相应载体形成组合文库从免疫或未被免疫的B细胞中PCR扩增抗体全套基因片段（一）噬菌体抗体库技术基本方法外源基因表达多肽以融合蛋白形式展示在外壳蛋白N端将基因组合文59用固相化抗原经“亲和结合一洗脱一扩增”数个循环直接、方便、简捷、高效地筛选出表达特异性好、亲和力强的抗体噬菌体库。使翻译出的抗体分泌到细菌的质周腔内，形成游离的抗体片段，经过纯化即可获得目的抗体。筛选到的噬菌体再将基因g3或g8切除后，转入大肠杆菌，用固相化抗原经“亲和结合一洗脱一扩增”数个循环直接、方便、简60

1．抗体基因的扩增:

利用PCR技术，从外周B淋巴细胞DNA中分别扩增出轻链、重链可变区的基因。也可从B细胞mRNA中，经逆转录为cDNA后再扩增。除B细胞外，外周淋巴细胞、脾、淋巴结和骨髓细胞也可选用。显而易见，此法除了引物设计十分重要外，还要考虑机体免疫状态、细胞种类和数量、mRNA丰度等影响。1．抗体基因的扩增:61引物设计，一般可选①5ˊ端引物选Ig前导肽保守序列，5ˊ端引物也可选Ig分子骨架区1(FR1)的保守序列。②3ˊ端引物常选J区保守序列。构建Fab基因库，则在重链绞链区和轻链恒定区设计引物。③依据抗体基因家族保守序列设计引物。④设计多套引物分别扩增。为保证引物与模板最大的匹配，扩增出所有基因，有时尚须采用兼并引物。引物设计，一般可选62选用丝状噬菌体(M13、fd)，其DNA呈单链。一般在其外壳蛋白基因信号肽序列与编码成熟的蛋白序列之间插入外源基因人Ig基因片段。用特定的限制性内切酶酶解扩增出来的cDNA，克隆进入丝状噬菌体载体中，即与外壳蛋白pⅢ或pⅧ的基因连接形成融合基因。2．噬菌体表达载体的构建选用丝状噬菌体(M13、fd)，其DNA呈单链。一般在其外63

一般插入后不影响表达系统功能，在此融合基因中，人Ig基因片段多位于噬菌体基因的上游5ˊ端，在细菌中可以表达。一般作用的载体都是经过改建的，即含有LacZ启动子、核糖体结合位点(SD序列)、前导肽序列(保证分泌)和多克隆位点等，其后为M13外壳蛋白(pⅢ或pⅧ)。一般插入后不影响表达系统功能，在此融合基因中，人I64噬菌体抗体图示噬菌体抗体图示653．重组噬菌体DNA导入细菌进行人Ig片段表达

表达出的人Ig片段位于噬菌体外壳蛋白N端，但此融合蛋白不形成包涵体，在细菌信号肽引导下到达质周腔，Ig片段在此能自发折叠成天然状态，恢复生物活性。同时，外壳蛋白构成噬菌体外壳后，抗体分子蛋白处于其N端，分布在噬菌体表面。3．重组噬菌体DNA导入细菌进行人Ig片段表达66抗体库的构建抗体库的构建674单链噬菌体有效筛选

抗体库建立后,用可溶性抗原去筛选表达的抗体，在筛选流感病毒血凝素抗体、破伤风类毒素抗体时证明，筛选率很低。需要改进和提高产率。4单链噬菌体有效筛选68

制备固相化抗原柱

人体内是通过抗原的提呈作用，选择表面呈现特异抗体的B细胞和增殖分泌抗体的浆细胞。并在抗原选择压力下发生改变，产生出具有不同亲和力抗体。为了模拟此选择作用，在体外用固化抗原柱筛选噬菌表面抗体，再利用噬菌体能感染大肠杆菌特性，确重新感染细菌进行扩增。固相多用层析柱，也有用颗粒物质和酶联孔的。制备固相化抗原柱69

抗体库噬菌体过柱

选择目的抗体把含有抗体的噬菌体培养上清加到抗原固相柱上，使表面呈现特异性抗体的噬菌体与抗原特异性结合，洗去未结合的噬菌体。此时，抗原柱吸附的带抗体的噬菌体是具有感染性,表面所带抗体是所需的特异抗体片段。显然，只要制备不同抗原柱，就可筛选到针对不同抗原的不同抗体。抗体库噬菌体过柱70

6．洗脱结合的噬菌体

选择合适洗脱条件，把结合的、也是所需的噬菌体洗下来，收集噬菌体，再去感染细菌进行扩增。经过这样一来一轮淘筛方式，就能把抗体库中与抗原特异性结合抗体选出来，且能够做到富集。6．洗脱结合的噬菌体71抗体库的富集筛选抗体库的富集筛选727．重复“吸附—洗脱—扩增”过程

由于每径过一轮淘筛，可富集20～1000倍，几轮后很容易扩增到108个噬菌体体库。7．重复“吸附—洗73（二）应用1．应用“万能库”,制备人源抗体、多功能抗体不经免疫已获得许多人的抗半抗原、蛋白质、多糖及病毒等抗体。2．抗感染传染病诊断、治疗和预防(当前重点、热点)。3．抗肿瘤肿瘤和其他疾病的导向治疗和基因治疗。（二）应用744．利用抗体信息设计药物。5．噬菌体表位文库，可用此表达系统表达特异多肽后，建立肽库（peptidelibrary）。4．利用抗体信息设计药物。75蛋白质工程(proteinengineering）蛋白质工程(76蛋白质的结构及其多样性蛋白质的结构及其多样性77①氨基酸种类不同，肽链结构不同

