原核生物的转录及调控

关于原核生物的转录及调控第一页，共六十七页，2022年，8月28日转录：在DNA指导的RNA聚合酶催化下，以DNA链的一条链为模板，按照碱基配对原则合成RNA链的过程。不对称转录：在DNA双链分子中，转录通常只在DNA的一条链上进行，另一条链则不能转录，但可能对转录起调节作用，这种转录方式称不对称转录。转录单位：就是从启动子到终止子的一段DNA序列。第一节转录概述第二页，共六十七页，2022年，8月28日一、基因的编码链和有意义链

模板链：用于转录RNA的链称为模板链，或负（－）链，又称无义链。编码链：与模板链互补的DNA链称为编码链，或正（＋）链，又称有义链。第三页，共六十七页，2022年，8月28日二、转录的基本要点

底物：NTP；模板：反义链；方向：5’→3’；酶：RNApol；产物：RNA单链第四页，共六十七页，2022年，8月28日转录和复制：都是遗传信息的传递第五页，共六十七页，2022年，8月28日三、转录起始位点转录起点位点核苷酸为＋1。上游序列upstream：转录起点的前面的序列，用负数码（－）表示，起点前一个核苷酸为－1。下游序列downstream：

转录起点的后面的序列，用正数码（＋）表示。没有编号为○的碱基。第六页，共六十七页，2022年，8月28日第七页，共六十七页，2022年，8月28日第二节原核生物转录的相关酶类

一、E.coliRNA聚合酶E.coli只有一种聚合酶；E.coliRNApol全酶由5种亚基组成，即α2ββ’ωσ，480kD；α2ββ’ω构成核心酶，核心酶与σ因子构成全酶。

第八页，共六十七页，2022年，8月28日E.coliRNA聚合酶的基本性质第九页，共六十七页，2022年，8月28日RNApolymerase

inprok.σβααβ’CoreEnzymeHoloEnzyme

forelongationforinitiation依靠静电作用力依靠空间结构非专一性与非特异DNA结合专一性与特异DNA结合半衰期；60’半衰期；数小时cover60bp

σβα

αβ’第十页，共六十七页，2022年，8月28日RichardBurgessandAndrewTravers(1969)150kD160kD70kD40kDCartoonillustratingseparationofthesubunitsofE.coliRNApolymerasebySDS第十一页，共六十七页，2022年，8月28日1、核心酶：催化磷酸二酯键的形成α亚基：2个，功能多样（核心酶的组建因子、促进双链的解开和重新聚合、启动子识别、促进RNApol与DNA模板链上游转录因子结合）β亚基：1个，结合核苷酸底物，催化磷酸二酯键的形成；β’亚基：碱性强，与模板链结合；二、RNA聚合酶各亚基的功能第十二页，共六十七页，2022年，8月28日2、σ因子：Reusable；修饰RNApol的构型；识别启动子，但无催化活性。不同原核生物具有基本相同的核心酶，但σ亚基有所差别，决定了原核生物基因的选择性表达。第十三页，共六十七页，2022年，8月28日3、原核生物RNA聚合酶抑制剂：利福平（Rifampin）：与细菌RNApolβ亚基结合，阻碍转录的起始作用；利链菌素（streptolydigin）：与细菌RNApolβ亚基结合，抑制转录的延伸。肝素：与细菌RNApolβ’亚基结合，阻碍其与模板DNA的结合。第十四页，共六十七页，2022年，8月28日第三节原核生物转录的过程

RNA的转录包括promotion，elongation，termination三过程；从promoter到terminator称为transcriptionalunit；原核生物中的转录单位多为polycistron；转录起始点记为+1，其上游记为负值，下游记为正值。+1

-10

+10upstreamstartpointdownstream第十五页，共六十七页，2022年，8月28日一、转录的起始

关键：全酶能以很高的亲和性结合在启动子promoter；启动子：RNA聚合酶识别、结合并起始转录的一段DNA序列。第十六页，共六十七页，2022年，8月28日promoter由两个重要部分组成

