动物人工授精课件

一、学习目标1.掌握（1）人工授精的概念、人工授精主要技术环节

（2）采精（采精场地、采精准备、采精频率）

（3）稀释液的主要成分及作用，稀释液的配置与保存，精液稀释的程序与方法

（4）精液的常温保存、低温保存以及冷冻保存的原理、程序与方法；冷冻精液解冻的程序与方法，冷冻精液的贮存与运输方法

（5）输精：输精前准备，输精要求与方法2.理解

（1）人工授精的意义

（2）精液品质评价指标与方法

（3）影响输精成功率的因素二、学习重点与难点

1.重点采精与精液品质评价、精液稀释和保存、输精

2.难点精液冷冻保存原理二、人工授精

人工授精（artificialinsemination,AI）是指用特定的器械采集公畜的精液，通过检查、稀释、保存等适当处理后，再用器械把精液输入到发情母畜的生殖道内，以代替公母畜自然交配而繁殖后代的一种繁殖技术。1780年，意大利生理学家Spallanzani将公犬的精子注入母犬生殖道，获得了3只小犬，这是人类第一次进行的人工授精尝试。1899年，前苏联科学家开始研究家畜的人工授精技术，Ivanoff起初的研究对象是马，但首次成功进行了牛和绵羊的人工授精。我国家畜的人工授精技术研究始于1935年的句容种马场，到1951年以后，随着我国畜牧业的迅速发展，人工授精技术得到推广，主要在东北推广马的人工授精。奶牛的人工受精始于20世纪50年代中期，到70年代已经普及冷冻精液进行人工授精。目前，我国各省、市、自治区都建有冷冻精液站，城郊和大型乳牛场采用冻精配种的奶牛几乎为100%。其它家畜冻精人工授精工作也在一定的范围内得到应用。三、人工授精的意义1.有效改变家畜的配种过程，提高优良种公畜的配种效能和种用价值，充分发挥公畜繁殖潜力。

畜种自然交配人工授精猪30～60头/年200～400头/年牛20～40头/年6000～12000头/年羊30～50只/年7000～10000只/年马30～50匹/年200～400匹/年

2.加速家畜品种改良，促进育种工作进程。人工授精大大提高了公畜的配种效能，就能选择最优秀的公畜用于配种，从而成为迅速增殖良种家畜的有效方法和改良畜种进行育种工作的有力手段。

3.减少了种公畜的饲养头数，降低饲养管理费用。

4.配种时公母畜互不接触，可防止某些生殖疾病的传播。由于人工授精必须严格遵守操作规程，只有健康的公母畜才能用作人工授精，因此可减少和防止因本交引起的传染性疾病，如布氏杆菌病、毛滴虫病、胎儿弧菌病、传染性流产、马媾疫等。四、人工授精技术的基本环节人工授精技术的基本技术环节包括采精、精液品质检查、精液的稀释、精液的分装、精液的保存（液态保存、冷冻保存）、精液的运输、冷冻精液的解冻与检查、输精等。7.有利于精液的长期保存与利用8.为开展生殖生物技术科学研究提供了有效手段项目自然配种人工授精饲养公牛数需依母牛数决定少或无需饲养遗传选择性较低较高可配种時间较长较短同期配种较不易容易疾病控制较不易容易所需技术无需需配合相关技术小知识（二）台畜台畜(dummy)的选择必须满足种公畜的要求，可利用活台畜或者假台畜。采精时用发情良好的母畜做台畜效果最好，经过训练的公母畜皆可作为台畜。假台畜即采精台，模仿母畜体型大小，选用金属材料或木料做成的具有一定支撑力的支架。假台畜要求大小适宜，坚实牢固，表面柔软干净，用畜皮、人造革等伪装。牛采精架的构造采精用假台畜

◆在假台畜的后躯涂抹发情母畜的阴道粘液或尿液。其目的是刺激公畜性欲并引诱其爬跨假台畜，经过几次采精后即可调教成功。

◆以发情母畜诱性，在公畜达到性高潮时诱导爬跨假台畜。在假台畜旁边牵一发情母畜，诱使其爬跨数次，但不使其交配，当公畜性欲达到高峰时迅速牵走母畜，令其爬跨假台畜。公畜调教的基本方法

◆观看调教好的公畜爬跨假台畜。将需要调教的公畜拴系在假台畜附近，让其观看另一头已经调教好的公畜爬跨假台畜采精，然后再诱导其爬跨假台畜。公畜调教的注意事项1.调教过程中要反复进行训练，耐心诱导，切勿强迫、恐吓、抽打等，以防止性抑制而造成调教困难。2.调教时应注意公畜外生殖器的清洁卫生。3.调教时间最好选择在早上，早上公畜精力充沛，性欲旺盛。4.调教时间、地点要固定，每次调教时间不宜过长。（三）性准备公畜在采精前，空爬跨几次台畜，可以提高精子数量及精子活率，这个空爬跨过程叫性准备。常采用以下方法来做好性准备：1.改换台畜

2.变换台畜位置

3.观摩其他家畜爬跨——示范作用

4.自身空爬（注意：有的公畜有自淫现象，就不能性刺激）（四）药液的准备1.配制稀释液后讲。2.配制润滑剂（向凡士林加入1/3的液体石蜡，高压灭菌后凉冷，每周灭菌一次，并润滑内胎）。3.配制70%～75%的酒精。4.配制小苏打液。取小苏打粉2g加温开水100ml，消毒公畜包皮，母畜后躯及洗涤器械、桌面等。5.煤酚皂液（来苏儿）。取2ml加温开水100ml，消毒母畜的外阴部。二、采精方法一种理想的采精方法，应具备以下四个条件或者遵循以下四个基本原则：①可全部收集公畜一次射出的精液②不影响精液品质③公畜生殖器官和性机能不会受到损伤或影响④器械用具简单，使用方便目前在生产中常用的采精方法有：假阴道法、手握法、按摩法和电刺激法，其中以假阴道法最为理想。(一)假阴道法