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◎-◎-◎-◎-◎-◎-◎-◎-◎-◎蛋白质多样性原因②氨基酸数目成百上千，肽链结构不同③氨基酸排列顺序千变万化，肽链结构不同☆-☆-○-◎-

-▲-△-●-□-◎-○-★-■-

-★-◆●-■-◎-○-☆-○-☆-□-◎-▲-★-◆-

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-④肽链空间结构千差万别，蛋白质种类不同①氨基酸种类不同，肽链结构不同

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78天然蛋白质是生物在长期进化过程中形成的，它们的结构和功能符合特定物种生存的需要，却不一定完全符合人类生产和生活的需要。天然蛋白质是生物在长期进化过程中形成的，它们的结构和功能符合79基因工程在原则上只能生产自然界已存在的蛋白质。蛋白质工程就是为了生产出符合人类生产和生活需要的蛋白质，甚至是自然界不存在的蛋白质。基因工程在原则上只能生产自然界已存在的蛋白质。蛋白质工程就是80满足人类生产和生活的需要改造干扰素（半胱氨酸）体外很难保存干扰素（丝氨酸）体外可以保存半年玉米中赖氨酸含量比较低天冬氨酸激酶（352位的苏氨酸）二氢吡啶二羧酸合成酶（104位的天冬酰胺）改造改造天冬氨酸激酶（异亮氨酸）二氢吡啶二羧酸合成酶（异亮氨酸）玉米中赖氨酸含量可提高数倍改造满足人类生产和生活的需要改造干扰素（半胱氨酸）体外很难保存干81例如．胰岛素改造天然胰岛素制剂在储存中易形成二聚体和六聚体，延缓胰岛素从注射部位进入血液，从而延缓了其降血糖作用，也增加了抗原性，这是胰岛素B23-B28氨基酸残基结构所致。利用蛋白质工程技术改变这些残基，则可降低其聚合作用，使胰岛素快速起作用。该速效胰岛素已通过临床实验。

例如．胰岛素改造82二、蛋白质工程的基本原理

根据人们对蛋白质功能的特定需求，对蛋白质的结构进行分子设计。

对天然蛋白质进行改造，你认为应该直接对蛋白质分子进行操作，还是通过对基因的操作来实现？二、蛋白质工程的基本原理根据人们对蛋白质功能的特定需求83

蛋白质的功能是DNA决定的，那么要制造出新的蛋白质，就要改造DNA，所以蛋白质工程的原理应该是中心法则的逆推。

蛋白质工程是在基因工程的基础上，延伸出来的第二代基因工程。蛋白质的功能是DNA决定的，那么要制蛋白质84

蛋白质工程的基本原理基因DNA氨基酸序列多肽链蛋白质三维结构

预期功能

生物功能mRNA转录翻译折叠DNA合成分子设计蛋白质工程的基本原理基因氨基酸序列蛋白质预期功能85蛋白质工程的主要步骤通常包括：（1）从生物体中分离纯化目的蛋白；（2）测定其氨基酸序列；（3）借助核磁共振和X射线晶体衍射等手段，尽可能地了解蛋白质的二维重组和三维晶体结构;（4）设计各种处理条件，了解蛋白质的结构变化，包括折叠与去折叠等对其活性与功能的影响；（5）设计编码该蛋白的基因改造方案，如点突变；（6）分离、纯化新蛋白，功能检测后投入实际使用。蛋白质工程的主要步骤通常包括：（4）设计各种处理条件，了解蛋86蛋白质结构测定一级结构测定：直接法：直接测定多肽链的氨基酸顺序。间接法：从编码蛋白质的基因的核苷酸顺序来推导蛋白质的氨基酸顺序。三级结构测定：X-射线晶体衍射——研究处在晶体状态下的蛋白质的空间结构核磁共振(NMR)光谱——研究处在溶液状态的蛋白质的结构。蛋白质结构测定87

蛋白质工程的主要手段以重组DNA技术为核心的基因工程技术改造蛋白质。位点特异性突变——结构生物学、信息生物学基因突变随机突变——基于高通量筛选法基因内部的剪接基因剪接

5‘或3’端的剪接蛋白质工程的主要手段88小改是对天然蛋白质的一个或几个氨基酸残基进行修改。它往往利用点突变的技术，在维持蛋白质原有功能的基础上，改进某一些性质特点。小改是对天然蛋白质的一个或几个氨基酸残基进行修改。它往往利用89基因定点诱变技术的常用方法是PCR法。突变点：人工合成的引物上手段：PCR技术目的：获得定点突变的基因位点特异性突变：通过特异地改变编码核苷酸从而替代蛋白质中的某个氨基酸。可高效、准确地得到蛋白质突变体。但这种方法得到的突变体数量有限，因此在ＤＮＡ操作技术的带动下，发现了随机突变法。基因定点诱变技术的常用方法是PCR法。突变点：人工合成的引物90

