生物医学电镜技术-2014级研究生课件

生物医学电子显微镜技术

一概述1人眼的分辨本领：正常人眼在25cm明视距离内，所能分辨出的两个细节之间的最小距离，通常是δ=0.1-0.2mm。ABABAB光线物体玻璃透镜像(1)光镜成像的基本原理2光学显微镜

(3)提高分辨本领的方法

A：增加n值：油镜；B：增加sinα值：最大值为1；C：减小λ值：荧光显微镜和电子显微镜。限制光镜分辨率的关键因素是光的波长,光镜无论制作得如何精密都无法突破这一极限,所以科学发展之必然就是由光镜而发明电镜。光波可见光紫外光X－射线电子束（加速电压值）100V104V105V波长nm760-390390-1313-0.050.1230.01220.00373电子显微镜

(1)电子束的产生(光源)阴极钨丝阳极加速电压V(2)电子束波长与加速电压的关系。当电压较低时，λ=(1.5/V)1/2比如，V=100KV时，λ=0.0039nm，代入阿贝公式，则δ=（0.61λ）/（nsinα）=0.002nm。

加速电压V（kV）电子束波长l（nm）1000.00392000.002513000.001974000.001648000.0010310000.000872（3）电磁透镜：电磁透镜的本质是一个通过直流电的线圈所产生的磁场

。其作用是使电子束经多次会聚后成为具有很小直径的电子探针。电子探针与样品相互作用而产生信号。电磁透镜的成像公式与光学透镜的一样，即:1/a+1/b=1/f。式中a为物到透镜中心的距离即物距，b为像到透镜中心的距离即像距，f为透镜的焦距。像的放大倍率为M=b/a

4电子束与固体物质间的相互作用（信号种类）（1）

二次电子：样品原子的外层电子受入射电子激以发后，获得足够能量而逸出样品表面的电子，习惯上把能量低于50ev的信号电子统称为二次电子。能量范围：0-50ev；来源：样品最表面。ssd入射电子pspK、L、M为电子层s、p、d为电子亚层KLM原子核电子

δ与原子序数Z的关系:随着Z的增加，δ略微增加

二次电子像的用途：反映样品的表面形貌和表面元素组成，研究半导体材料和磁材料的特性。

δ与θ（由样品形貌决定其大小）关系：δ∝(secθ)n,n=1,2….A

切线

切线的法线

入射电子

（3）透射电子：当入射电子的能量足够大或样品足够薄时，有部分电子可以穿过样品而成为透射电子。

（4）特征X-射线：样品表面的内层电子逸出，在内层电子层上出现空穴，外层电子跃迁填补空穴，并伴随能量释放，从而发射出X-射线，该种X-射线的能量与原子中确定能级间的能量有关，因而叫做特征X-射线。特征X-射线适用于样品的元素分析。

ssd入射电子psps、p、d为电子亚层KLM原子核电子二次电子透射电子/散射电子特征X-射线来源入射电子入射电子样品功能扫描电镜，形貌分析透射电镜，超微结构能量谱仪，元素分析多种信号电子的比较(5)电子显微镜的发展简史1939年，透射电镜商品化1965年，扫描电镜商品化1931-32年，Ruska发明了第一台电镜，M＝141982年，英国A.Klug博士因利用高分辨率电镜测定核酸-蛋白质复合体的晶体结构获得诺贝尔化学奖1986年，Ruska获得诺贝尔物理奖

国内电镜发展始于1959年，黄兰友从左至右：ErnstRuska，GerdBinnig和HeinrichRohrer分别因为发明电子显微镜和扫描隧道显微镜而分享1986年的诺贝尔物理学奖二透射电镜（TransmissionElectronMicroscope,TEM)1透射电镜的结构

(1)电子光学系统（光源）

①电子枪：发射具有一定能量的电子束，包括阴极、阳极和栅极。阴极：发射电子。阳极：提供加速电压，控制电子束的能量。栅极：提供栅偏压，控制电子束的电流、最小交叉截面直径和张角。阴极钨丝阳极栅极第二聚光镜物镜光阑荧光屏第一聚光镜样品阴极钨丝阳极栅极第二聚光镜物镜光阑荧光屏第一聚光镜样品（2）成像系统①