假阴道法是用模拟母畜阴道环境制成的人工阴道，诱导公畜在其中射精而获取精液的方法。1.假阴道的结构和具备条件假阴道(artificialvagina)是一筒状结构，主要由外壳、内胎、集精杯及其附件组成。外壳为筒状，可用硬质塑料或镀锌铁皮制成；内胎为弹性强、薄而柔软无毒的橡胶筒，装在外壳内，构成假阴道内壁；集精杯由暗色玻璃或胶质制成，装在假阴道的一端。固定内胎的胶圈，保定集精杯(牛)有三角保定带，充气用的活塞和双连球，连接集精瓶(猪)或集精管(牛)的胶漏斗，以及为防止精液污染而敷设在假阴道入口处的泡沫塑料垫，用于固定龟头(猪)用的螺旋橡胶圈等，称为附件。假阴道在使用时先安装内胎，然后消毒、冲洗、注水、涂滑润剂、调节温度和压力等步骤，使假阴道达到与母畜阴道环境相似的条件。(1)适当温度注入相当假阴道容积2/3的温水，采精时保持38～40℃。集精杯应保持34～35℃。

(2)适当压力借助注入水和空气来调节假阴道的压力。以假阴道内胎入口处形成Y

形为宜。

(3)适当润滑度用消毒过的润滑剂对假阴道内表面润滑，涂抹部位是假阴道全长的1/2～1/3。

(4)无菌凡是接触精液的部分如内胎、集精杯及橡胶漏斗均须严格消毒。(5)无破损漏洞外壳、内胎、集精杯不得漏水或漏气。2.采精操作一种比较安全而简单的方法是将假阴道安放在能够调节假阴道角度的假台畜后躯内，任由公畜爬跨而在假阴道内射精。A.安装假阴道B.引导公畜至台畜后面，诱导公畜爬跨C.及时将阴茎导入假阴道D.向下倾斜假阴道的集精杯端，收集精液E.当阴茎慢慢回缩自动脱出时，将假阴道直立、放气、放水F.精液送化验室进行检查

公牛采精：采精员站在台畜的右后侧，右手握住假阴道，集精杯一端向上。当公畜爬跨时，使假阴道与公畜阴茎伸出方向成直线，迅速将阴茎导入假阴道内，公畜的后躯向前冲即射精，随后将假阴道集精杯一端向下倾斜，以便使精液完全流入集精杯内。当公畜爬下时，采精人员应持假阴道随阴茎后移，打开开关，放出空气，待阴茎自行软缩脱出后，迅速取下假阴道，立即送往精液处理室检查，取下集精杯，盖上集精杯盖。

采精员蹲在假台畜一侧，戴上灭菌手套，待公猪爬跨台畜后，用0.1%高锰酸钾溶液将公猪包皮附近洗净消毒，并用生理盐水冲洗，然后将手捏成空拳，于公猪阴茎伸出同时，导入空拳内，一松一紧有节奏性地施加压力，以不使阴茎滑脱为标准，待阴茎充分勃起时即可引起公猪射精。另一只手持保温的集精瓶(带有过滤纱布)收集浓精部分的精液。公猪射精停止，可按上述法再次施加压力，即可第2或第3次射精，待射精全部结束时再松开阴茎。分段采精：弃掉含副性腺分泌物多、精子较少、精液清亮白色的第一段和精液较稀、清亮、精子少的第三段，只收集精液浓、精子多、呈乳白色的第二段。(三)按摩法按摩法适用于无爬跨能力的公牛和禽类。对于牛，先将直肠宿粪排除，再将手伸入直肠约25cm处，按摩精囊腺和输精管壶腹，使精液流出，同时由助手按摩阴茎S状弯曲部使阴茎伸出，便于收集精液。鸡采精时由助手两手分握公鸡两腿，以自然宽度分开，尾部朝向术者，泄殖腔周围剪毛消毒后，采精员右手拇指与食指在泄殖腔下部两侧抖动触摸腹部柔软处，然后迅速轻轻用力向上抵压泄殖腔，使交配器翻出；固定在泄殖腔两上侧的左手拇指和食指微微挤压，精液即可顺利排出。三、采精频率

采精频率(frequencyofsemencollection)是指每周内对公畜的采精次数。1g睾丸组织每周大约生产5000万精子。

牛：成年公牛一般每周采精2次，每次连续采精2遍。也可每周采精3次，隔日采精。牛每次射精约为100～150亿。羊：附睾贮存量大而射精量少，由于配种季节短，每天可采精多次而不影响精液品质。每次射精约为20～30亿。