设计速效胰岛素原则就是避免胰岛素形成聚合体。类胰岛素生长因子－I(IGF－I)的结构和性质与胰岛素具有高度的同源性和三维结构的相似性，但IGF－I不形成二聚体。IGF－I的B结构域（与胰岛素B链相对应）中B28－B29氨基酸序列与胰岛素B链的B28－B29相比，发生颠倒。因此，将胰岛素B链改为B28Lys－B29Pro，获得单体速效胰岛素。该速效胰岛素已通过临床实验。设计速效胰岛素原则就是避免胰岛素形成聚合体。类胰岛素生长因91枯草杆菌碱性蛋白酶(重要工业用酶)对碱、热、氧化作用抗力差，易失活。Met/Ala(222),成功地制备出具有耐碱、耐热以及抗氧化的各种新特性的蛋白酶。胰蛋白酶（LysArg）易自溶失活对自溶片段分析，对Arg117进行设计，引入缺失突变。稳定性大大提高。表面电荷正改负，在较高pH条件下提高了其专一性（LysArg）。枯草杆菌碱性蛋白酶(重要工业用酶)92葡萄糖异构酶（GI）在工业上应用广泛，为提高其热稳定性，确定第138位甘氨酸(Gly138)为目标氨基酸后，用双引物法对GI基因进行体外定点诱变，以脯氨酸（Pro138）替代Gly138，含突变体的重组质粒在大肠杆菌中表达，结果突变型GI比野生型的热半衰期长一倍；最适反应温度提高10～12℃；酶比活相同

葡萄糖异构酶（GI）在工业上应用广泛，为提高其热稳定性，确定93

中改是对蛋白质分子中某些结构单元或肽段进行分子裁剪，通过基因操作，在不同的蛋白质分子之间替换结构单元，以期得到新的功能组合。中改是对蛋白质分子中某些结构单元或肽段进行分子裁剪，通94基因剪接：在酶分子的编码基因上剪去或接上一段核苷酸。融合蛋白质将编码一种蛋白质的部分基因移植到另一种蛋白质基因上，或将不同蛋白质基因的片段组合在一起，经基因克隆和表达，产生出新的融合蛋白质。（结构域的拼接）这种方法可以将不同蛋白质的特性集中在一种蛋白质上，显著地改变蛋白质的特性基因剪接：在酶分子的编码基因上剪去或接上一段核苷酸。95

脑啡肽(Enk)N端5肽线形结构是与δ型受体结合的基本功能区域，干扰素（IFN）是一种广谱抗病毒抗肿瘤的细胞因子。化学合成EnkN端5肽编码区，通过连接5肽编码区与人α1型IFN基因连接，在大肠杆菌中表达了这一融合蛋白。以体外人结肠腺癌细胞和多形胶质瘤细胞为模型，采用3H－胸腺嘧啶核苷掺入法证明该融合蛋白抑制肿瘤细胞生长的活性显著高于单纯的IFN，通过竞争阻断实验证明，抑制活性的增高确由Enk导向区介导。脑啡肽(Enk)N端5肽线形结构是与δ型受体结合的基本功能96大改是重新设计与合成自然界本不存在的蛋白质分子。即从蛋白质的氨基酸组成和顺序出发，设计并制造出一个全新的蛋白质，并使之具有特定的空间结构和相应的功能。大改97

①定点突变注意尽量保护保守的残基，特别在高特异性、高活性蛋白操作时更应注意。②对糖蛋白的N糖基化位点（AsnXSer/TheXPro）应予注意。分泌蛋白、穿膜蛋白的这些位点若改变，将影响其糖基化，则可能对生物活性有影响。故注意对天冬氨酸、丝氨酸、苏氨酸和脯氨酸加以保护。应注意①定点突变注意尽量保护保守的残基，特别98③疏水氨基酸常出现在蛋白质活性中心区，故应保留脯氨酸（可终止α螺旋区），半胱氨酸（形成二硫键，这是分泌蛋白标志之一）。④α螺旋，β折叠区一般不会存在酶的活性中心及底物的结合中心，只是结构支架。而环区，转角区和带电荷区多位蛋白质表面，可能是底物结合区和配基结合部位，应予注意。③疏水氨基酸常出现在蛋白质活性中心区，故应保留99⑤对于有内含子的基因序列，可以试着去删除某一外显子，观察对功能影响。由于单个外显子一般编码独立折叠结构删去后不会影响其余部分的折叠。⑥构建嵌合蛋白时，若是同源蛋白嵌合体（30%同源），结合部应是相同或相近功能氨基酸；若是非同源原蛋白质，接合部应在预测结构的边缘。⑤对于有内含子的基因序列，可以试着去删除某一外显子，观察对100抗体工程蛋白质工程抗体工程蛋白质工程101（优选）抗体工程蛋白质工程（优选）抗体工程蛋白质工程102淋巴细胞杂交瘤产生单克隆抗体淋巴细胞杂交瘤产生单克隆抗体103抗体工程蛋白质工程培训课件104如何大量生产单克隆抗体？利用B淋巴细胞产生抗体的功能。利用肿瘤细胞无限增殖的特性。利用细胞融合的技术将两种细胞融合获得具有B淋巴细胞和肿瘤细胞特性的杂交瘤细胞。利用动物细胞培养技术大量培养杂交瘤细胞。如何大量生产单克隆抗体？利用B淋巴细胞产生抗体的功能。105单克隆抗体的概念由单个杂交瘤细胞进行无性繁殖,也就是通过克隆，形成细胞群，这一细胞群所产生的化学性质单一、特异性强的抗体称为单克隆抗体。单克隆抗体的概念106

