蛋白质组学课程论文-

蛋白质组学关键技术研究进展摘要:蛋白质组学是对蛋白质特别是其结构和功能的大规模研究,是在90年代初期,由MarcWikins和学者们首先提出的新名词。蛋白质组的研究不仅能为生命活动规律提供物质基础,也能为众多种疾病机理的阐明及攻克提供理论根据和解决途径。本文综述了蛋白质组学的一些关键技术的应用研究进展。关键词:蛋白质组学;蛋白质组技术;研究方法蛋白质组学的概念[1]最早是在1995年提出的,它在本质上指的是在大规模水平上研究蛋白质的特征,包括蛋白质的表达水平,翻译后的修饰,蛋白与蛋白相互作用等,由此获得蛋白质水平上的关于疾病发生,细胞代谢等过程的整体而全面的认识。近年来,高通量蛋白质分离与鉴定技术,如双向电泳、生物质谱、蛋白质芯片、酵母双杂交系统、生物信息学等相继建立并日趋完善,加速了蛋白质组学的发展。1蛋白质组学概述随着人类基因组计划的完成和功能基因组时代的到来,蛋白质结构与功能研究越来越重要,蛋白质组学、生物信息学等相关学科已逐渐成为生命科学的前沿。随着人类基因组计划的实施和推进,生命科学研究已进入了后基因组时代。在这个时代,生命科学的主要研究对象是功能基因组学,包括结构基因组研究和蛋白质组研究等。尽管现在已有多个物种的基因组被测序,但在这些基因组中通常有一半以上基因的功能是未知的。目前功能基因组中所采用的策略,如基因芯片、基因表达序列分析(Serialanalysisofgeneexpression,SAGE等,都是从细胞中mRNA的角度来考虑的,其前提是细胞中mRNA的水平反映了蛋白质表达的水平。但事实并不完全如此,从DNA、mRNA、蛋白质,存在三个层次的调控,即转录水平调控(Transcriptionalcontrol,翻译水平调控(Translationalcontrol,翻译后水平调控(Post-translationalcontrol。从mRNA角度考虑,实际上仅包括了转录水平调控,并不能全面代表蛋白质表达水平。实验也证明,组织中mRNA丰度与蛋白质丰度的相关性并不好,尤其对于低丰度蛋白质来说,相关性更差。更重要的是,蛋白质复杂的翻译后修饰、蛋白质的亚细胞定位或迁移、蛋白质-蛋白质相互作用等则几乎无法从mRNA水平来判断。毋庸置疑,蛋白质是生理功能的执行者,是生命现象的直接体现者,对蛋白质结构和功能的研究将直接阐明生命在生理或病理条件下的变化机制。蛋白质本身的存在形式和活动规律,如翻译后修饰、蛋白质间相互作用以及蛋白质构象等问题,仍依赖于直接对蛋白质的研究来解决。虽然蛋白质的可变性和多样性等特殊性质导致了蛋白质研究技术远远比核酸技术要复杂和困难得多,但正是这些特性参与和影响着整个生命过程。传统的对单个蛋白质进行研究的方式已无法满足后基因组时代的要求。这是因为:(1生命现象的发生往往是多因素影响的,必然涉及到多个蛋白质。(2多个蛋白质的参与是交织成网络的,或平行发生,或呈级联因果。(3在执行生理功能时蛋白质的表现是多样的、动态的,并不象基因组那样基本固定不变。因此要对生命的复杂活动有全面和深入的认识,必然要在整体、动态、网络的水平上对蛋白质进行研究。因此在上世纪90年代中期,国际上产生了一门新兴学科-蛋白质组学(Proteomics。它是以细胞内全部蛋白质的存在及其活动方式为研究对象。可以说蛋白质组研究的开展不仅是生命科学研究进入后基因组时代的里程碑,也是后基因组时代生命科学研究的核心内容之一。2蛋白质组学关键技术2.1双向凝胶电泳双向凝胶电泳的思路最早是由Smithies和Poulik[2]提出,蛋白质第一向电泳是根据其自由溶液迁移率(free-solutionmobility,在滤纸条上进行;第二向电泳方向与第一向垂直,在淀粉胶上进行。随后,双向电泳的支持介质逐渐转向聚丙烯酰胺凝胶[3],这即是双向凝胶电泳(two-dimensionalpolyacrylamidegelelectrophoresis,2DPAGE。同年,2DPAGE在原理上又有了新的发展,以第一向为蛋白质等电聚焦的双向凝胶电泳技术建立起来,即IEF[4-5]。