猪：射精量大，很快使附睾内贮存精子彻底排空，成年公猪采精最好隔日1次。每次射精约为300～500亿。

马：射精量大，很快使附睾内贮存精子彻底排空，采精最好隔日1次。每次射精约为100～150亿。

精液品质检查的目的在于确定精液品质的优劣，以此作为精液稀释、保存的依据。同时，也反映种公畜饲养管理水平和生殖器官的机能状态，以及精液在稀释、保存、冷冻和运输过程中的品质变化及处理效果。采得精液后，要迅速置于37℃条件下进行检查。现行评定精液品质的方法主要有外观检查法、显微镜检查法、生物化学法等。无论哪一种检查法，都必须以受精力高低为依据。第三节精液品质检查一、精液外观和精液量1.云雾状牛、羊、鹿、犬和狐的精液因精子密度大而混浊不透明。肉眼观察刚采得的新鲜精液时，可看到如翻腾滚滚的雾状，这是精子密度大而运动又非常活跃的表现。精液混浊度越大，云雾状越显著，精子密度和活率也就越高。云雾状显著者可用“+++”表示；比较显著用“++表示；不显著用“+”表示；如果没有云雾状则用“-”表示。马、猪的精子少，混浊度也较低，云雾状不显著。2.气味公畜的精液略带腥味。如有异常气味，可能是混有尿液、脓液、尘土、粪渣或其他异物的表现，应废弃。色泽与气味检查可以结合进行，使鉴定结果更为准确。

新鲜收集的羊、牛、马、猪（从左到右）的射出精液

3.色泽正常精液的颜色为乳白色和灰白色，且精子密度越高，乳白程度越浓，其透明度也就越低。正常牛、羊、鹿、犬和狐的精液均呈乳白色或灰白色，但有时呈乳黄色（多见于牛)；猪、马、兔均为淡乳白色或浅灰白色。4.射精量(semenvolume)公畜一次采精射出精液的容量。射精量因动物种类、品种及个体的不同而不同。同一个体也会因年龄、营养、性准备、采精方法、采精频率而有所变化。畜种马驴牛羊猪犬兔鹿狐平均射精量（ml）7050412505131正常范围（ml）30～10020～802～100.5～2150～5002～150.2～22～50.5～3二、精子活率

精子活率（spermmotility）就是指精液中呈直线前进运动的精子数占总精子数的百分比。直线运动的精子是指精子近似直线地从一点移动或前进到另一点，也称为有效精子。精子的运动方式有摆动、旋转、曲线前进和直线前进运动几种。其中只有直线前进运动的精子才具有正常的生存和受精能力，与精子的受精力密切相关。精子活率的测定是评定精液品质优劣的一个重要指标。一般在采精后、精液处理前后、输精前都应进行检查。精子活率一般采用十级评分法来表示。即按精子直线运动占视野中精子的估计百分比来表示。若精子100%呈直线前进运动，则评为1.0，90%即为0.9，依此类推。一般新鲜精液活率为0.7～0.9左右。其中奶牛的精液比水牛高，驴的比马的高，猪的浓精和牛相似。为了保证有较高的受胎率，用于输精的精子活率应达到一定等级，液态保存的精液应在0.5～0.6以上，冷冻保存的精液在0.3以上。

精子活率的检查通常是在200～400倍显微镜下进行。由于精子受温度的影响较大，检查时应在37℃左右进行，最好用带有电热装置的显微镜。牛精子活力检查的程序载玻片预温精液稀释取样检查镜检活力估测活力记录将恒温加热板放在载物台上，打开电源并调整控制温度至37℃，然后放在载玻片

将生理盐水与精液等温后，按1:10稀释取10ul放在预温后载玻片中间，盖上盖玻片用100倍和400倍观察判断视野中前进运动精子占的百分率

按10级制评分和记录三、精子密度

精子密度(spermconcentration)也称精子浓度，指精液的单位容积(通常是1ml)内所含有的精子数目。目前测定精子密度的主要方法有目测法、血细胞计数法和光电比色法等。

1.目测法在显微镜下根据精子分布的稠密和稀疏程度，将精子大致分为“密”、“中”、“稀”三个等级。

密：表示在整个视野里精子密度很大，彼此之间空隙很小，很难看到单个精子运动情况，每毫升精液中含有精子数为10亿以上。中：表示精子间空隙明显，彼此间距离约一个精子的长度，每毫升精液含精子数大约2～10亿。

稀：表示精子分散在视野中，精子之间空隙超过一个精子的长度，每毫升含2亿个以下。畜种精子密度密中稀牛10～20亿/ml8～10亿/ml8亿/ml以下羊25亿/ml以上20～25亿/ml20亿/ml以下猪、马2亿/ml以上1～2亿/ml1亿/ml以下

2.血细胞计数法用血色素吸管吸取被测精液作100或200倍稀释，稀释液一般采用3%NaCl溶液。然后取一滴滴于计数板上的盖玻片边缘，使精液渗入到计数室内。在400～600倍显微镜下统计出计数室的四角及中央共5个中方格内的80个小方格内的精子数（X），代入下列公式即为每毫升被测原精液所含的精子数

X×5×10×稀释倍数×1000＝精子数/mL简化计算方法：5个大方格的精子数×5万×稀释倍数为减少误差，必须进行两次精子计算，其误差小于10%。

3.光电比色计测定法目前较准确用来测定精子密度的一种简便方法，适用于牛、羊的精液和除去精液胶样物各种动物精液。其原理是精液中精子越多、其透光性越低。使用光电比色计通过反射光和透射光检验，能准确测定精液中精子的密度。检测前需先绘制成查数表，其方法是：将原精液稀释成不同比例，并以血细胞计数器测定各种稀释比例的精子密度，制成标准管，再用光电比色计测定已知精子密度的各种标准透光度求出相差1%透光率的级差精子数，根据其不同透光度与其对应的精子数，制成精子查数表，也可绘成曲线图。测定精液样品时，只要将原精液按一定比例稀释，根据其透光度查对精子查数表，即可得出精液样品的精子密度。四、精子形态精子形态是否正常与母畜的受胎率密切相关。精子形态检查有畸形率和顶体异常率检查两个方面。