物镜：决定分辨率的关键。②

中间镜③投影镜

(3)观察与记录系统（相机、底片、屏）(4)真空系统：延长灯丝的寿命，提高图像质量。(5)电子学系统：电路（1）电磁透镜的结构电磁透镜是指通以直流电的线圈所产生一个磁场。

（2）电磁透镜的作用使电子束会聚，且有焦点。改变磁场强度大小可以改变焦距大小：H大则f小。改变加速电压大小可以改变焦距：加速电压大则f大。2透射电镜的成像原理

（3）反差：（反射光的强度差异）样品的像与其背景在亮度上的差别。(4)透射电镜中入射电子与样品相互作用产生的信号电子bacdcdAa：入射电子；b：透射电子；c：小角度散射电子；d：大角度散射电子。入射电子束样品透射电子大角度散射电子小角度散射电子成像电子∵A点的密度、厚度与B点的密度、厚度不一样，即(

t)A≠(

t)B，∴成像电子数目A≠成像电子数目B即：A、B两点的亮度不一样，于是可分辨出A、B两点，如细胞质与细胞核，或不同的细胞器。bacdadcbccddABA：被观察点A；B：被观察点B；a：入射电子；b：透射电子；c：小角度散射电子；d：大角度散射电子。（6）提高反差的方法

A样品染色：

生物样品主要由C、H、O、N等轻元素组成。因而相邻点A、B间的质量厚度(

t)大体差不多，即图像的反差不大。如果把某些重金属离子人为地附着在样品上，则细胞核及其些细胞器上就会吸附一些重金属离子，如铅、铀等，从而与没有吸附离子的点或吸附少的点或吸附少的点相区别开来，即人为增加(

t)A

与(

t)B的差值。B调节电镜操作：缩小孔径角法、离焦观察法、暗场观察法、降低加速电压法。

3透射电镜的工作过程

在一定的真空程度下，电子枪发射具有一下能量的电子束，电子束经聚光镜和光阑作用后会聚到样品表面，产生透镜电子和散射电子，透射电子和部分散射电子通过物镜参与成像。图像经过中间镜和投影镜放大后显示在荧光屏或底片上，成为清晰可辨的放大图像。

电子探针样品透射电子散射电子物镜光阑、中间镜、投影镜图像显示屏或相机电子枪三级透镜电子束典型细胞及细胞器大鼠肝细胞：肝细胞内细胞器多，可作为真核细胞典型代表：细胞核N，核孔NP，核糖体Ri，粗面内质网RER，滑面内质网SER，线粒体Mi，溶酶体Ly，脂质粒L，紧密连接TJ。23000×5透射电镜在生物医学上的应用NNPRiMiSER典型细胞及细胞器大鼠肝脏透射电镜图：肝细胞呈多边形，内有典型的细胞器，核卵圆形，位于细胞中心。Sn：血窦；Ed：内皮细胞；Kf：枯否细胞；Bc：毛细胆管，胆汁由此排出。典型细胞核核卵圆形，核质是嗜碱性染色质，均匀散在的是DNA代谢活跃的常染色质，核周围稠密的异染色质呈粗颗粒，DNA代谢不活跃，核仁Nu清晰可见，核外粗面内质网很丰富。线粒体：左图为肝细胞，其线粒体呈圆形或卵圆形，嵴Ci短而疏，基质丰富，呈细颗粒状，偶见在少量结晶状物质，胞质中还可见溶酶体Ly、微体Mb和扩张的粗面内质网RER。右图是肾曲管上皮细胞的冷冻蚀刻照片，显示线粒体各种断裂面，有内膜内时层的外面A’，内膜外叶层的内面B’，外膜内叶层的外面A和横断面，其中富有颗粒的带状结构是嵴的横断面。线粒体不同形状的线粒体上图线粒体是由内外两层单位膜包围而成，外膜光滑平坦，内膜向内折叠形成许多嵴，嵴长而密，彼此呈平行排列，且与线粒体长垂直。下图的线粒体也由两层单位膜包围而成，其内膜折叠所成的嵴为弯曲的管状，其切面呈小泡状或短管状。胞质内有较丰富的滑面内质网和脂滴。脂肪细胞细胞内充满较大的脂滴L，脂滴着色淡而均匀，表面无包膜。细胞核挤在一侧，呈新月形，有核仁。胞质内有较多线粒体。质膜下有许多微饮泡Pt，质膜表面光滑，无微绒毛，有一薄薄层基板附着。左上角还可见到一毛细血管。小肠粘膜上皮吸收细胞Lu：肠腔；f：纵行细丝；JC：复合连接体，纹状缘加大细胞表面积，有利于物质吸收，19000×