单克隆抗体制备过程

注射抗原B淋巴细胞骨髓瘤细胞细胞融合、筛选杂交瘤细胞细胞培养筛选，继续培养足够数量的、能产生特定抗体的细胞群体外培养注射到小鼠腹腔单克隆抗体如何获得融和细胞？如何得到单个融和细胞？如何筛选杂交瘤细胞？鉴别是否分泌所需抗体?单克隆抗体制备过程注射抗原B淋巴细胞骨髓瘤细胞细胞融107杂交瘤细胞的筛选(1)骨髓瘤细胞为HGPRT基因缺陷型细胞，不能合成DNA。需经应急途径合成DNA。HAT培养基含有次黄嘌呤，氨基喋呤和胸腺嘧啶。氨基喋呤可阻断骨髓瘤细胞的应急DNA合成。所以骨髓瘤细胞不能在HAT培养基中生长存活.B淋巴细胞具有HGPRT基因但不能在体外生长。利用这两种细胞各自的特点，筛选能在体外含HAT的培养基中生长的融合子。HGPRT:次黄嘌呤核糖磷酸转移酶

HAT：次黄嘌呤，氨基喋呤，胸腺嘧啶杂交瘤细胞的筛选(1)骨髓瘤细胞为HGPRT基因缺陷型细胞，108杂交瘤细胞的筛选(2)杂交瘤细胞的筛选(2)109抗体工程蛋白质工程培训课件110整个制备过程为何要经过两次筛选?第一次筛选：用特定的选择培养基筛选出多种杂交瘤细胞第二次筛选（克隆化培养和抗体检测）：筛选出能产生所需抗体的杂交瘤细胞。整个制备过程为何要经过两次筛选?第一次筛选：用特定的选择培养111思考：1、本过程利用了哪些原理？免疫原理，细胞融合原理和动物细胞培养原理2、为什么选用小鼠骨髓瘤细胞与B细胞融合？这样融合成的杂交瘤细胞，继承了双亲细胞的遗传物质，不仅具有B细胞分泌抗体的能力，而且还有无限增殖的本领，因而可以获得大量单克隆抗体思考：1、本过程利用了哪些原理？免疫原理，细胞融合原理和动物112鉴定后的杂交瘤细胞可大规模培养，收集上清提取单克隆抗体，也可免疫小鼠腹腔，抽取腹水来制备相应的McAb，但生产规模和产量均受限制。鉴定后的杂交瘤细胞可大规模培养，收集上清提取单克隆抗体，也可113单克隆抗体的优势1．高特异性，针对一个抗原靶点。。2．高纯度，成份均一，来自一个克隆。3．高效价，抗体的滴度高。4．高效益，国际上近100亿美元市场。5．易制备。6．前景好，McAb1995问世后，风糜全球，寄予厚望。单克隆抗体的优势1．高特异性，针对一个抗原靶点。。114单克隆抗体应用领域1．McAb作为诊断试剂应用这是目前应用最广的领域，目前已有许多成套的诊断试剂盒在诊断传染病，代谢病和免疫性疾病中应用，取得良好经济和社会效益，全世界有上百亿市场。举例早孕试纸，乙肝诊断试剂盒单克隆抗体应用领域1．McAb作为诊断试剂应用115（α-FcγRI-RicinA）从杂交瘤细胞分离出鼠MAb功能性可变区基因，与人Ig恒定区（决定免疫原性）基因连接，插入适当表达载体，转染宿主细胞，表达人鼠嵌合抗体。鉴定后的杂交瘤细胞可大规模培养，收集上清提取单克隆抗体，也可免疫小鼠腹腔，抽取腹水来制备相应的McAb，但生产规模和产量均受限制。直接法：直接测定多肽链的氨基酸顺序。选择目的抗体把含有抗体的噬菌体培养上清加到抗原固相柱上，使表面呈现特异性抗体的噬菌体与抗原特异性结合，洗去未结合的噬菌体。即可获得含量丰富、种类众多的单一抗体技术。2．噬菌体表达载体的构建蛋白质工程是在基因工程的基础上，延伸出来的第二代基因工程。化学交联法基因工程在原则上只能生产自然界已存在的蛋白质。Pr鼠VH人CHPr鼠VL人CL为了模拟此选择作用，在体外用固化抗原柱筛选噬菌表面抗体，再利用噬菌体能感染大肠杆菌特性，确重新感染细菌进行扩增。将编码一种蛋白质的部分基因移植到另一种蛋白质基因上，或将不同蛋白质基因的片段组合在一起，经基因克隆和表达，产生出新的融合蛋白质。将抗体VH和VL（重链和轻链可变区）通过一个连接肽连接而成的小分子抗体，以体外人结肠腺癌细胞和多形胶质瘤细胞为模型，采用3H－胸腺嘧啶核苷掺入法证明该融合蛋白抑制肿瘤细胞生长的活性显著高于单纯的IFN，通过竞争阻断实验证明，抑制活性的增高确由Enk导向区介导。核磁共振(NMR)光谱——研究处在溶液状态的蛋白质的结构。嵌合抗体由于这两部分在空间结构上相对独立，其独特的抗体亲和力保持得很好。肿瘤的影像分布用于肿瘤的导向治疗化学合成EnkN端5肽编码区，通过连接5肽编码区与人α1型IFN基因连接，在大肠杆菌中表达了这一融合蛋白。2．抗体导向治疗