1.精子畸形率(abnormalspermrate)畸形精子是形态和结构不正常的精子的统称。精子畸形率是精液中畸形精子数占总精子数的百分率。根据精子的畸形部位，可分为4类。第1类：头部畸形，如头部巨大、瘦小、细长、圆形、轮廓不清、皱缩、缺损、双头等；

第2类：颈部畸形，如颈部膨大、纤细、屈折、不全、带有原生质滴、不鲜明、双颈等；

第3类：中段畸形，如中段膨大、纤细、不全、带有原生质滴、双体等；第4类：主段畸形，如主段弯曲、屈折、回旋、短小、长大、缺陷、带有原生质滴、双尾等，以中段和主段畸形为多。在正常精液中，一般以精子尾部畸形比较多见，头部和颈部畸形较少。动物精液中畸形精子率一般不会超过20%。牛不超过18%，水牛不超过15%，羊不超过14%，猪不超过18%，马不超过12%，狗和狐不超过20%。如果超过20%，则影响受精力，表示精子品质不良，不宜用作输精。1.将1滴精液滴在玻璃片上2.用另一玻片拉向液滴，使玻璃片边缘附着精液3.将玻片推向另一端●精子生成过程受阻●副性腺及尿道分泌物的病理变化●精液处理不当，精子遭受外界不良影响的刺激。畸形精子的检查，可在计数死活精子数的同时进行，也可将精液制成抹片直接在显微镜下观察，或用普通染色液（美蓝）或红蓝墨水染色，水洗干燥后镜检。检查的精子数不得少于200个，计算畸形百分比，即畸形率。畸形精子出现的主要原因为什么？

2.精子顶体异常率(abnormalspermacrosome)精子顶体异常率是指精液中顶体异常的精子数占精子总数的百分率。顶体中含有多种酶类，在受精过程中具有重要作用，因此只有呈直线前进运动并具有完整顶体的精子才具有正常的受精能力。在正常情况下，牛精子顶体异常率为5.9%，猪为2.3%。如顶体异常率显著增加，例如牛超过14%以上，猪超过4.3%以上，就会直接影响受精力。顶体异常主要有膨胀、缺损、部分脱落、全部脱落等数种。顶体异常出现的原因可能与精子生成过程和副性腺分泌物异常有关，但更重要的可能是由于射出体外后精子受低温打击，特别是冷冻方法不当而造成。

顶体异常率的常规检查方法是：先同畸形精子检查一样制成抹片，待自然干燥后再在固定液中固定片刻，水洗后用姬姆萨缓冲液染色1.5～2.0h，再水洗干燥后，用树脂封装，置于1000倍以上显微镜或相差显微镜下观察200个以上的精子，计算异常率。凡是含有卵黄、甘油成分稀释液的精液抹片，必须先要在含有甲醛的柠檬酸盐液中固定，然后在37℃下干燥后，才能染色和镜检。五、精子存活时间和存活指数精子存活时间是指精子在体外一定保存条件下的总生存时间。存活指数是指精子存活时间及精子活率变化的一项综合指标，反映精子活率下降速度。检查时，将稀释后的精液置于一定的温度下(0～5℃或者37℃)，间隔一定时间检查活率，直至无活动精子或只有个别精子呈摆动活动为止。精子存活时间越长，指数越大，说明精子生活力越强，品质越好。精子存活时间（h）：检查间隔时间的总和－最末两次检查间隔时间的一般

精子存活指数＝每前后相邻两次检查精子活率的平均数与间隔时间乘积的总和。六、精子代谢能力精子能量代谢的强弱在一定程度上反应了精子的生理特征及其受精潜能。在正常情况下，精子代谢主要利用生活环境中的外源性物质，其中以糖类为主，精子可通过糖酵解或呼吸作用而获得能量。可见，精子代谢能力越强，消耗的糖和氧气越多，表现活动力越强。

1.精子耗氧量测定指以1亿个精子在37℃的条件下每小时内所消耗的氧气的微升数。将已知精子密度的一定数量的精液置于37℃的温箱中孵育1h，用瓦氏呼吸器测定其耗氧量，则可计算出精子耗氧率。

2.精液果糖分解测定精液中果糖分解能力与精子活率有密切的关系。果糖测定是以1亿精子在37℃和嫌氧条件下每小时消耗果糖的毫克数。3.美蓝褪色试验美蓝是一种氧化还原剂，氧化后呈蓝色，而还原后呈无色。精子在美蓝溶液中，呼吸时氧化脱氢，美蓝获得氢离子后便由蓝色还原为无色。因此，根据美蓝溶液褪色时间的快慢，便可估测精子的活率和密度的高低。七、精液的细菌学检查精液中病原微生物及菌落数量已列入评定精液品质检查的重要指标，并作为海关进出口精液的重要检验项目。精液中如果含有大量细菌微生物的存在，不仅会影响精子寿命和降低受精能力，而且还将导致有关疾病的传播。精液中如果含有病原微生物，每毫升精液中的细菌菌落数超过1000个，则视为不合格。计算机辅助精子分析（computerassistantsemenassay,CASA)一、精液稀释的目的

精液稀释(semendilution)是在精液中加入一定量按特定配方配制的、适宜于精子存活并保持受精能力的稀释液。1.延长精子的存活时间。通过降低精液能量消耗，补充适量营养和保护物质，抑制精液中有害微生物活动，可延长精子的寿命。