（一）原核启动子的结构第十七页，共六十七页，2022年，8月28日●-70~-40：upelement（上游元件）CAP-cAMPbindingsite

●-35~-10：corepromoter（核心启动子）

RNApol.bindingsite

基因表达调控的正控制位点CAP：

CatabolitegeneActivatorProteincAMPAcceptorProtein（cAMP受体蛋白）（分解代谢基因激活蛋白）第十八页，共六十七页，2022年，8月28日1、核心启动子：

SextamaBox：（Rsite）TTGAC（SextamaBox）-35site。RNApol.looselybindingsitePribnowBox：

TATAAT（pribnowBox）-10site。RNApol.firmlybindingsite（Bsite）Initiationsite：+1site。RNAtranscriptionalstartpoint（Isite）A/G-35(R)-10(B)+1(I)RNA第十九页，共六十七页，2022年，8月28日l

SextamaBox与PribnowBox间距17bp，有利于RNApol启动l

-35Boxor-10Boxmut.

间距趋近于17bp，upmutation间距远离于17bp，downmutation17bp的间距比17bp的序列对转录更为重要-35Boxand-10Boxmut.

→转录效率下降100倍→转录效率下降1000倍第二十页，共六十七页，2022年，8月28日2、上游元件：

CAP-cAMPbindingsite（Activatorregion，AR）当：ARI+CAP-cAMP●ARI：CAP-cAMP的强结合位点（-70~-50）●

ARII：CAP-cAMP的弱结合位点（-50~-40）cooperativeeffect提高ARII的结合效率IR-70

ARI-40ARII

IR

-50第二十一页，共六十七页，2022年，8月28日

RNApol

ARII+CAP-cAMP复合体：促使-35

box附近GC岛区的双螺旋结构稳定性降低，-10

box的解链温度降低，有利于转录启动

ARIARIIGCIsland-35-10

●NullARII→

RNAo-10Boxbuttranscriptionoff

●

ARII+CAP-cAMPpromotionRNAo-35Boxinto-10Boxstartingtranscription

RNApol

RNApol第二十二页，共六十七页，2022年，8月28日α-CTDCAP-cAMPARIARIIARIARIIActivationtranscription

Upelement+CAP-cAMP＋RNAPolymerase复合体

CAP-cAMP与RNAPolymerase的α-CTD结合，激活转录

第二十三页，共六十七页，2022年，8月28日（二）原核基因转录的起始

1、σ因子的作用：降低全酶与一般DNA的非专一性结合力（20000倍）；增强全酶与启动子Rsite、Bsite的专一性结合力（100倍）；导致RNA链的延伸缓慢第二十四页，共六十七页，2022年，8月28日Promoter与σfactor间的结合专效性●决定了strongpromoter&weakpromoter；★-35box,-10box的差异影响启动子与RNApol中σ因子的结合能力；★不同启动子的-35，-10box间存在较为保守的标准序列（标准启动子）；★σfactorisresponsibleforrecognitionofconsensussequenceofpromoterandonlyrequiredforinitiation.第二十五页，共六十七页，2022年，8月28日2、RNApol与启动子的结合σ因子识别启动子上结合位点。RNApol全酶与-35box结合→封闭型启动复合物；酶向-10box移动，并与之牢固结合，促使-10box及起始位点处发生局部解链→开放型启动复合物；DNA解螺旋扩展到-10box下游17bp范围。第二十六页，共六十七页，2022年，8月28日3、转录起始位点的决定酶与-10box的结合，决定了第一个起始碱基的选择。第一个被转录的碱基离-10box的保守T约6~9nts。mRNA的起始位点多为G，其次为A，很少为U,起始点核苷酸的两侧分别为C和T。第二十七页，共六十七页，2022年，8月28日4、三元复合物的形成和σ因子的解离RNA合成一开始，就形成模板-RNApol-RNA的三元复合物。σ因子解离，核心酶与模板的亲和性下降到非特异性结合的水平，RNApol在DNA链上变得容易移动，为链的延伸创造了条件；游离的σ因子可以重新进行功能循环。第二十八页，共六十七页，2022年，8月28日转录的起始核心酶在σ因子帮助下特异性结合到DNA上；RNApol与启动子-35box结合，形成封闭型起始复合物；酶滑动到-10box，转变成为开放型起始复合物，启动子活化，双链解开，模板链暴露，插入最初的2个核苷酸；酶继续加上开头的几个NTP，形成三元起始复合物，在RNA链合成了8～9个碱基后，σ因子解离，转录开始。第二十九页，共六十七页，2022年，8月28日ModeloftheinteractionbetweenE.coilRNApolymeraseholoenzymeandapromoterDNAIncorporatingthefirstfewNt第三十页，共六十七页，2022年，8月28日二、原核生物转录的延伸

