基因工程原理和技术-1-2-课件

基因工程原理与技术授课教师：林良斌教授参考书：

1、《基因工程原理》吴乃虎主编

2、《植物基因工程原理与技术》王关林主编基因工程原理与技术1第一章绪论第一节基因工程的概念基因工程(geneengineering)是现代生物技术的核心内容。

基因工程是在分子水平上进行的遗传操作，是指将一种或多种生物体的基因分离出来或人工合成基因，按照人们的愿望，进行严密的设计和体外加工重组，转移到另一种生物体的细胞内，使之能在受体细胞中遗传表达并获得新的遗传性状而形成新的生物类型的生物技术。

基因工程的核心内容是基因体外重组(DNA体外重组)。基因工程的四大要素(或基本条件)：目的基因、载体、工具酶、受体。

相关名词：遗传工程、基因工程、基因操作、重组DNA技术、分子克隆、基因克隆、基因无性繁殖。基因工程的突出特点：打破物种间基因交流的界限。

第一章绪论2第二节基因工程的诞生与发展

基因工程诞生于1973年。一、基因工程诞生的理论和技术基础1、理论基础

①DNA是遗传物质；

②DNA分子的双螺旋结构和半保留复制；

③遗传密码的通用性和遗传信息传递的方式。2、技术基础

①限制性核酸内切酶的发现与DNA的切割；

②DNA连接酶的发现与DNA片段的连接；

③基因工程载体的构建与应用。

第二节基因工程的诞生与发展3二、基因工程的诞生1972年，美国斯坦福大学P.Berg研究小组的DNA体外重组实验。

1973年，斯坦福大学的S.Cohen研究小组的DNA体外重组和大肠杆菌转化实验。(见下两张幻灯片)同年，加利福尼亚大学的H.Boyer也进行了类似的实验。这一实验的成功标志着基因工程的诞生，因此，1973年被定为基因工程诞生的元年。

二、基因工程的诞生这一实验的成功标志着基因工程的诞生，因此，4pSC101抗四环素pR6-5抗卡那霉素DNA连接酶重组DNA分子EcoRI抗卡那霉素基因pSC101抗四环素pR6-5抗卡那霉素DNA连接酶重组DN5培养平皿卡那霉素平板四环素\卡那霉素平板大肠杆菌四环素平板培养平皿卡那霉素平板四环素\卡那霉素平板大肠杆菌四环素平6三、基因工程的发展

分为艰难阶段、逐渐成熟阶段、迅速发展阶段、鼎盛发展阶段。1、基因工程的艰难阶段(1973~1976，载体和受体系统的安全性改造)

基因工程的安全性问题，导致许多国家限制基因重组的实验。2、基因工程的逐渐成熟阶段(1976~1982，基因工程药物的研制)1976年,Genentech(GeneticEngineeringTechnology)公司成立(byRobertSwansonandHerbBoyer)。

1977年Boyer等首先将人工合成的生长激素释放抑制因子14肽的基因重组入质粒，成功地在大肠杆菌中合成得到这14肽(见下图)；1978年Itakura（板仓）等使人生长激素191肽在大肠杆菌中表达成功；1979年美国基因技术公司用人工合成的人胰岛素基因重组转入大肠杆菌中，并通过发酵生产人胰岛素。从而揭开了基因工程产业化的序幕。

三、基因工程的发展7大肠杆菌生长激素释放抑制因子重组体+SS基因目的基因基因载体从动物脑中提取5mg---50万只羊脑9升工程大肠杆菌培养液大肠杆菌生长激素释放抑制因子重组体+SS基因目的基因基因载体83、基因工程的迅速发展阶段(1982~2000，动植物基因工程育种与基因治疗)

发展了一系列新的基因工程操作技术，构建了多种转化原核生物和动物、植物细胞的载体。

1982年首次通过显微注射培育出世界上第一个转基因动物——转基因小鼠。

1983年采用农杆菌介导法培育出世界上第一例转基因植物——转基因烟草。1990年美国政府首次批准一项人体基因治疗临床研究计划，对一名因腺苷脱氨酶基因缺陷而患有重度联合免疫缺陷症的儿童进行基因治疗获得成功。1991年，美国提出人类基因组计划并实施。3、基因工程的迅速发展阶段(1982~2000，动植物基因工94、鼎盛发展阶段(21世纪)