20世纪70年代初,在第二向电泳中又使用了十二烷基磺酸钠(SDS[6-7],使第二向电泳基本上根据蛋白质的相对分子质量来分离,从而奠定了现代双向凝胶电泳的基础,即IEF-SDSPAGE。1975年,O’Farrell、Klose和Scheele分别对双向凝胶电泳做进一步的优化,建立了高分辨率的双向凝胶电泳[8-9]。此项技术是目前唯一能将数千种蛋白质同时分离并展示的分离技术,一般能分离1000–3000个蛋白质点,最好的胶能分离得到11000个左右的蛋白质点。先将蛋白质根据其等电点在pH梯度胶内进行等电聚焦,然后按照它们的相对分子质量大小进行SDS第二次电泳分离。第一向进行等电聚焦(isoelectricfocusing,IEF,由于蛋白质具有两性解离和等电点特性,将蛋白质样品加载至pH梯度介质上进行电泳时,会向与其所带电荷相反的电极方向移动。移动过程中,蛋白分子可能获得或失去质子,并随着移动的进行,该蛋白所带的电荷数和迁移速度下降。当蛋白迁移至其等电点pH位置时,其净电荷数为零,在电场中不再移动。当蛋白扩散到低于其等电点pH区域时,带正电荷,在电场的影响下重新向阴极移动。同样,如果蛋白质扩散到高于其等电点的pH区域时,则带负电,在电场的作用下会向阳极移动。根据各自不同的等电点,蛋白质最终被聚焦在一个很窄的pH梯度介质区域内。目前常使用预制胶条(IPG,immobilizedpHgradient用于蛋白质的等电聚焦分离,将聚焦好的IPG胶条在含有SDS的缓冲液中平衡。第二向是将在IPG胶条中经过第一向分离的蛋白质转移到SDS凝胶上,根据蛋白质的相对质量或分子量(MW大小与第一向相垂直的分离。沿垂直的方向进行SDS电泳,按分子量大小进行分离。样品经过电荷和质量两次分离后,得到等电点和分子量的信息。2.2生物质谱技术生物质谱技术是蛋白质组学研究中最重要的鉴定技术[10],其基本原理是样品分子离子化后,根据不同离子之间的荷质比(M/E的差异来分离并确定分子量。对于经过双向电泳分离的目标蛋白质用胰蛋白酶酶解(水解Lys或Arg的-C端形成的肽键成肽段,对这些肽段用质谱进行鉴定与分析。目前常用的质谱包括两种:基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS和电喷雾质谱(ESI-MS。MALDI的电离方式是Karas和Hillenkamp于1988年提出。MALDI的基本原理是将分析物分散在基质分子(尼古丁酸及其同系物中并形成晶体,当用激光(337nm的氮激光照射晶体时,基质分子吸收激光能量,样品解吸附,基质-样品之间发生电荷转移使样品分子电离。它从固相标本中产生离子,并在飞行管中测定其分子量,MALDI-TOF-MS一般用于肽质量指纹图谱,非常快速(每次分析只需3~5min,灵敏(达到fmol水平,可以精确测量肽段质量,但是如果在分析前不修饰肽段,MALDI-TOF-MS不能给出肽片段的序列。ESI-MS是利用高电场使质谱进样端的毛细管柱流出的液滴带电,在N2气流的作用下,液滴溶剂蒸发,表面积缩小,表面电荷密度不断增加,直至产生的库仑力与液滴表面张力达到雷利极限,液滴爆裂为带电的子液滴,这一过程不断重复使最终的液滴非常细小呈喷雾状,这时液滴表面的电场非常强大,使分析物离子化并以带单电荷或多电荷的离子形式进入质量分析器。ESI-MS从液相中产生离子,一般说来,肽段的混合物经过液相色谱分离后,经过偶联的与在线连接的离子阱质谱分析,给出肽片段的精确的氨基酸序列,但是分析时间一般较长。2.3酵母双杂交系统1989年,Field和Song[11]等根据当时人们对真核生物转录起始过程调控的认识,提出并建立了酵母双杂交系统,现已被用来检测已知蛋白质之间的相互作用、发现新的蛋白质和蛋白质的新功能、建立蛋白质作用图谱等。酵母双杂交系统(Yeasttwo-hybridsystem的建立是基于对真核生物调控转录起始过程的认识。细胞起始基因转录需要有反式转录激活因子的参与。反式转录激活因子,例如酵母转录因子GAL4在结构上是组件式的(modular,往往由两个或两个以上结构上可以分开,功能上相互独立的结构域(domain构成,其中有DNA结合功能域(DNAbindingdomain,DNA-BD和转录激活结构域(activationdomain,DNA-AD。