RNApol沿着模板链移动，RNA链不断延伸，并保持三元复合物的结构；转录泡中的DNA螺旋前开、后合，RNA延长，不断脱离DNA；RNA链的延伸速度不是恒定的，在模板富含GC的区域，转录就会减慢/停顿。第三十一页，共六十七页，2022年，8月28日17bp螺旋解开长度12bpDNA-RNA复合体长度第三十二页，共六十七页，2022年，8月28日影响RNA延伸速度的因素：①RNApol；②暂停信号：导致转录速度突然出现变化的特殊序列。GC富集区：产物RNA不易释放；IR：产物形成茎环结构，妨碍上游的模板恢复双链。③其他配基：ppNpp、NusA蛋白。第三十三页，共六十七页，2022年，8月28日NusAprotein：

★69Kd,acidprotein★RNApol-attachingfactor★

ImpelRNApol.pausinginterminatorfor1’-15’andwaitingforRhofactortostoptranscriptionofRNA

★Afterinitiation→substitutingσ→NusA+coreE

antitermination

Nproteinutilizationsubstance第三十四页，共六十七页，2022年，8月28日NusAbindstopolymerase,andNbindstobothNusAandboxBofthenutsiteregionofthetranscript,creatingaloopinthegrowingRNA.Thiscomplexisrelativelyweakandcancauseantiterminationonlyatterminatorsnearthenutsite(Theseconditionsexistonlyinvitro.).(NutNbindingsite

)antiterminationNprotein第三十五页，共六十七页，2022年，8月28日三、原核生物转录的终止

转录的终止依赖于RNA产物的特定序列；原核和某些真核生物的终止子要求转录产物RNA3’端具有发夹的二级结构，茎部富有GC序列；终止子的分类：根据终止反应是否需要ρ蛋白第三十六页，共六十七页，2022年，8月28日1、不依赖于ρ因子的终止子（强终止子）结构特点：RNA具有一个发夹结构（富含GC）和随后polyU片段。作用机制：RNApol+发夹结构→转录暂停→后随杂合分子不稳定的poly(U-dA)→RNA容易从模板上脱落→RNA-DNA-RNApol解聚→转录终止第三十七页，共六十七页，2022年，8月28日第三十八页，共六十七页，2022年，8月28日2、依赖于ρ因子的终止子（弱终止子）

ρ因子：55kD，六聚体。能够利用水解ATP释放的能量使RNA从三元复合物中释放出来；结构：仍然具有茎环结构，但GC碱基对含量较少，下游也缺乏polyU结构。

第三十九页，共六十七页，2022年，8月28日第四十页，共六十七页，2022年，8月28日1、2、3、第四十一页，共六十七页，2022年，8月28日第四十二页，共六十七页，2022年，8月28日第四节原核生物转录的调控基因表达的调控主要发生在转录水平；转录水平上的调控是最为经济、灵活，又是最为重要、复杂的调控；①确定需要转录基因的起始位点；②精细调节基因表达的水平；③cisfactor与transfactor严格又灵活的互作；④保证RNApol的连续转录，准确终止。第四十三页，共六十七页，2022年，8月28日一、原核转录调控的相关概念

（一）诱导和阻遏：诱导：酶的合成取决于特定物质（常为substrate）的存在。如培养基中乳糖的存在促进了E.coli的半乳糖苷酶的合成；阻遏：当培养基中某种物质（常为product）含量较高，细胞就关闭合成这种物质的能力。如培养基中Trp的存在抑制了E.coliTrp的合成；第四十四页，共六十七页，2022年，8月28日（二）调控的效应物调节蛋白+小分子物质→原核操纵子的诱导/阻遏。这些小分子是基因表达的调节物质--效应物。诱导物（inducer）：与调节蛋白结合，使其从DNA分子上脱落下来，RNApol开始转录。辅阻遏物（co-repressor）：与调节蛋白结合，可以提高调节蛋白与操纵基因的亲和性，进而关闭结构基因的转录。第四十五页，共六十七页，2022年，8月28日（三）正调控和负调控

