酶联免疫吸附测定课件

酶联免疫吸附测定

（Enzyme-LinkedImmunosorbentAssay,ELISA）免疫学教研室酶联免疫吸附测定

（Enzyme-LinkedImmuno1用示踪物质标记抗体或抗原，使其与相应的抗原或抗体反应，使微量的、不可见的反应成为可见的或可测定的。CompanyLogo用示踪物质标记抗体或抗原，使其与相应的抗原或2免疫荧光技术CompanyLogo免CompanyL3用FITC-抗IgM单抗计数B细胞免疫荧光技术CompanyLogo用FITC-抗IgM单抗计数B细胞免www.themegal4课程内容ELISA的原理ELISA的分类间接ELISA的具体操作ELISA在医学中的应用实例CompanyLogo课程内容ELISA的原理www.themegallery.c5ELISA的原理

1.抗原抗体反应的特异性2.抗原或抗体的固相化3.抗原或抗体的酶标记ECompanyLogoELISA的原理1.抗原抗体反应的特异性Eww6间接ELISA实验目的：测小鼠IgG免疫兔血清中抗小鼠IgG抗体的效价实验材料：包被抗原：小鼠血清待检抗体/一抗：兔抗小鼠IgG酶标抗体/二抗：HRP-驴抗兔IgG聚苯乙烯酶标板水浴箱

移液器枪头包被液：pH9.6的碳酸盐缓冲液

封闭液/

封：5%脱脂奶粉(ALB)稀释液/稀：pH7.40.05M的PBS（磷酸盐缓冲液）

洗液：PBST（PBS+0.1%吐温20）

显色液：OPD（邻苯二胺）

终止液/终：2M硫酸鼠IgG(抗原)兔抗小鼠IgG(一抗)HRP-驴抗兔IgG(二抗)免疫Fc段CompanyLogo间接ELISA实验目的：测小鼠IgG免疫兔血清中抗小鼠IgG72-12号每孔１00uL稀释液，１号孔加入200uL一抗，从１号孔吸取100uL加到２号孔中，混匀，从２号孔吸取100uL加到３号孔中，混匀，．．．．．１１号孔吸取１００uL，丢弃！此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原，例如HBsAg、HBeAg、AFP等。DH2一般为无色化合物，经酶作用后氧化成为有色的产物。待检抗体/一抗：兔抗小鼠IgG葡萄糖氧化酶(GOD)洗涤：3次，1min/次CompanyLogo聚苯乙烯酶标板水浴箱CompanyLogo（二）间接法（测抗体）123456789101112β-Ｄ－半乳糖苷酶(β-Gal)包被：1：5000稀释的正常小鼠血清，4℃过夜只要获得针对受检抗原的特异性抗体，就可用于包被固相载体和制备酶结合物而建立此法。360,450

420碱性磷酸酯酶(AP)聚苯乙烯酶标板水浴箱辣根过氧化物酶(HRP)洗涤：3次，1min/次2-12号每孔１00uL稀释液，１号孔加入200uL一抗，从１号孔吸取100uL加到２号孔中，混匀，从２号孔吸取100uL加到３号孔中，混匀，．．．．．１１号孔吸取１００uL，丢弃！操作步骤包被：1：5000稀释的正常小鼠血清，4℃过夜→→→洗涤：3次，1min/次加酶标抗体：1:5000稀释的HRP标记的驴抗兔IgG抗血清，37℃２0min洗涤：3次，1min/次封闭：5%脱脂奶粉，37℃20min加待检抗体：倍比稀释的兔抗鼠IgG抗血清，37℃30min加底物液显色→洗涤：3次，1min/次→终止液终止显色空白对照无显色待测样品显色明显EEEE底物液每孔加１００ul!CompanyLogo2-12号每孔１00uL稀释液，１号孔加入200uL一抗，从8倍比稀释法与加样AB123456789101112