左图是小鼠小肠粘膜上皮细胞顶部的纵切面，在细胞游离面有许多指状突起，称为微绒毛。它们伸入肠腔Lu，长短一致，排列整齐。微绒毛内有细胞，与纵轴平行。细丝f向下插入上皮细胞顶部，与终末网W的细丝相交织。微绒毛表面有薄层细胞衣C。右图是小鼠小肠上皮细胞冷冻蚀刻图像。细胞质膜内蝇层外面A颗粒多，质膜外叶层内面B光滑，仅有少量颗粒，可见微绒毛的断面，CW为终末网。小鼠小肠粘膜上皮细纹状缘的横切面图，从微绒毛的横断面上可看出质膜的三层结构，膜外有一层茸毛状的细胞衣，每根微绒毛内含许多细丝。连接体TJ：相邻两细胞C1和C2的紧密连接带；IJ：中间连接；De：桥粒。37500×典型红细胞人外周血红细胞两面凹陷成扁圆形，表面有一层质膜，内含均质、无定形的致密物。1是垂直切面，2为水平切面，中心浅淡是因细胞中心较薄所致。TEM12小淋巴细胞上图：人外周血小淋巴细胞，细胞核大而浓染，胞质内细胞器不多，仅有少量大的呈卵圆形的线粒体和核糖体。细胞表面有许多短的微绒毛，图右上角是一红细胞，右下角是血小板。血小板下图：人外周血血小板，血小板直径为2-4um，表面有质膜CM，膜外有一层较厚的粘多糖外衣。左上角插图是人血小板的致密颗粒，右下角插图是家兔血小板的致密颗粒。毛细血管大鼠肾上腺皮质的血窦由内皮细胞Li构成，有窗孔，孔径一般较大，大多数无隔膜。内皮细胞外面无基膜，可见周细胞突起Pe。血窦外周为束状带上皮细胞。成骨细胞人胚胫骨骺端的骨小梁，左下角骨板内有染色深的磷灰石结晶。骨板上方有几个成骨细胞，细胞略呈多边形，胞质中有在量粗内质网和线粒体。右上角为骨髓腔内的幼稚血细胞。4500下：成骨细胞胞核较大，核质分布均匀，核仁明显。心肌纤维上图为心室心肌纤维纵切面，图示心肌纤维的横纹与骨骼肌纤维相似。肌节中可见Z线、A带、I带、H带和M线。二联体位于Z线处，由T管和肌质网SR组成。下图为心室心肌纤维横切面，主要显示相邻心肌纤维以闰盘相连，闰盘呈阶梯状，其水平部分由粘合带IM相连接，纵行部分可见缝隙连接，图中间可见心肌细胞呈分叉状。横纹肌纵切面上有明显模纹，A带着色深，中央为较淡的H带；H带中间是M线；I带中间是Z线；SR：肌浆网；SR与扁平的T膜囊TS并列，构成三联体。肾小球及其病理变化血管腔内有红细胞；Ed：毛细血管的内皮细胞；BM：基膜；Ep：脏层上皮细胞，即足细胞，外形不规则，有许多指突突起FP’。5000和×12800肾小球及其病理变化a正常人肾小球；b系膜增长性病变：系膜淀粉样变化；c肾小球微小病变：足突融合；d基底膜病变：基底膜增厚胶原纤维人肺胞隔间质，显示胶原微纤维横断面，微纤维集合成束，组成胶原纤维。成纤维细胞的胞突伸入胶原纤维间，图中上方一组胶原微纤维中有小束无髓鞘神经，图右侧为成纤维细胞的胞体。左图是人肺泡隔间质：显示一束胶原微纤维的横断面，其直径为30-100nm，另可见纤维细胞的细长突起F和弹性纤维EI。40000。右图是分离的胶原纤维负染标本：图示一条胶原微纤维，上有明显的周期横纹，每一周期内有A，B两个亚带，A带较浅，B带较深，在S，B两带中还可见到更细的横纹，以及与胸原微纤维纵轴平行的纵行细丝。伤寒杆菌及其鞭毛的复型透射电镜图24000腺病毒（AV）