用特异性单抗为载体，将抗瘤药物、放射性核素以及毒素等毒性物质导向性携带至肿瘤灶局部，可特异性杀伤肿瘤细胞，而对正常细胞损伤较轻。将毒素与单抗连接常称为免疫毒素。常用的毒素包括植物毒素（如蓖麻毒素、苦瓜毒素等）和细菌毒素（如白喉外毒素、绿脓杆菌外毒素等）。（α-FcγRI-RicinA）2．抗体导向治疗116抗体工程蛋白质工程培训课件1173．McAb作免疫抑制剂应用，应用于器官移植。当前McAb最具代表的是抗TNF单抗治疗类风湿和回肠炎有效，有20亿美元市场。其他在抗肿瘤，抗排异及抗血栓方面也很看好。3．McAb作免疫抑制剂应用，应用于器官移植。1181980年后，其开发走向下坡路，临床实验失败，股票狂跌，损失以百万美元计。原因病人过敏及免疫性疾病加重病人病情，体内很快排异及对肾脏毒性。但到2000年又有回头，2001年被认为在免疫学上是“单克隆抗体年”，抗体研究将迅速发展，现单在治疗方面就有10种单抗进入市场，3种待批上市，近100种在进行临床试验阶段。当然，与McAb技术改进关系极大。1980年后，其开发走向下坡路，临床实验失败，股票狂跌，损失119资料：目前世界各国已经研制出数以百计的单克隆抗体。许多缺乏良好诊断手段的传染病、免疫性疾病、血液病、内分泌疾病和遗传病，用单克隆抗体作为诊断手段，是一个必然趋势。另外，用单克隆抗体做体内诊断，借以鉴别和定位体内“病灶”也引起人们的注意，目前，主要用于肿瘤追踪及心肌梗塞的诊断。资料：目前世界各国已经研制出数以百计的单克隆抗体。许多缺120

问题异源蛋白导致产生抗抗体，影响靶向性和效果在体内被清除速度快靶部位摄取的量太低效应功能弱产业化

对策抗体人源化抗体人源化改变抗体分子大小连接毒素、放射性同位素、药物体外表达抗体抗体治疗存在的问题及对策问题对121基因工程抗体通过基因重组改良抗体性能通过噬菌体抗体库技术研制新的抗体基因工程抗体通过基因重组改良抗体性能122免疫球蛋白分子的基本结构免疫球蛋白分子的基本结构123第二节

鼠单抗人源化第二节

鼠单抗人源化124●恒定区人源化——人-鼠嵌合抗体●可变区人源化——人改型抗体●用抗体库技术进行人源化●恒定区人源化——人-鼠嵌合抗体125第一代的抗体人源化—嵌合抗体从杂交瘤细胞分离出鼠MAb功能性可变区基因，与人Ig恒定区（决定免疫原性）基因连接，插入适当表达载体，转染宿主细胞，表达人鼠嵌合抗体。嵌合抗体由于这两部分在空间结构上相对独立，其独特的抗体亲和力保持得很好。特点减少了鼠源性抗体的免疫原性，同时保留了亲本抗体特异性结合抗原的能力。缺点因鼠单抗可变区的存在，应用时仍有较强的免疫排斥反应第一代的抗体人源化—嵌合抗体126Pr鼠VH人CHPr鼠VL人CL免疫球蛋白基因载体的构建H链嵌合载体L链嵌合载体共转染细胞启动子人-鼠嵌合抗体基因工程改造策略Pr鼠VH人CH127鼠VH鼠VL人CL人CH抗体分泌细胞人-鼠嵌合基因工程抗体鼠VH鼠VL人CL人CH抗体分泌细胞人-鼠嵌合基因工程抗体128①定点突变注意尽量保护保守的残基，特别在高特异性、高活性蛋白操作时更应注意。②3ˊ端引物常选J区保守序列。从杂交瘤细胞分离出鼠MAb功能性可变区基因，与人Ig恒定区（决定免疫原性）基因连接，插入适当表达载体，转染宿主细胞，表达人鼠嵌合抗体。建立肽库（peptidelibrary）。2．噬菌体表达载体的构建4．高效益，国际上近100亿美元市场。利用B淋巴细胞产生抗体的功能。连接细胞毒性药物（C1027、柔红霉素）对天然蛋白质进行改造，你认为应该直接对蛋白质分子进行操作，还是通过对基因的操作来实现？基因定点诱变技术的常用方法是PCR法。基因工程在原则上只能生产自然界已存在的蛋白质。中改是对蛋白质分子中某些结构单元或肽段进行分子裁剪，通过基因操作，在不同的蛋白质分子之间替换结构单元，以期得到新的功能组合。比如TNFa抗体与TNFRFc●可变区人源化——人改型抗体将外源多肽或蛋白与噬菌体的衣壳蛋白融合表达，融合蛋白展示在病毒颗粒的表面，而编码该融合子的DNA则位于病毒粒子内。（优选）抗体工程蛋白质工程玉米中赖氨酸含量可提高数倍Met/Ala(222),成功地制备出具有耐碱、耐热以及抗氧化的各种新特性的蛋白酶。从杂交瘤细胞分离出鼠MAb功能性可变区基因，与人Ig恒定区（决定免疫原性）基因连接，插入适当表达载体，转染宿主细胞，表达人鼠嵌合抗体。3．抗肿瘤肿瘤和其他疾病的导向治疗和资料：目前世界各国已经研制出数以百计的单克隆抗体。第二代的抗体人源化——改型抗体在嵌合抗体的基础上进一步将鼠MAb可变区中相对保守的FR(frameworkregion)替换成人的FR，保留与抗原结合部位决定簇互补区（complementdeterminantregion)部位(即CDR移植)早期的改型抗体简单的CDR移植，通过点突变进行微调即更换某个位点上的氨基酸。①定点突变注意尽量保护保守的残基，特别在高特异性、高活性蛋129CDR序列CDR序列鼠单克隆抗体人抗体人源化抗体鼠单克隆V区人源化（CDR移植）CDR序列CDR序列鼠单克隆抗体人抗体人源化抗体鼠单克130第二代改型抗体：①应用了人抗体基因库；②引进计算机技术模拟抗体分子的立体结构(分子模拟法)；③使用了鼠人嵌合FR。其目的是获得具有高亲和力的治疗性抗体