稀释液

顺序(每孔100ul)S稀释液一抗试管S1一抗原液CompanyLogo倍比稀释法与加样A顺序(每孔100ul)S稀释液一抗试管S19AB

123456789101112

稀释液

2-12号每孔１00uL稀释液，１号孔加入200uL一抗，从１号孔吸取100uL加到２号孔中，混匀，从２号孔吸取100uL加到３号孔中，混匀，．．．．．１１号孔吸取１００uL，丢弃！CompanyLogoA2-12号每孔１00uL稀释液，１号孔加入200uL一抗，10ELISA的分类（一）直接法（二）间接法（三）双抗体夹心法（四）竞争法CompanyLogoELISA的分类（一）直接法www.themegaller11间接法的原理为利用酶标记的抗抗体以检测已与固相结合的受检抗体，故称为间接法。其优点在于只要变换包被抗原就可利用同一酶标抗抗体建立检测相应抗体的方法。可用于传染病的诊断。（二）间接法（测抗体）酶标二抗一抗AgwashBSAwashwashTMBCompanyLogo间接法的原理为利用酶标记的抗抗体以检测已与固相结合的12（三）双抗体夹心法（测抗原）只要获得针对受检抗原的特异性抗体，就可用于包被固相载体和制备酶结合物而建立此法。此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原，例如HBsAg、HBeAg、AFP等。包被Ab酶标AbAgTMBwashwashwashCompanyLogo（三）双抗体夹心法（测抗原）只要获得针对受检抗原的特13（四）竞争法（HBcAb

）

当抗原材料中的干扰物质不易除去，或不易得到足够的纯化抗原时，可用此法检测特异性抗体；如HBeAb，HBcAb；

小分子抗原或半抗原缺乏可作夹心法的两个以上的位点，因此不能用双抗体夹心法进行测定，可以采用竞争法模式。小分子激素、药物等ELISA测定多用此法。

washTMBHBcAg酶标HBcAbwashHBcAbCompanyLogo（四）竞争法（HBcAb）当抗原材料中的干14病原微生物及其抗体检测如:肝炎病毒,SARS等

临床疾病诊断中的应用蛋白质测定:各种免疫球蛋白、补体、肿瘤标记物

非肽类激素测定：T3、T4，性激素测定……ELISA在医学中的应用CompanyLogo病原微生物及其抗体检测如:肝炎病毒,SARS等临床疾病诊断15ELISA在其他相关领域中的应用科研服务食品安全……环境卫生CompanyLogoELISA在其他相关领域中的应用科研服务食品安全……环境卫16DH2+H2O2

D+2H2ODH2为供氢体，H2O2为受氢体。DH2一般为无色化合物，经酶作用后氧化成为有色的产物。酶催化底物液显色ECompanyLogoDH2+H2O2D+2H2O酶催化底物17酶/E底物/DH2显色反应

测定波长nm

辣根过氧化物酶(HRP)邻苯二胺(OPD)

四甲替联苯胺(TMB)

氨基水杨酸

邻联苯甲胺

2,2‘-连胺基-2(3-乙基-并噻唑啉磺酸-6)铵盐

橘红色

黄色

棕色

兰色

蓝绿色492450449

425

642

碱性磷酸酯酶(AP)

4-硝基酚磷酸盐(PNP)

萘酚-AS-Mx磷酸盐+重氮盐黄色

红色400

500葡萄糖氧化酶(GOD)

ABTS+HRP+葡萄糖

葡萄糖+甲硫酚嗪+噻唑兰黄色

深蓝色405420β-Ｄ－半乳糖苷酶(β-Gal)甲基伞酮基半乳糖苷(4MuG)