2.扩大精液容量，提高配种率。即提高一次射精量可配母畜头数。

3.便于精液长期保存和运输。第四节精液的稀释二、稀释液的主要成份及作用

稀释液：为了扩大精液容量，延长精子的存活时间及受精能力，而加入精液中的等渗溶液。精液稀释就是在精液中加入适宜于精子存活并保持受精能力的稀释液。（一）主要成份1.奶类：牛奶、羊奶、奶粉，最好是各种鲜奶，其目的是为精子提供能量。鲜奶用前在92～95℃的条件下，经10min的热处理，除去其中的乳烃素，然后过滤，除去泡沫。

2.卵黄：含有卵磷酯，用1周以内的新鲜鸡蛋，凉开水洗净外壳，用75%的酒精消毒一次，晾干，打开后用注射器吸取卵黄。

3.甘油（丙三醇）：三个“－OH”亲水性强，具有抗冻作用。4.Tris（三羟基甲基氨基甲烷，三基）：非电解胺化物。作用：①调节pH值；②保护精子具有受精能力和不被冻伤等。5.糖类（果糖、葡萄糖等）：①抗冻；②提供能量；③降低电解质浓度。6.其它：丙二醇、生理盐水、酶类、非电解质、激素、维生素等。（二）稀释液中各成份的作用

1.稀释剂：扩大精液容量，要求必须是等渗溶液，例如奶类、糖类、生理盐水等。2.营养剂：为精子提供营养和能量等，补充精子在代谢过程中的能量消耗。精子代谢只是单纯的分解作用，不能通过同化作用将外界物质转变为自身成分。糖类（葡萄糖、果糖、乳糖等）、奶类、卵黄等。3.保护剂：保护精子的作用，以免受到各种不良外界环境的危害。①降低精液中（精清）的电解质浓度（糖类、磷酸盐、酒石酸盐等）精清中电解质浓度很高，生理上具有激发精子活动，有利于精子和卵子结合受精。但同时也能促进精子早衰，破坏精子脂蛋白膜，使精子失去电荷聚集能力，不利于精液保存。一般常用的非电解质、弱电解质有各种糖类、氨基乙酸、甘氨酸等。

②缓冲物质的作用：缓冲剂（柠檬酸钠、酒石酸钾钠等）缓冲物质是用以保持精液适当的pH值。常用的缓冲剂有柠檬酸钠、酒石酸钾钠、磷酸二氢钾以及三羟甲基氨基甲烷(Tris)等。

③防止冷休克（低温打击）的作用当精子从体温降到20℃时对其活力影响不大，当精液从20℃～10℃，则有较大影响，会使精子遭受冷打击而丧失活率。卵黄和奶类等含有卵磷脂，防止冷休克的发生。当从10℃降到0℃（急剧降温10～20分钟），就会造成精子的不可逆性死亡，即冷休克。这是因为精子含有的缩醛磷脂融点高，在低温下容易凝结，而不能被精子利用，造成精子不可逆的冷休克。

④抗冻作用：具有抗冷冻危害的作用。精液在冷冻过程中，精子内外环境的水分，必须经历液态和固态的过程，这种物态的转化对精子具有极大的危害。而抗冻物质有助于减轻或消除这种危害。一般常用于抗冻的保护物多采用甘油、糖类、二甲基亚砜（DMSO），TRIS等。

⑤抗菌作用。在采精过程中即便在严格的操作下，也难免要受到某些细菌等有害微生物的污染，而精液和稀释液又都是病原微物良好的培养基。常用的抗生素有青霉素、链霉素、氨苯磺胺素、林肯霉素、多粘菌素等。4.其它类物质

①酶类：乳酸脱氢酶，细胞色素氧化酶，琥珀酸脱氢酶，β-葡萄糖苷酸酶，谷草转氨酶，过氧化氢酶，粘蛋白酶等。

②激素：催产素，PGE2，PGF2α,T等。

③维生素：VC,VB2,B12,VE等。酶类、激素类、维生素类等，有助于调节和改善精子外在环境的理化特性，以及母畜生殖道的生理机能，以利于提高受精机会，促进合子发育。④常温保存时通入CO2可延长保存时间。⑤在颗粒精液中加入染料用作标志等。三、稀释液配制的注意事项

1.消毒：配制好的稀释液，瓶口用硫酸纸包好，外用布盖上，扎紧，置高压锅中，0.8kg、105℃的压力维持30min；糖类稀释液只能用0.5kg的压力，或用水煮沸30min即可。2.用于配制稀释液以及封装保存精液的一切用品，都必须消毒，使用前再用稀释液冲洗2～3次。3.稀释液应新鲜、无菌，现用现配。

4.在稀释液中加入卵黄、奶类及抗菌素等药物应在稀释液降温到35℃以下时再加入。

5.稀释液加入卵黄和抗菌素前应过滤。0.02～0.2µm滤膜。6.成本低，配制方便，精子存活率高，受胎率高。四、精液的稀释

（一）稀释液的种类根据性质和用途可分为4类。1.现用稀释液：适用于采精后立即授精，以单纯扩大精液容量，增加输精母畜头数为目的。此类型稀释液以简单的等渗的糖类和奶类为主体。

2.常温保存稀释液：适用于精液在常温下作短期保存，具有以糖类和弱酸盐为主体的pH偏低的特点。

3.低温保存稀释液：适用于精液低温保存，具有含卵黄或奶液为主体的抗冷休克特点。4.冷冻保存稀释液：适用于精液超低温冷冻保存，具有甘油、二甲亚砜等抗冻物质为主体特点，此类稀释液比较复杂，有仅一种稀释液组成，也有由多种稀释液组成。