第二代改型抗体：131132已批准上市的单抗适用病症靶抗原抗体名称抗体来源临床阶段移植排斥大肠癌冠心病淋巴瘤移植排斥炎症性肠病、类风湿CD317-1A血小板受体ⅡbⅢaCD20CD25TNF-аOKT3PanorexReoProRituxanSimulectRemicade鼠单抗鼠单抗人－鼠嵌合抗体人－鼠嵌合抗体人－鼠嵌合抗体人－鼠嵌合抗体19861995(德国)1994199719981998、199932已批准上市的单抗适用病症靶抗原抗体名称抗体来源临床阶段移132133适用病症靶抗原抗体名称抗体来源临床阶段移植排斥乳腺癌RVS感染AMLCLLCD25HER-2RSVF蛋白CD33CD52ZanapaxHerceptinSynagisMylotargCAMPATH人源化抗体人源化抗体人源化抗体人源化抗体－化疗药物交联物人源化抗体1997199819982000200133适用病症靶抗原抗体名称抗体来源临床阶段移植排斥CD25Z133第三节

小分子抗体第三节

小分子抗体134

小分子抗体通过基因重组技术，可以在保持原有抗原结合活性的基础上，把完整的抗体分子改造成较小的分子，称为小分子抗体。根据其价数的不同可分为单价小分子抗体及多价小分子抗体两种。小分子抗体135单价小分子抗体一、Fab抗体

Fab段由重链V区及CH1功能区与整个轻链以二硫键形式连接而成，主要发挥抗体的抗原结合功能。Fab抗体只有完整IgG的1/3。单价小分子抗体136二、单链抗体(ScFv)

定义：用基因工程方法，将抗体VH和VL（重链和轻链可变区）通过一个连接肽连接而成的小分子抗体，功能：具有较好的抗原结合能力，且分子量小、穿透力强、免疫原性低等特性。可与其他效应分子构建成多种具有新功能的抗体分子，是构建免疫毒素和双特异抗体等的理想而基本的元件。Ag二、单链抗体(ScFv)Ag137三、单域抗体

抗体与抗原的结合主要由Ig的V区决定，因此只含V区基因片段的小分子抗体，即只有VH或VL一个功能结构域，也能保持原单克隆抗体的特异性。这种小分子的抗体片段就称为单域或单区抗体，其分子量仅为整个Ig分子的1／12，故也称之为小抗体。三、单域抗体138四.超变区多肽

抗体抗原结合是经过补体决定区（CDR）来实现。因此，CDR是构成抗原抗体结合的最小结构单位。根据这一特点，可以设计出那些在抗原识别及亲和力方面有重要意义的CDR多肽，直接用于诊断或治疗，可望获得理想的结果。这种只含有一个CDR多肽的抗体，称为超变区多肽，亦称为最小识别单位(minimalrecognitionunit,MRU)。四.超变区多肽139从杂交瘤细胞分离出鼠MAb功能性可变区基因，与人Ig恒定区（决定免疫原性）基因连接，插入适当表达载体，转染宿主细胞，表达人鼠嵌合抗体。从杂交瘤细胞分离出鼠MAb功能性可变区基因，与人Ig恒定区（决定免疫原性）基因连接，插入适当表达载体，转染宿主细胞，表达人鼠嵌合抗体。蛋白质工程(proteinengineering）另外，用单克隆抗体做体内诊断，借以鉴别和定位体内“病灶”也引起人们的注意，目前，主要用于肿瘤追踪及心肌梗塞的诊断。①5ˊ端引物选Ig前导肽保守序列，5ˊ端引物也可选Ig分子骨架区1(FR1)的保守序列。直接法：直接测定多肽链的氨基酸顺序。可与其他效应分子构建成多种具有新功能的抗体分子，是构建免疫毒素和双特异抗体等的理想而基本的元件。这种小分子的抗体片段就称为单域或单区抗体，其分子量仅为整个Ig分子的1／12，故也称之为小抗体。核磁共振(NMR)光谱——研究处在溶液状态的蛋白质的结构。将抗体VH和VL（重链和轻链可变区）通过一个连接肽连接而成的小分子抗体，（2）测定其氨基酸序列；将外源多肽或蛋白与噬菌体的衣壳蛋白融合表达，融合蛋白展示在病毒颗粒的表面，而编码该融合子的DNA则位于病毒粒子内。蛋白质工程(proteinengineering）连接植物或细菌毒素（ricin、PE40）基因工程在原则上只能生产自然界已存在的蛋白质。④α螺旋，β折叠区一般不会存在酶的活性中心及底物的结合中心，只是结构支架。●可变区人源化——人改型抗体如CD4免疫粘附素，就是由抗体的Fc段与2个CD4分子的Ig同源区重组而成

