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文档简介

实验九：细胞原代培养1、理解细胞原代培养原理；2、熟悉细胞原代培养方法与过程，以小鼠胎儿为材料，学习细胞原代培养中常用组织块培养法和消化培养法；3、掌握动物细胞培养中的无菌操作技术，并为细胞传代培养、细胞纯化和冷冻保存等实验鉴定基础。【实验目的】【实验原理】

细胞培养是生物学和医学研究中最常用的手段之一。可分为原代培养和传代培养两种。原代培养：将动物机体的各种组织从机体中取出，经各种酶（常用胰蛋白酶）、螯合剂（常用EDTA）或机械方法处理，分散成单细胞，置合适的培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖。材料：胎鼠或新生鼠试剂：1640培养基（含10%小牛血清），0.25%胰酶，PBS液，75%酒精。【仪器、材料与试剂】【实验步骤】实验前准备1、超净台紫外消毒2、实验者操作前准备3、各种所需物品就位A【实验步骤】

（一）胰酶消化法1、将孕鼠拉颈椎致死，置75%酒精泡全身浸泡2—3秒钟（时间不能过长、以免酒精从口和肛门浸入体内）再用碘酒消毒腹部，取胎鼠带入超净台内。A【实验步骤】2、超净台内，将孕鼠外皮剪开，再将内皮剪开，露出子宫，将胚胎和胎膜、胎盘剥离,分离子宫系膜，剪断子宫角，将子宫小心取出，置于盛有PBS或未添加血清的DMEM培养基的培养皿内，洗涤3次，弃除表面残余血迹。【实验步骤】5、将胚胎转移到另一装有PBS的平皿中，用手术剪将其剪成小块（1mm3），再用PBS液洗三次，转移至小青霉素瓶中。

F11、加入培养液l—2ml（视细胞量），血球计数板计数。

12、将细胞调整到5×105/ml左右，转移至25ml细胞培养瓶中，37℃下培养。

上述消化分离的方法是最基本的方法，在该方法的基础上，可进一步分离不同细胞。细胞分离的方法各实验室不同，所采用的消化酶也不相同。

【实验步骤】【注意事项】1、自取材开始，保持所有组织细胞处于无菌条件。细胞计数可在有菌环境中进行。2、在超净台中，组织细胞、培养液等不能暴露过久，以免溶液蒸发。3、凡在超净台外操作的步骤，各器皿需用盖子或橡皮塞，以防止细菌落入。常见的错误操作:明确指出常见的错误操作禁止在开盖的灭菌物品上方活动禁止两手在台面上交叉取物拿吸管的位置不能过低禁止将打开的灭菌物品拿出超净台吸管头不能碰到台面、培养瓶口外壁等吸管不能混用过早开盖明确指出常见的错误操作禁止在开盖的灭菌物品上方活动禁止两手在台

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