（二）精液稀释的方法

1.先将稀释精液所用的器具加温到30～35℃，并用等温稀释液冲洗2～3次（防止温度和渗透压的损害）。2.新采集的精液及时稀释，室温低于20℃时，要用精液无菌保温箱。精液放置时间过长则会降低精子活率，一般在0.5h内进行稀释。3.稀释液与精液的温度必须一致，可用消毒温度计测量。采精时集精杯加保温措施，稀释液预先加温到30℃左右，置于精液保温箱中。

4.在稀释精液时，将稀释液沿杯壁缓缓加入精液中，一般将稀释液与精液置于预定温度的保温瓶中作等倍稀释处理。然后轻轻转动精液瓶或用灭菌棒搅动，使之混匀。

5.如果进行低倍稀释（3～5倍）可一次完成，若高倍稀释时则须分两步进行，即先低倍稀释，防止精子所处的环境突然改变，对精子造成打击。间隔1.5～2h后，精液降至保存（平衡）温度时，进行二次稀释。6.精液稀释后，先静置片刻，再做活率检查，如果活率没有变化，则分装保存。如果活率下降，则说明稀释或操作不当，不宜使用，并检查原因。（二）稀释倍数精液的稀释应保证每输精剂量所含直线前进运动的精子数不低于输精标准要求。精液适宜的稀释液应根据以下依据决定：

1.稀释液种类：糖类稀释液→低倍稀释，奶类稀释液→高倍稀释。

2.保存时间：时间长→高倍稀释，时间短→低倍稀释。

3.精液保存方法：冷冻保存稀释倍数应低一些，而液态保存稀释倍数可高些。

4.畜种：羊、牛、鹿精子密度大，稀释的倍数应大一点，而猪、马密度小，则不宜作高倍稀释。（三）每次输精保持受精力所需的最低有效精子数畜种牛山羊猪马稀释倍数10～402～42～42～3输精量（mL）0.2～10.5～130～4015～30有效精子数2000～5000万5000万2亿2.5～5亿牛：射精量8ml，活率0.7，密度12亿个/ml，每毫升精液中有效精子数12×0.7=8.4亿个，若每毫升稀释后的精液中含有3000万个有效精子，则每毫升可稀释倍数8.4亿÷0.3亿=28倍。可稀释：8ml×28=224ml，可供224头母牛输精。一、保存目的

1.延长精子存活时间，保持其受精能力；2.扩大种公畜（优良）精液利用率；3.方便运输，扩大精液的利用范围。二、保存方法

（一）常温保存法

常温保存是指在15～25℃之间的温度范围内保存精液的方法。

1.原理：利用稀释液的弱酸性（pH6.2～6.4）环境抑制精子活动，以减少其能量消耗，使精子保持在可逆性的静止状态而不失去受精能力。即当精液pH值降低到一定的酸度时，精子运动及代谢受到可逆性抑制，但当pH值恢复到精液正常的pH值时，精子可以复苏，从而对精液进行保存的方法。第五节精液的保存2.调整pH的方法：为了使稀释液的pH达到所需范围，可以选用下面三种方法中的一种：（1）向稀释液中输入CO2，如伊里尼变温稀释液(IVT)。（2）利用精子在保存过程中自己产生的CO2，自行调节pH，如康奈大尔学稀释液(CUE)。（3）在稀释液中配有酸类物质和充以氮气，如已酸稀释液及一些植物汁液（椰汁稀释液，CME）。牛冷冻精液稀释液配方

●海带多糖0.025～

0.2％、葡萄糖2～

2.5％、柠檬酸钠0.9～

1.5％、蒸馏水65～

75％、白蛋白17～

18％、甘油7～

10％、青霉素8.5～

10万IU

●果糖0.5～1.5％、柠檬酸钠1～2％、TRIS1.5～3％、青霉素G钠5～15万IU、甘油5～8％、低密度脂蛋白5～10%、去离子水92～95％

3.稀释液配制：牛的柠檬酸钾钠稀释液（100ml）。配方：柠檬酸钾0.11g磺胺粉0.3g柠檬酸钠0.6g卵黄10ml磷酸氢二钠0.15g青链霉素各10万单位葡萄糖0.97g蒸馏水加到100ml

配制方法：将柠檬酸钾、柠檬酸钠、磷酸氢二钠、葡萄糖和磺胺粉溶于蒸馏水，加热煮开，并冷却后加入卵黄和抗菌素，通入CO220～30min，控制pH在6.2～6.4。稀释液配方：葡萄糖2～5％、柠檬酸钠0.5～3.5％、卵黄10～50％、青霉素G钠5～15万IU、双氢链霉素2～10％、甘油1～5％、红景天多糖1～1.5％、去离子水50～90％

（二）低温保存法

低温保存就是将稀释过的精液置于0～5℃的低温条件下保存。通常放在冰箱内或装有冰块的广口保温瓶中冷藏。1.原理：在低温（0～5℃）保存过程中，精子处于休眠状态，代谢降到最低水平，并且在采精以及精液稀释等操作过程中混入的细菌微生物的繁殖与危害也受到抑制，故精子能够保存的时间相对较长。在输精的时候，将温度回升至37℃左右，精子又能逐渐恢复正常的代谢，并保持其正常的受精能力。然而，精子对冷刺激，特别是温度急剧下降至10℃以下时，会使精子发生不可逆的冷休克现象。因此，在稀释液中须添加卵黄、奶类等抗休克物质，以提高精子的抗冷能力。2.稀释液（1）牛精液低温保存稀释液在0～5℃条件下，有效保存期可达7d之久。牛的柠檬酸钠－卵黄稀释液。基础液：取二水柠檬酸钠2.9g，加水定溶于100ml。稀释液：基础液75ml，卵黄25ml，青链霉素各1000IU/ml。（2）猪精液低温保存稀释液猪的浓份精液或离心后的精液，可在5～10℃条件下保存3d，且具有受精能力。在0～5℃下也可保存。猪：取新鲜牛、羊奶100ml，煮沸10min，去掉浮沫，冷却过滤加入青链霉素1000单位/ml。