是研究20面体对称结构的典范，AV：胞核内的晶格排列；LB：核内呈板层结构的包涵体；NM：双层核膜；Ch：染色质；Go：高尔基体。47000腺病毒负染病毒被细胞核膜包着，仍然保持着晶格的排列。武汉病毒研究所观察到的冠状病毒样颗粒(中科院网站公布)感染“非典”病毒患者的肺部组织切片的照片。冠状病毒样模型

临床诊断肝炎病毒纳米材料纳米复合材料由纳米级的壳聚糖晶须增强缓释微胶囊，微胶囊中包合天冬酰胺酶，用于治疗儿童急淋白血病。高分子材料微观结构TEM观察到高分子材料的纳米级有序结构，是通过分子自组装而实现的，可能具有某些仿生特点。箭头所示为三层结构123在直径50nm的碳纳米管上缠有直径为5nm左右的细碳纳米管，这种现象非常少见。三扫描电镜（ScanningElectronMicroscope,SEM）

1SEM的结构

(1)电子光学系统

①电子枪：发射具有一定能量的电子束，包括阴极、阳极和栅极。阴极：发射电子。阳极：提供加速电压，控制电子束的能量。栅极：提供栅偏压，控制电子束的电流、最小交叉截面直径和张角。阴极阳极栅极第一聚光镜第二聚光镜物镜样品CRT二次电子E-T探测器扫描线圈②

聚光镜：使电子束会聚的电磁透镜。物镜：最末一个聚光镜。工作距离：物镜到样品表面中心的距离。光阑：挡掉多余的电子，控制电子束的直径，分为固定光阑和可动光阑。可动光阑示意图固定光阑示意图阴极阳极栅极第一聚光镜第二聚光镜物镜样品CRT二次电子E-T探测器扫描线圈电子枪③扫描线圈ABCABDCA’B’D’C’使电子束在样品表面作栅状扫描的系统。控制电子束的扫描速度（快扫、慢扫）和扫描范围（放大倍数M）。

电流I阴极阳极栅极第一聚光镜第二聚光镜物镜样品CRT二次电子E-T探测器扫描线圈信号收集、处理、显示系统（2）信号收集、处理、显示系统Everhart-Thornley型探测器，（E-T探测器）：结构：金属屏蔽罩、闪烁体（将电子转变为光子即电信号被转变为光信号)、光导管（传递光子）、光电倍增管（放大、处理光信号）。工作过程：入射电子束样品电子，电信号光子，光信号闪烁体E-T探测器图像，视频信号CRT阴极阳极栅极第一聚光镜第二聚光镜物镜样品CRT二次电子E-T探测器扫描线圈电子枪放大倍率M：M＝B图像宽度/b扫描范围b：扫描范围内样品宽度，B：图像的宽度。改变扫描线圈上电流的大小和周期改变扫描范围b的大小改变放大倍数M（3）样品室（4）

真空系统：保护灯丝，提高图像质量2扫描电镜的工作过程

在一定的真空度下，电子枪发射具有一定能量的电子束，电子束经三级透镜和光阑后，会聚为直径只有5-50nm的电子探针，电子探针受扫描线圈作用，在样品表面作栅状扫描；同时，电子探针与样品相互作用而产生多种信号电子；信号电子被探测器收集、处理，得到荧光屏上显示的样品表面的放大图像。