硝基酚半乳糖苷(ONPG)荧光

黄色

360,450

420

CompanyLogo酶/E底物/DH2显色反应测定波长辣根过氧化物酶(H18ELISA在其他相关领域中的应用封闭液/封：5%脱脂奶粉(ALB)包被：1：5000稀释的正常小鼠血清，4℃过夜加样时从低浓度向高浓度方向进行themegallery.themegallery.阴性反应为无色或极浅。CompanyLogoELISA在其他相关领域中的应用碱性磷酸酯酶(AP)洗涤：3次，1min/次DH2一般为无色化合物，经酶作用后氧化成为有色的产物。根据颜色的深浅，以“＋”、“－”表示。加样时从低浓度向高浓度方向进行2MH2SO4具有腐蚀性，操作过程中应避免外溢ELISA在医学中的应用实例聚苯乙烯酶标板水浴箱间接法的原理为利用酶标记的抗抗体以检测已与固相结合的受检抗体，故称为间接法。CompanyLogoELISA在医学中的应用小分子抗原或半抗原缺乏可作夹心法的两个以上的位点，因此不能用双抗体夹心法进行测定，可以采用竞争法模式。结果的判定肉眼判定结果：于白色背景上直接肉眼观察。颜色越深，反应越强；阴性反应为无色或极浅。根据颜色的深浅，以“＋”、“－”表示。测定A值：在酶标仪上，根据不同底物设定波长（OPD底物为490nm，TMB底物为450nm），以空白孔调零后测各孔OD值。以高于阴性对照孔OD值2倍为阳性。CompanyLogoELISA在其他相关领域中的应用结果的判定肉眼判定结果：于白19结果的判定空白对照无显色，而样品显色明显且逐渐变浅待检样品孔显色明显空白对照CompanyLogo结果的判定空白对照无显色，而样品显色明显且逐渐变浅待检样品孔20注意事项对照的设定（阳性对照，阴性对照，空白对照）倍比稀释时，要正确操作；加样时从低浓度向高浓度方向进行终止反应的时间：以空白对照孔未显色为准2MH2SO4具有腐蚀性，操作过程中应避免外溢CompanyLogo注意事项对照的设定（阳性对照，阴性对照，空白对照）www.t21聚苯乙烯酶标板水浴箱洗涤：3次，1min/次包被：1：5000稀释的正常小鼠血清，4℃过夜只要获得针对受检抗原的特异性抗体，就可用于包被固相载体和制备酶结合物而建立此法。洗涤：3次，1min/次聚苯乙烯酶标板水浴箱CompanyLogo加酶标抗体：1:5000稀释的HRP标记的驴抗兔IgG抗血清，37℃２0minCompanyLogo其优点在于只要变换包被抗原就可利用同一酶标抗抗体建立检测相应抗体的方法。themegallery.加酶标抗体：1:5000稀释的HRP标记的驴抗兔IgG抗血清，37℃２0min如HBeAb，HBcAb；CompanyLogothemegallery.2-12号每孔１00uL稀释液，１号孔加入200uL一抗，从１号孔吸取100uL加到２号孔中，混匀，从２号孔吸取100uL加到３号孔中，混匀，．．．．．１１号孔吸取１００uL，丢弃！阴性反应为无色或极浅。肉眼判定结果：于白色背景上直接肉眼观察。themegallery.终止液/终：2M硫酸封闭液/封：5%脱脂奶粉(ALB)ELISA在医学中的应用实例三大免疫标记技术：放射免疫技术、荧光免疫技术、酶免疫技术。2MH2SO4具有腐蚀性，操作过程中应避免外溢CompanyLogo洗涤：3次，1min/次themegallery.DH2为供氢体，H2O2为受氢体。themegallery.聚苯乙烯酶标板水浴箱病原微生物及其抗体检测如:肝炎病毒,SARS等加样时从低浓度向高浓度方向进行酶标抗体/二抗：HRP-驴抗兔IgGCompanyLogo封闭液/封：5%脱脂奶粉(ALB)CompanyLogoβ-Ｄ－半乳糖苷酶(β-Gal)实验对照的设立及其意义蛋白质测定:各种免疫球蛋白、补体、肿瘤标记物其优点在于只要变换包被抗原就可利用同一酶标抗抗体建立检测相应抗体的方法。β-Ｄ－半乳糖苷酶(β-Gal)如HBeAb，HBcAb；ELISA在其他相关领域中的应用肉眼判定结果：于白色背景上直接肉眼观察。封闭：5%脱脂奶粉，37℃20min酶标抗体/二抗：HRP-驴抗兔IgGCompanyLogo聚苯乙烯酶标板水浴箱移液器枪头其优点在于只要变换包被抗原就可利用同一酶标抗抗体建立检测相应抗体的方法。β-Ｄ－半乳糖苷酶(β-Gal)加样时从低浓度向高浓度方向进行CompanyLogo终止反应的时间：以空白对照孔未显色为准CompanyLogo小分子抗原或半抗原缺乏可作夹心法的两个以上的位点，因此不能用双抗体夹心法进行测定，可以采用竞争法模式。葡萄糖氧化酶(GOD)什么是免疫标记技术？为什么要进行标记?CompanyLogoDH2一般为无色化合物，经酶作用后氧化成为有色的产物。实验对照的设立及其意义洗涤：3次，1min/次CompanyLogoCompanyLogo病原微生物及其抗体检测如:肝炎病毒,SARS等空白对照无显色，而样品显色明显且逐渐变浅显色液：OPD（邻苯二胺）测定A值：在酶标仪上，根据不同底物设定波长（OPD底物为490nm，TMB底物为450nm），以空白孔调零后测各孔OD值。CompanyLogo病原微生物及其抗体检测如:肝炎病毒,SARS等2MH2SO4具有腐蚀性，操作过程中应避免外溢CompanyLogothemegallery.themegallery.洗涤：3次，1min/次加样时从低浓度向高浓度方向进行此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原，例如HBsAg、HBeAg、AFP等。移液器枪头三大免疫标记技术：放射免疫技术、荧光免疫技术、酶免疫技术。加酶标抗体：1:5000稀释的HRP标记的驴抗兔IgG抗血清，37℃２0min（二）间接法（测抗体）需要搞清楚的问题1.什么是免疫标记技术？为什么要进行标记?