（3）马和绵羊精液低温保存稀释液由于精液本身的特性以及季节配种的影响，马和绵羊精液的低温保存效果不如其它家畜的效果好。因此，在生产中的应用并不普遍。3.方法（1）冰箱保存法：冷源是冰箱。将稀释好的精液装入贮精瓶封装后，用12层纱布或3～4层毛巾包裹，外用塑料薄膜用皮筋扎紧，先在室温下降温1h，再用8～15℃凉水冷却1h，然后放入2～5℃的冰箱中逐渐冷却（2h以上），严格控制温度，并保持恒定。（2）冰块保存法。（3）农村可用水井或窖进行保存。4.注意事项

(1)稀释液必须含有卵黄或奶类；卵黄用量一般在10～30%，牛奶适量。

(2)缓慢降温牛、羊、驴：20℃—0～5℃，约1～2h，0.2℃/min猪：30℃～15℃→1～2h；15～10℃→6h；10℃～0℃→2～3d猪精液不宜冷冻保存或低温保存。（三）超低温（冷冻）保存

精液冷冻(semenfreezing)保存，是利用干冰(－79℃)、液氮(－196℃)或其它制冷设备作为冷源，将精液经过特殊处理后，保存在低温下，以达到长期保存精液的目的。1.原理精子具有受温度变化直接影响其本身活动力和代谢能力的生物学特性。精子保存在超低温状态下，其代谢活动完全受到抑制，生命以相对静止状态保持下来，一旦升温又能复苏而不失去受精能力。精子之所以能够复苏的关键在于精液在冷冻过程中，在冷冻剂的保护下，防止了精子水分冰晶化对精子的破坏，而尽可能形成玻璃化。冰晶化是水在降温过程中的一定温度条件下，水分子重新按照几何图形排列形成冰晶的过程。冰晶改变了精子膜的溶质浓度和渗透压，造成精子脱水，发生不可逆的化学毒害而死亡。冰晶化只有当温度在0～－60℃温度范围内缓慢降温时形成，降温越慢冰晶越大，－15～－25℃形成冰晶最多。在冷冻精液过程中，只有避开0～－60℃有害温区，才有利于精子长期保存。玻璃化的冰冻状态是水在超低温下，水分子仍然保持原来自然的一种无次序的排列状态，形成玻璃样的坚硬而均匀的冰结。在此状态下，精子不会发生细胞脱水，结构维持正常，解冻后可以复苏。2.冷源干冰：（-79℃），液N：（-196℃），液O：（-183℃），液H：（-253℃），液He：（-269℃）。3.剂型目前广泛应用的剂型为细管型，在冷冻精液早期也曾使用过颗粒型和安瓿型。

（1）细管型以长125～133mm、容量为0.25或0.5ml的各种颜色的聚氯乙烯复合塑料细管，通过吸引装置将平衡后的精液进行分装、封口，置液氮蒸气上冷却，再浸入到液氮中保存。细管型精液具有许多优点，适于快速冷冻，精液细管内径小，每次冻制细管多，精液受温均匀，冷冻效果好，精液不必暴露就可直接输入母畜子宫内因而不受污染，剂量标准化，标记明显，精液不易混淆，容积小，便于大量保存，精液消耗少，输精母畜受胎率高。适用于机械化生产。

（2）颗粒型将0.1ml精液滴冻在经液氮冷却的聚乙烯氟板或金属板上，制成颗粒。其优点是方法简便、易于制作，成本低，体积小，便于大量贮存。但缺点也较多，如剂量不标准，精液暴露在外容易受到污染，不易标记，易混淆，大多需解冻液解冻等，故许多国家已不用这种方法。

（3）安瓿[bù]

型采用硅酸盐硬质玻璃制成的安瓿，盛装精液剂量多为0.5～1ml。优点是剂量标准，不受污染，标记明显。缺点是生产工艺复杂，成本比较高；易破碎，体积和占用的空间比较大；解冻后需要转移到输精器内方可使用。

4.精液冷冻保存的稀释液根据配制要求和稀释的需要，可将冷冻保存稀释液分别制成三种溶液。A基础液：将糖类、盐类，成批量的制成溶液，并密封保存。奶类经热处理。BI液：根据每次采精所需的冷冻稀释液的量，在基础液中加入一定量的卵黄和抗生素等配制成，用作第一次稀释。基础液+卵黄+抗生素。CII液：取需要量的I液，按照比例加入经灭菌的甘油，配制成含有甘油的II液，用作精液的第二次稀释。Ⅰ液+甘油。牛精液冷冻保存稀释液，主要有卵黄－柠檬酸钠－甘油液、卵黄－糖类－甘油、奶类－甘油液3种稀释液。例：牛细管用冷冻稀释液基础液：2.9%的柠檬酸钠液。Ⅰ液：取基础液80mL，卵黄20mL，青霉素10万单位。Ⅱ液：含7%甘油的Ⅰ液。牛颗粒用冷冻稀释液基础液：蔗糖（乳）12g，蒸馏水加至100mL。Ⅰ液：基础液80mL+卵黄20mL+青霉素10万单位。Ⅱ液：含7%甘油的Ⅰ液。稀释液成分与配比◆冷冻保存稀释液的成分