多价小分子抗体在ScFv的基础上，可以把两个或两个以上的ScFv重组在一起，由此可制备成多价小分子抗体即微型抗体（简称多价微抗）。其中包括双链抗体(diabody)，微型抗体（minibody），三链抗体(triabody)及四链抗体(tetrabody)等。

从杂交瘤细胞分离出鼠MAb功能性可变区基因，与人Ig恒定区（140AgAg双链抗体(diabody)

制备方法化学交联法粘性蛋白结构域融合法接头长度控制法。AgAg双链抗体(diabody)141微型抗体(minibody)

通过基因工程手段采用不同的接头把单链抗体(VL-VH)的VH结构域与IgG的CH3结构域融合，形成VL-VH-CH3的结构，称之为微型抗体（minibody）。此种抗体合成后通过CH3结构域形成稳定二聚体式，发挥其双价微抗作用。微型抗体通过基因工程手段采用不同的接头把单链抗142

小分子抗体的应用：用于肿瘤的导向治疗肿瘤的影像分布基因治疗研究基因结构与功能的关系小分子抗体的应用：143第四节

抗体融合蛋白第四节

抗体融合蛋白144抗体融合蛋白将抗体分子片段与其他蛋白融合，所形成的具有新的特性融合蛋白。根据构建方式的不同，主要分为两种形式Fc融合蛋白（Fcfusionprotein,FcFP）由抗体的Fc段与某些具有特定功能的蛋白结构域融合而成。如CD4免疫粘附素，就是由抗体的Fc段与2个CD4分子的Ig同源区重组而成抗原结合融合蛋白（antigenBindingfusionprotein,ABFP）由具有抗原结合功能的抗体结构与其他功能性蛋白融合构成。如免疫毒素，抗体部分主要包括嵌合抗体、单链抗体形式。抗体融合蛋白将抗体分子片段与其他蛋白融合，所形成的具有新的特145免疫毒素又称生物导弹，是由导向性的载体分子（抗体部分）与具有毒性的弹头蛋白交联而制成，属于导向药物的一种。免疫毒素又称生物导弹，是由导向性的载体分子（抗体部分）与具有146免疫毒素CCVCVCCCSPDPSPDPRicinARicinA（α-FcγRI-RicinA）RicinA:蓖麻毒素A,对肿瘤细胞具有毒性作用免疫毒素CCVCVCCCSPDPSPDPRicinARic147CH1CH2CH3IL-2scFvIL-2

免疫细胞因子(Immunocytokine)CH1CH2CH3IL-2scFvIL-2免疫细胞148偶连细胞毒物质连接放射性同位素(131I、99mTc）连接植物或细菌毒素（ricin、PE40）连接细胞毒性药物（C1027、柔红霉素）偶连细胞毒物质连接放射性同位素(131I、99mTc）149免疫粘附素(immunoadhension)将人抗体恒定区(主要是Fc段)N端连接于人细胞表面的受体分子或细胞粘附分子上，在真核细胞中表达出正确折叠的融合抗体蛋白分子。Fc段发挥的作用（1）增加融合蛋白在血液中的稳定性。（2)Fc的生物学效应引导向特定细胞。比如TNFa抗体与TNFRFc

免疫粘附素(immunoadhension)150第五节

噬菌体抗体库技术(phageantibodylibrary)第五节

噬菌体抗体库技术(phageantibodyl151一、噬菌体展示系统将外源多肽或蛋白与噬菌体的衣壳蛋白融合表达，融合蛋白展示在病毒颗粒的表面，而编码该融合子的DNA则位于病毒粒子内。一、噬菌体展示系统将外源多肽或蛋白与噬菌体的衣壳蛋白融合表达152Smith在1985年首次证实外源DNA可以插入丝状噬菌体基因III中，并与pIII蛋白融合展示。SmithGP.Science1985;228:1315-7噬菌体展示技术Smith在1985年首次证实外源DNA可以插入丝153抗体工程蛋白质工程培训课件1541Panlibrarywithimmobilizedtargets2Washoffunboundphage3Eluteboundphage4Amplifyovernight5Panelutedphage6Isolateindividualcolony3-4©2004MontaropYamabhai1234563-4©2004MontaropYama155二、噬菌体抗体库运用DNA重组技术把人抗体基因与噬菌体载体DNA相连，在噬菌体表面呈现并制备人类全套抗体的技术。

phageantibodylibraryphageantibodybank

二、噬菌体抗体库156

1990年McCafferty等成功地建立了噬菌体表面展示系统，通过将抗溶菌酶单链抗体基因克隆于fd噬菌体基因3的下游，使ScFv以融合蛋白的形式展示于噬菌体表面，利用亲和层析，两轮富集达106倍。该技术的成功给抗体基因的筛选工作带来了革命性的变革。1990年McCafferty等成功地建立了噬菌体表面157