三大免疫标记技术：放射免疫技术、荧光免疫技术、酶免疫技术。2.ELISA的原理、定义及基本分类3.实验对照的设立及其意义4.了解ELISA在临床中的广泛应用CompanyLogo聚苯乙烯酶标板水浴箱封闭液/封：5%脱脂奶粉(22酶联免疫吸附测定

（Enzyme-LinkedImmunosorbentAssay,ELISA）免疫学教研室酶联免疫吸附测定

（Enzyme-LinkedImmuno23用示踪物质标记抗体或抗原，使其与相应的抗原或抗体反应，使微量的、不可见的反应成为可见的或可测定的。CompanyLogo用示踪物质标记抗体或抗原，使其与相应的抗原或24免疫荧光技术CompanyLogo免CompanyL25用FITC-抗IgM单抗计数B细胞免疫荧光技术CompanyLogo用FITC-抗IgM单抗计数B细胞免www.themegal26课程内容ELISA的原理ELISA的分类间接ELISA的具体操作ELISA在医学中的应用实例CompanyLogo课程内容ELISA的原理www.themegallery.c27ELISA的原理

1.抗原抗体反应的特异性2.抗原或抗体的固相化3.抗原或抗体的酶标记ECompanyLogoELISA的原理1.抗原抗体反应的特异性Eww28间接ELISA实验目的：测小鼠IgG免疫兔血清中抗小鼠IgG抗体的效价实验材料：包被抗原：小鼠血清待检抗体/一抗：兔抗小鼠IgG酶标抗体/二抗：HRP-驴抗兔IgG聚苯乙烯酶标板水浴箱

移液器枪头包被液：pH9.6的碳酸盐缓冲液

封闭液/

封：5%脱脂奶粉(ALB)稀释液/稀：pH7.40.05M的PBS（磷酸盐缓冲液）

洗液：PBST（PBS+0.1%吐温20）

显色液：OPD（邻苯二胺）

终止液/终：2M硫酸鼠IgG(抗原)兔抗小鼠IgG(一抗)HRP-驴抗兔IgG(二抗)免疫Fc段CompanyLogo间接ELISA实验目的：测小鼠IgG免疫兔血清中抗小鼠IgG292-12号每孔１00uL稀释液，１号孔加入200uL一抗，从１号孔吸取100uL加到２号孔中，混匀，从２号孔吸取100uL加到３号孔中，混匀，．．．．．１１号孔吸取１００uL，丢弃！此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原，例如HBsAg、HBeAg、AFP等。DH2一般为无色化合物，经酶作用后氧化成为有色的产物。待检抗体/一抗：兔抗小鼠IgG葡萄糖氧化酶(GOD)洗涤：3次，1min/次CompanyLogo聚苯乙烯酶标板水浴箱CompanyLogo（二）间接法（测抗体）123456789101112β-Ｄ－半乳糖苷酶(β-Gal)包被：1：5000稀释的正常小鼠血清，4℃过夜只要获得针对受检抗原的特异性抗体，就可用于包被固相载体和制备酶结合物而建立此法。360,450