这两个结合域将它们分开时仍分别具有功能,但不能激活转录,只有当被分开的两者通过适当的途径在空间上较为接近时,才能重新呈现完整的GAL4转录因子活性,并可激活上游激活序列(upstreamactivatingsequence,UAS的下游启动子,使启动子下游基因得到转录。将待测基因与Gal4或LexA或其他合适蛋白的DNA结合域融合构建诱饵质粒;将诱饵质粒转化缺乏报告基因启动子的酵母细胞株中,选择被转化的酵母;再将文库质粒转化到酵母中;通过报告基因的功能筛选相互作用的蛋白。酵母双杂交系统能在体内测定蛋白质的结合作用,具有高度敏感性。主要是由于:采用高拷贝和强启动子的表达载体使杂合蛋白过量表达。信号测定是在自然平衡浓度条件下进行,而如免疫共沉淀等物理方法为达到此条件需进行多次洗涤,降低了信号强度。杂交蛋白间稳定度可被激活结构域和结合结构域结合形成转录起始复合物而增强,后者又与启动子DNA结合,此三元复合体使其中各组分的结合趋于稳定。通过mRNA产生多种稳定的酶使信号放大。同时,酵母表型,X-Gal及HIS3蛋白表达等检测方法均很敏感。3展望蛋白质组学实验技术为直接在蛋白质水平上大规模研究基因功能提供了有力的工具,蛋白质组学的迅猛发展得益于其研究技术的不断突破。在研究技术上,目前已经出现了大大量灵敏度更高的、更有效的蛋白质分离鉴定方法,如二维色谱(2D-LC、多维液相色谱(MDLC、液相色谱毛细管电泳(LC-CE、二维色谱-串联质谱(2D-HOLC/MS-MS蛋白质芯片等。随着蛋白质研究数据的不断积累、蛋白质组研究技术方法的不断突破和生物信息学工具的日渐完善,蛋白质组学在研讨重大疾病机理、疾病诊断、疾病防治和新药开发,以及动植物生长、发育、进化及代谢条件等生命活动的规律方面会有重大突破。《蛋白质组学》课程论文参考文献[1]WilkinsMR,Governmentbacksproteomeproposal[J].Nature,1995,378(6558:653.[2]SmithiesO,PoulikMD.Two-dimensionalelectrophoresisofserumproteins.Nature,1956,177:1033.[3]MargolisJ,KenrickKG.Two-dimensionalresolutionofplasmaproteinsbycombinationofpolyac-rylamidediscandgradientgelelectrophoresis.Nature,1969,221:1056-1057.[4]DaleG,LatnerAL.Isoelectricfocusingofserumproteinsinacrylamidegelsfollowedbyelectrophoresis.ClinChimActa,1969,24:61-68.[5]MackoV,StegemannH.Mappingofpotatoproteinsbycombinedelctrofocusingandelectrophoresisidentificationofvarieties.Hoppe-seyler’sZPhysiol.Chem,1969,350:917-919.[6]BarrettT,GouldHJ.Tissueandspeciesspecificityofnon-histonechromatinproteins.BiochimBiophysActa,1973,294:165-170；MartiniOHW,GouldH.J.Enumerationofrabbitreticulocyteribosomalproteins.JMolBiol,1971,62:403-405.[7]StegemannH.proteinfraktionierungeninpolyacrylamidunddieanwendungaufdiegenetischeanalysebeipflanzen.AngewChem,1970,82:640.[8]O’FarrellPH.