电子探针样品信号电子E-T探测器图像CRT电子枪三级透镜电子束扫描线圈3扫描电镜的成像原理：反差的形成A

B

二次电子产率与δ与θ（由样品形貌决定）的关系：

∵δ＝(secθ)n，∴δA＝secθA,δB＝secθB,

又∵θA≠θB，∴δA≠δB即：A、B两点的信号强度不同，从而形成反差，能分辨出A与B。扫描电镜的功能：反映样品的表面形貌。反映样品的元素组成。反映样品的电、磁特性分析和晶体特性。反映样品的某些特殊性能。5扫描电镜的操作要点加速电压的选择；工作距离的选择；可动光阑孔径的选择：可动不阑孔径对分辨率的影响、对亮度的影响6扫描电镜常规制样方法取材清洗脱水固定粘台干燥喷金观察只要是固体或可处理为固体的物质，均可用SEM观察其表面结构，或经断裂后观察其内部结构，并可进行尺寸测量。

7扫描电镜的特点图像立体感强；放大倍率可变范围大，且分辨率较高；制样简单、样品受到的热损伤和污染程度小；可实现多功能分析；可与其它仪器联机使用。

8EM与OM的比较、SEM与TEM的比较（1）EM和OM：光源、透镜、成像原理、功能用途、放大倍数（2）SEM和TEM：结构：扫描线圈、样品室、成像系统原理：二次电子或透射电子、值或t值、虚像或实像工作条件：加速电压、对样品的污染用途：表面或内部结构观察放大倍数：光源聚光镜样品物镜目镜投影镜电子枪扫描线圈电磁透镜样品探测器电磁透镜光镜透射电镜扫描电镜肉眼直接观察图像图像投到荧光屏上图像模拟显示在视屏上血细胞扫描电镜图TL：T淋巴细胞；Mo：单核细胞，有足突8500；BL：B淋巴细胞；Er:典型红细胞12000×；Gr：颗粒白细胞9扫描电镜在生物医学上的应用TEM寄生虫卵扫描电镜图左图为肝吸虫卵，前端卵盖已脱落；后端有一小突起，3000,大小为31.717m；右图为湖北江陵2100多年前的古尸体内吸虫卵，其外形、大小与现代肝吸虫卵相似。寄生虫卵扫描电镜图