420碱性磷酸酯酶(AP)聚苯乙烯酶标板水浴箱辣根过氧化物酶(HRP)洗涤：3次，1min/次2-12号每孔１00uL稀释液，１号孔加入200uL一抗，从１号孔吸取100uL加到２号孔中，混匀，从２号孔吸取100uL加到３号孔中，混匀，．．．．．１１号孔吸取１００uL，丢弃！操作步骤包被：1：5000稀释的正常小鼠血清，4℃过夜→→→洗涤：3次，1min/次加酶标抗体：1:5000稀释的HRP标记的驴抗兔IgG抗血清，37℃２0min洗涤：3次，1min/次封闭：5%脱脂奶粉，37℃20min加待检抗体：倍比稀释的兔抗鼠IgG抗血清，37℃30min加底物液显色→洗涤：3次，1min/次→终止液终止显色空白对照无显色待测样品显色明显EEEE底物液每孔加１００ul!CompanyLogo2-12号每孔１00uL稀释液，１号孔加入200uL一抗，从30倍比稀释法与加样AB123456789101112

稀释液

顺序(每孔100ul)S稀释液一抗试管S1一抗原液CompanyLogo倍比稀释法与加样A顺序(每孔100ul)S稀释液一抗试管S131AB

123456789101112

稀释液

2-12号每孔１00uL稀释液，１号孔加入200uL一抗，从１号孔吸取100uL加到２号孔中，混匀，从２号孔吸取100uL加到３号孔中，混匀，．．．．．１１号孔吸取１００uL，丢弃！CompanyLogoA2-12号每孔１00uL稀释液，１号孔加入200uL一抗，32ELISA的分类（一）直接法（二）间接法（三）双抗体夹心法（四）竞争法CompanyLogoELISA的分类（一）直接法www.themegaller33间接法的原理为利用酶标记的抗抗体以检测已与固相结合的受检抗体，故称为间接法。其优点在于只要变换包被抗原就可利用同一酶标抗抗体建立检测相应抗体的方法。可用于传染病的诊断。（二）间接法（测抗体）酶标二抗一抗AgwashBSAwashwashTMBCompanyLogo间接法的原理为利用酶标记的抗抗体以检测已与固相结合的34（三）双抗体夹心法（测抗原）只要获得针对受检抗原的特异性抗体，就可用于包被固相载体和制备酶结合物而建立此法。此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原，例如HBsAg、HBeAg、AFP等。包被Ab酶标AbAgTMBwashwashwashCompanyLogo（三）双抗体夹心法（测抗原）只要获得针对受检抗原的特35（四）竞争法（HBcAb

）

当抗原材料中的干扰物质不易除去，或不易得到足够的纯化抗原时，可用此法检测特异性抗体；如HBeAb，HBcAb；

小分子抗原或半抗原缺乏可作夹心法的两个以上的位点，因此不能用双抗体夹心法进行测定，可以采用竞争法模式。小分子激素、药物等ELISA测定多用此法。

washTMBHBcAg酶标HBcAbwashHBcAbCompanyLogo（四）竞争法（HBcAb）当抗原材料中的干36病原微生物及其抗体检测如:肝炎病毒,SARS等

临床疾病诊断中的应用蛋白质测定:各种免疫球蛋白、补体、肿瘤标记物

非肽类激素测定：T3、T4，性激素测定……ELISA在医学中的应用CompanyLogo病原微生物及其抗体检测如:肝炎病毒,SARS等临床疾病诊断37ELISA在其他相关领域中的应用科研服务食品安全……环境卫生CompanyLogoELISA在其他相关领域中的应用科研服务食品安全……环境卫38DH2+H2O2