正调控：调节蛋白与操纵子结合后促进转录的进行。负调控：调节蛋白与操纵子结合后抑制转录的进行。正、负调控都存在着诱导和阻遏。第四十六页，共六十七页，2022年，8月28日positiveactiveinactiveInd.Rep.①正调控+诱导调节蛋白无活性→转录不进行诱导物+调节蛋白→有活性调节蛋白→转录进行②正调控

+阻遏调节蛋白有活性→转录进行辅阻遏物+调节蛋白→无活性调节蛋白→转录不进行第四十七页，共六十七页，2022年，8月28日negativeactiveinactive阻遏蛋白有活性→转录不进行诱导物+阻遏蛋白→无活性阻遏蛋白→转录进行③负调控

+诱导④负调控+阻遏阻遏蛋白无活性→转录进行辅阻遏物+阻遏蛋白→有活性调节蛋白→转录不进行Ind.Rep.Negative第四十八页，共六十七页，2022年，8月28日二、操纵子理论（operonconcept）定义：原核生物基因表达和调控的单元。包括：①结构基因：编码控制某一代谢途径的相关的酶；②调控元件：是调节结构基因转录的一段DNA序列，包括启动子和操纵基因；③调节基因：其产物（调节蛋白）能够识别并结合操纵基因，决定结构基因的转录与否。第四十九页，共六十七页，2022年，8月28日（一）lac操纵子（lactoseoperon）：1、lac操纵子的结构调节基因（I）：编码阻遏物（Repressor）。启动子（Promoter，P）：RNApol的结合位点；操纵基因（Operator，O）：进入结构基因的开关；结构基因：Z（β-半乳糖苷酶）、Y（β-半乳糖苷透过酶）、A（β-半乳糖苷乙酰基转移酶）；第五十页，共六十七页，2022年，8月28日β-半乳糖苷酶：水解含β-半乳糖苷键的底物，如乳糖。β-半乳糖苷透过酶：使外界的β-半乳糖苷能透过E.coli细胞壁和原生质膜进入细胞内。β-半乳糖苷乙酰基转移酶：乙酰CoA+β-半乳糖苷→乙酰半乳糖。当E.coli需要利用培养基里的乳糖时，前2种酶是必需的，而最后1种酶则是非必需的。第五十一页，共六十七页，2022年，8月28日

没有乳糖→lacI编码的阻遏蛋白具有活性→牢固结合到操纵基因O上→结合在启动区的RNApol不能通过→Z、Y、A不能转录（和表达）2、lac操纵子的负向调控机制负调控+诱导第五十二页，共六十七页，2022年，8月28日

加入乳糖→乳糖（诱导物）与阻遏蛋白结合→阻遏蛋白构象变化→阻遏蛋白从操纵基因上脱落→RNApol开始Z、Y、A基因的转录→表达→乳糖被利用第五十三页，共六十七页，2022年，8月28日3、lac操纵子CAP的转录激活作用正调控CAP：二聚体，可同时与DNA、cAMP结合；G存在→细胞内[cAMP]↓→CAP二聚体不能单独与DNA结合→lac操纵子关闭G缺乏→细胞内[cAMP]↑→CAP与cAMP结合→CAP-cAMP复合物+lac操纵子启动子上游→DNA链发生90o弯曲→增强RNApol与启动子的结合→lac操纵子打开→Z、Y、A基因转录、表达第五十四页，共六十七页，2022年，8月28日CAP第五十五页，共六十七页，2022年，8月28日乳糖操纵子的协同调节(coordinateregulation)负向调节与正性向调节协同合作阻遏蛋白封闭转录时，CAP不发挥作用如没有CAP加强转录，即使阻遏蛋白从lacO上s释放仍无转录活性结论：lac操纵子强的诱导作用既需要乳糖又需缺乏葡萄糖第五十六页，共六十七页，2022年，8月28日（二）trp操纵子Trp的合成：一系列酶促反应的结果（分支酸→邻氨基苯甲酸→吲哚甘油磷酸→Trp）；1、trp