绦虫卵，呈圆球形，大小约42um，卵壳表面有许多大小不等的乳头状突起。胃上皮细胞扫描电镜细胞排列整齐，大小一致，表面光滑。铀矿工头发的扫描电镜观察图1：无井下作业史人员的头发，毛干呈圆柱形,被覆以毛干表面一层鳞片状毛小皮细胞排列有序,层数较多,大致互相平行,彼此扣合紧密。毛小皮间的间距较均匀,游离缘与毛干长轴基本垂直,且倾向毛干末端,微凸微凹呈小锯齿状,轮廓清楚,并以小而尖锐形为主。图2：氡子体累积暴露量50WLM以下时,毛小皮与毛小皮之间的间距显示出一些疏密不均,游离缘微凸，微凹的锯齿变得较平滑,其它微细结构同对照组相比,未见明显的变化。随着辐射的累积的增加，毛小皮细胞鳞片、毛小皮间距、游离缘锯齿状的形态结构等都而向着损伤程度加剧的方向变化，最后出现较为严重的损伤：毛小皮边缘外翻、粘连以及脱落等。1.对照组钉螺的头足部外形(30×)；2.对照组钉螺的头部放大(2500×)；3.对照组钉螺的足部放大(800×)；4.对照组钉螺的外套膜(800×)；5.1.0g/L浸泡组钉螺的头足部外形(30×)；6.1.0g/L浸泡组钉螺的头部放大(2500×)；7.1.0g/L浸泡组钉螺的足部放大(800×);8.1.0g/L浸泡组钉螺的外套膜(800×)；9.对照组钉螺的肝部内脏囊(60×)；10.1.0g/L浸泡组钉螺的肝部内脏囊(60×)；11.对照组钉螺的肝部内脏囊放大(3000×)；12.1.0g/L浸泡组钉螺的肝部内脏囊放大(3000×)扫描电镜下的蚊子扫描电镜下的真菌上图示出一种可生物降解的无生物毒性的组织工程材料与骨髓基质细胞（BMSC）一起培养后的SEM图片。在培养6h后，细胞在材料表面很好地附着；在9d之后，细胞在高聚物材料表面发育为单层细胞层，由此体现出这种材料良好的生物相容性。进一步研究表明，这种细胞还可进入材料内层，说明骨髓基质细胞可以培养在这种材料表面，二者具有较好的相容性。A:6hB:9d扫描电镜观察细胞与材料的关系图中所示为蛋白质与纤维素的复合物，比纯纤维素具有更好的细胞相容性。扫描电镜观察细胞与材料的关系培养在改性后的复合材料表面的ECV细胞随着复合材料组成的变化，其表面形貌发生变化，孔径大小发生变化。多孔材料的形貌观察及孔径测量聚氨酯（PU）和添加了聚氧化乙烯（PEO）交联后的嵌段共聚物分别与富含血小板的血浆一起孵育，然后用SEM观察高聚物表面对血小板的粘附状况。上图示出，无论是PU或是含有PEO交联后的共聚物都具有吸附血小板的能力，但随着PEO链长的增加，这种吸附能力在减弱。经PEO适度交联后，既保持了原来PU的生物相容性，又提高了材料的力学性能，从而可能开辟这种材料在生物医学方面的潜在用途。

SEM观察生物材料的血液相容性纳米级和微米级颗粒的形貌观察和尺寸计算。纳米技术及自组装技术在生物医学上的应用：靶向药物、缓释药物的设计；具有新型医学、医疗功能材料的开发。纳米纤维各种纳米颗粒或纳米晶高分子微球的SEM观察包容了药物的高分子微球：具有良好的药物控制释放作用。高分子海绵样品的SEM观察多孔结构和类似通道一样的微观结构四原子力显微镜（AtomicForceMicroscope,AFM)1基本原理和方法(原子力)（1）基本原理：原子力显微镜是将一个对微弱力极敏感的微悬臂一端固定，另一端有一个微小的针尖，其尖端原子与样品表面原子间存在极微弱的排斥力（10–8~10–6N），利用光学检测法或隧道电流检测法，通过测量针尖与样品表面原子间的作用力获得样品表面形貌的三维信息。当针尖接近样品时，将受到力的作用使悬臂发生偏转或振幅改变。悬臂的这种变化经检测系统检测后转变成电信号传递给反馈系统和成像系统，记录扫描过程中一系列探针变化可获得样品表面信息图像。

AFM原理图AFM结构图扫描器：AFM依靠扫描器控制对样品扫描的精度反馈系统：AFM有力恒定方式和高度恒定两种基本方式。力恒定方式（Constant-ForceMode）：设置样品与针尖之间作用力恒定（悬臂弯曲度不变），记录x、y方向扫描时z方向扫描器的移动来获得样品的表面形态；高度恒定方式（Constant-HeightMode）：针尖相对于样品的高度一定，记录扫描器在z方向的运动而成像，该方法适于观察原子、分子的图像。

（2）仪器组成多种方法检测：光反射法、光干涉法、隧道电流法、电容检测法等。（3）成像模式接触模式（ContactMode）：是指原子力显微镜的探针与试样相互接触、相互作用力位于F/S曲线的斥力区。非接触模式（Non-contactMode）：是指原子力显微镜的探针与试样保持一定的空间距离，相互作用力位于F/S曲线的引力区。共振模式（TappingMode）：是指悬臂在z方向驱动共振，控制振幅在一恒定值，记录z方向扫描器的移动而成像，针尖与样品可以接触，也可以不接触，适用于易形变的软质样品。

（4）相关技术（1）侧向力显微镜（LateralForceMicrosc