D+2H2ODH2为供氢体，H2O2为受氢体。DH2一般为无色化合物，经酶作用后氧化成为有色的产物。酶催化底物液显色ECompanyLogoDH2+H2O2D+2H2O酶催化底物39酶/E底物/DH2显色反应

测定波长nm

辣根过氧化物酶(HRP)邻苯二胺(OPD)

四甲替联苯胺(TMB)

氨基水杨酸

邻联苯甲胺

2,2‘-连胺基-2(3-乙基-并噻唑啉磺酸-6)铵盐

橘红色

黄色

棕色

兰色

蓝绿色492450449

425

642

碱性磷酸酯酶(AP)

4-硝基酚磷酸盐(PNP)

萘酚-AS-Mx磷酸盐+重氮盐黄色

红色400

500葡萄糖氧化酶(GOD)

ABTS+HRP+葡萄糖

葡萄糖+甲硫酚嗪+噻唑兰黄色

深蓝色405420β-Ｄ－半乳糖苷酶(β-Gal)甲基伞酮基半乳糖苷(4MuG)

硝基酚半乳糖苷(ONPG)荧光

黄色

360,450

420

CompanyLogo酶/E底物/DH2显色反应测定波长辣根过氧化物酶(H40ELISA在其他相关领域中的应用封闭液/封：5%脱脂奶粉(ALB)包被：1：5000稀释的正常小鼠血清，4℃过夜加样时从低浓度向高浓度方向进行themegallery.themegallery.阴性反应为无色或极浅。CompanyLogoELISA在其他相关领域中的应用碱性磷酸酯酶(AP)洗涤：3次，1min/次DH2一般为无色化合物，经酶作用后氧化成为有色的产物。根据颜色的深浅，以“＋”、“－”表示。加样时从低浓度向高浓度方向进行2MH2SO4具有腐蚀性，操作过程中应避免外溢ELISA在医学中的应用实例聚苯乙烯酶标板水浴箱间接法的原理为利用酶标记的抗抗体以检测已与固相结合的受检抗体，故称为间接法。CompanyLogoELISA在医学中的应用小分子抗原或半抗原缺乏可作夹心法的两个以上的位点，因此不能用双抗体夹心法进行测定，可以采用竞争法模式。结果的判定肉眼判定结果：于白色背景上直接肉眼观察。颜色越深，反应越强；阴性反应为无色或极浅。根据颜色的深浅，以“＋”、“－”表示。测定A值：在酶标仪上，根据不同底物设定波长（OPD底物为490nm，TMB底物为450nm），以空白孔调零后测各孔OD值。以高于阴性对照孔OD值2倍为阳性。CompanyLogoELISA在其他相关领域中的应用结果的判定肉眼判定结果：于白41结果的判定空白对照无显色，而样品显色明显且逐渐变浅待检样品孔显色明显空白对照CompanyLogo结果的判定空白对照无显色，而样品显色明显且逐渐变浅待检样品孔42注意事项对照的设定（阳性对照，阴性对照，空白对照）倍比稀释时，要正确操作；加样时从低浓度向高浓度方向进行终止反应的时间：以空白对照孔未显色为准2MH2SO4具有腐蚀性，操作过程中应避免外溢CompanyLogo注意事项对照的设定（阳性对照，阴性对照，空白对照）www.t43聚苯乙烯酶标板水浴箱洗涤：3次，1min/次包被：1：5000稀释的正常小鼠血清，4℃过夜只要获得针对受检抗原的特异性抗体，就可用于包被固相载体和制备酶结合物而建立此法。洗涤：3次，1min/次聚苯乙烯酶标板水浴箱CompanyLogo加酶标抗体：1:5000稀释的HRP标记的驴抗兔IgG抗血清，37℃２0minCompanyLogo其优点在于只要变换包被抗原就可利用同一酶标抗抗体建立检测相应抗体的方法。themegallery.加酶标抗体：1:5000稀释的HRP标记的驴抗兔IgG抗血清，37℃２0min如HBeAb，HBcAb；CompanyLogothemegallery.2-12号每孔１00uL稀释液，１号孔加入200uL一抗，从１号孔吸取100uL加到２号