因此,噬菌体抗体库技术不经免疫不经细胞融合技术即可获得含量丰富、种类众多的单一抗体技术。因此,噬菌体抗体库技术158外源基因表达多肽以融合蛋白形式展示在外壳蛋白N端将基因组合文库插入噬菌体编码膜蛋白的基因g3或g8的先导系列的紧靠下游

随机克隆入相应载体形成组合文库从免疫或未被免疫的B细胞中PCR扩增抗体全套基因片段（一）噬菌体抗体库技术基本方法外源基因表达多肽以融合蛋白形式展示在外壳蛋白N端将基因组合文159用固相化抗原经“亲和结合一洗脱一扩增”数个循环直接、方便、简捷、高效地筛选出表达特异性好、亲和力强的抗体噬菌体库。使翻译出的抗体分泌到细菌的质周腔内，形成游离的抗体片段，经过纯化即可获得目的抗体。筛选到的噬菌体再将基因g3或g8切除后，转入大肠杆菌，用固相化抗原经“亲和结合一洗脱一扩增”数个循环直接、方便、简160

1．抗体基因的扩增:

利用PCR技术，从外周B淋巴细胞DNA中分别扩增出轻链、重链可变区的基因。也可从B细胞mRNA中，经逆转录为cDNA后再扩增。除B细胞外，外周淋巴细胞、脾、淋巴结和骨髓细胞也可选用。显而易见，此法除了引物设计十分重要外，还要考虑机体免疫状态、细胞种类和数量、mRNA丰度等影响。1．抗体基因的扩增:161引物设计，一般可选①5ˊ端引物选Ig前导肽保守序列，5ˊ端引物也可选Ig分子骨架区1(FR1)的保守序列。②3ˊ端引物常选J区保守序列。构建Fab基因库，则在重链绞链区和轻链恒定区设计引物。③依据抗体基因家族保守序列设计引物。④设计多套引物分别扩增。为保证引物与模板最大的匹配，扩增出所有基因，有时尚须采用兼并引物。引物设计，一般可选162选用丝状噬菌体(M13、fd)，其DNA呈单链。一般在其外壳蛋白基因信号肽序列与编码成熟的蛋白序列之间插入外源基因人Ig基因片段。用特定的限制性内切酶酶解扩增出来的cDNA，克隆进入丝状噬菌体载体中，即与外壳蛋白pⅢ或pⅧ的基因连接形成融合基因。2．噬菌体表达载体的构建选用丝状噬菌体(M13、fd)，其DNA呈单链。一般在其外163

一般插入后不影响表达系统功能，在此融合基因中，人Ig基因片段多位于噬菌体基因的上游5ˊ端，在细菌中可以表达。一般作用的载体都是经过改建的，即含有LacZ启动子、核糖体结合位点(SD序列)、前导肽序列(保证分泌)和多克隆位点等，其后为M13外壳蛋白(pⅢ或pⅧ)。一般插入后不影响表达系统功能，在此融合基因中，人I164噬菌体抗体图示噬菌体抗体图示1653．重组噬菌体DNA导入细菌进行人Ig片段表达

表达出的人Ig片段位于噬菌体外壳蛋白N端，但此融合蛋白不形成包涵体，在细菌信号肽引导下到达质周腔，Ig片段在此能自发折叠成天然状态，恢复生物活性。同时，外壳蛋白构成噬菌体外壳后，抗体分子蛋白处于其N端，分布在噬菌体表面。3．重组噬菌体DNA导入细菌进行人Ig片段表达166抗体库的构建抗体库的构建1674单链噬菌体有效筛选

抗体库建立后,用可溶性抗原去筛选表达的抗体，在筛选流感病毒血凝素抗体、破伤风类毒素抗体时证明，筛选率很低。需要改进和提高产率。4单链噬菌体有效筛选168

制备固相化抗原柱

人体内是通过抗原的提呈作用，选择表面呈现特异抗体的B细胞和增殖分泌抗体的浆细胞。并在抗原选择压力下发生改变，产生出具有不同亲和力抗体。为了模拟此选择作用，在体外用固化抗原柱筛选噬菌表面抗体，再利用噬菌体能感染大肠杆菌特性，确重新感染细菌进行扩增。固相多用层析柱，也有用颗粒物质和酶联孔的。制备固相化抗原柱169

抗体库噬菌体过柱

选择目的抗体把含有抗体的噬菌体培养上清加到抗原固相柱上，使表面呈现特异性抗体的噬菌体与抗原特异性结合，洗去未结合的噬菌体。此时，抗原柱吸附的带抗体的噬菌体是具有感染性,表面所带抗体是所需的特异抗体片段。显然，只要制备不同抗原柱，就可筛选到针对不同抗原的不同抗体。抗体库噬菌体过柱170

6．洗脱结