※低温保存剂(卵黄、奶类)防冻保护剂(甘油)※维持渗透压物质(糖类、柠檬酸钠等)※抗菌素及其他添加剂◆牛精液冷冻保存稀释液●乳糖-卵黄-甘油(乳卵甘液)●蔗糖-卵黄-甘油(蔗卵甘液)●葡萄糖-卵黄-甘油(葡卵甘液)●葡萄糖-柠檬酸钠-卵黄-甘油液(葡柠卵甘液)国家标准规定：牛冷冻精液细管型容量为0.25ml,含直线前进运动的精子不低于1000万个；颗粒型精液容量为0.1ml，含直线前进运动精子数不低于1200万个。解冻后精子活力不低于0.3。0.25ml细管型冷冻精液稀释倍数应该为：X=直线前进运动精子数/ml×预测精子活力(≥0.3)×0.25ml/1000万

精液冷冻前的稀释倍数5.冷冻精液的制作技术

（1）精液的稀释采用的冷冻精液剂型不同，所采用的稀释液的配方、稀释倍数和次数也不尽相同，一般多采用一次或二次稀释法。A一次稀释法：常用于颗粒精液，将含有甘油抗冻剂的稀释液按稀释比例一次同温稀释精液。B二次稀释法：常用于细管精液的冷冻，也适用于安瓿冷冻。将采出的精液在等温条件下，先用不含甘油的I液稀释至最终倍数的一半。稀释后的精液经1～1.5h缓慢降温至4～5℃。再用含有甘油的II液在等温条件下做等量的第二次稀释。（2）精液平衡精液经含有甘油的稀释液（II液）稀释后，缓慢降温至4～5℃并放置一段时间，以增强精子的抗冻性，达到抗冻保护作用，这个处理过程称做平衡。平衡时间通常为2～4h为宜。（3）精液的冷冻

A颗粒冷冻法：在装有液氮的广口保温容器上置一个铜纱网(或铝饭盒)，距液氮面1～3cm，预冷数分钟，使其温度维持在－80～－120℃，也可用聚四氟乙烯板（氟板）代替铜纱网，先在液氮中浸泡数分钟后，置于距液氮面2cm处，然后将经平衡的精液定量均匀而整齐的滴于其上，每粒0.1ml，停留2～4min后，当精液颜色变白时，将颗粒置于液氮中。取出1～2粒解冻，活率达到0.3以上者贮存于液氮灌中。冷冻精液颗粒制作精液颗粒B细管精液冷冻法：将细管放在距离液氮面上2～3cm的铜纱网上，停留5min左右，等精液冻结后，移入液氮中贮存。细管冷冻的自动化操作是使用控制液氮喷量的自动记温速冻器，5～－60℃每分钟降4℃，－60℃后尽快降到－196℃。（4）精液的解冻

细管型、安瓿型冻精：直接将其投入到38～40℃的温水中，待冻精融化一半时，立即取出备用。

颗粒型冻精：①干解冻：将冻精颗粒直接放入38℃～40℃的小试管中解冻，待溶化到1/2时取出在常温下完全解冻；②湿解冻：在预热的试管中加入解冻液（VB12等），待融化到1/2左右取出，在常温下完全解冻。6.精液冷冻保存的注意事项（1）冷冻精液的包装上须明确标明公畜品种、编号、生产日期、精子活率及数量，将冷冻精液分类装入液氮罐提筒内，浸入液氮贮存。（2）冷冻精液的保存原则是精液细管不能脱离液氮，因而必须定期向液氮灌内添加液氮，当液氮消耗掉1/2时应补充。冬季1次/月，夏季2～3次/月。

（3）取细管精液时，动作要快，不可将精液提筒超出液氮灌颈部下沿，精液脱离液氮的时间不得超过10秒钟。（4）保存中不同品种和不同个体的精液不能混杂。

（5）液氮灌要轻拿轻放，安放牢固，避免强烈震动。

输精(insemination)，就是将一定量的合格精液输入到发情母畜生殖道内的一定部位，从而使其达到妊娠的操作技术，是人工授精的最后一个环节。一、输精前的准备1.输精器械的准备输精器械在使用前必须经过彻底的洗涤和消毒，最后用稀释液冲洗。

第六节输精2.母畜的准备接受输精的母畜要进行保定，并对母畜的外阴及其附近皮肤用肥皂水擦洗干净，并用消毒液进行消毒，然后用温水或生理盐水冲洗擦干。3.精液的准备液态保存的精液活率不低于0.6，冷冻保存的精液解冻后精子活率不低于0.3。4.输精人员准备输精员的指甲必须剪短磨光，洗涤干净，用75%的酒精消毒，同时手臂也应消毒并涂以稀释液或生理盐水作润滑剂。在条件允许的情况下，输精员最好戴手套进行操作。二、输精的基本要求

输精的技术要求包括输精量、输精时间、输精次数以及输精部位的确定。在进行人工授精时，动物的种类不同，对输精的要求也就有所不同。一般情况下，各种动物都适宜在排卵前的4～8h进行输精。在生产中，常用发情鉴定来判定适宜的输精时间。品种排卵时间理论输精时间实际输精时间输精量输精部位牛发情结束后10h左右排卵前7～8h早上发情，下午输精，并进行二次输精（第二天早上）1～1.5mL，有效精子