2019年完成人类基因组计划。至今，基因工程药物上市的有几十种，上百种正在进行临床试验。

转基因植物迅速发展，目前至少有150种转基因植物问世。自从1986年抗除草剂转基因烟草被首次批准进入田间试验以来,至今国际上已有30个国家批准上千例转基因植物进入田间试验,涉及的植物种类达50多种。自从1994年转基因延熟西红柿获准上市以来，目前至少有51种转基因植物上市。

4、鼎盛发展阶段(21世纪)10据国际有关方面预测，到20l0年，全世界转基因食物的种植面积将增至10000万公顷。据国际有关方面预测，到20l0年，全世界11虽然转基因动物比转基因植物诞生早，但其发展比转基因植物要慢得多！主要原因是动物转基因技术操作烦琐、困难，动物细胞培养要求高，不易再生出个体。荷兰的GenPharm公司用转基因牛生产乳铁蛋白，预计每年从牛奶生产出来营养奶粉的销售额是50亿美元。虽然转基因动物比转基因植物诞生早，但其发展比转12

英国罗斯林研究所研制成功的转基因羊，其乳汁中含有α[1]-抗胰蛋白酶，可治疗肺气肿病。这种病在北美比较常见，病人以前只能依赖于注射人的α[1]-抗胰蛋白酶做替代疗法，价格昂贵，而现在用转基因羊来生产，每升这种羊奶可售6000美元。英国罗斯林研究所研制成功的转基因羊，其乳汁中含13

中国工程院院士曾溢涛教授研究小组获得5只转基因山羊。其中一只奶山羊的乳汁中，含有堪称血友病人救星的药物蛋白——有活性的人凝血因子Ⅸ。

中国工程院院士曾溢涛教授研究小组获得5只转基因山14第三节基因工程研究的主要内容一、基因工程研究的主要内容主要包括：基础研究（载体的研究、受体系统的研究、目的基因研究、工具酶的研究、转化方法的研究、生物基因组学研究）和应用研究等。1、载体的研究构建各种用途载体及提高外源基因表达的效率。2、受体系统的研究

包括细菌、真菌、植物、动物。

受体系统的安全性及转化效率。3、目的基因研究目的基因的分离、克隆及改造。

第三节基因工程研究的主要内容154、工具酶的研究开发新的工具酶。5、转化方法的研究开发各种受体细胞的高效转化方法。6、生物基因组学研究具有重要经济价值的各种生物的基因组测序、挖掘新的基因等。7、应用研究

包括基因工程药物研究、基因疫苗研究、转基因植物研究、转基因动物研究以及在酶制剂工业、食品工业、化学与能源工业及环境保护等方面的应用。

4、工具酶的研究16二、基因工程的基本操作程序

①分离获得带有目的基因的DNA片段及载体选择与构建。

②限制性核酸内切酶分别切割外源DNA和载体。

③通过DNA连接酶将外源基因DNA片段连接到载体上，形成重组DNA分子。

④将重组DNA分子引入到受体细胞(转化)。

⑤带有重组体细胞(转化体)的扩增及选择培养。

⑥转化体的鉴定，获得外源基因高效稳定表达的基因工程菌或细胞。⑦目的基因的进一步研究分析，并设法使之实现功能蛋白的表达(基因功能研究或基因改造研究)。

二、基因工程的基本操作程序17基因工程原理和技术-1-2-课件18第四节基因工程的意义与发展前景一、基因工程研究的意义①大规模生产其他生物体内含量极微但却具有较高经济价值的生物分子；②设计构建新物种(新性状乃至全新物种

)；③搜寻、分离和鉴定生物体尤其是人体内的遗传信息资源(基因)。二、基因工程发展前景基因工程问世以来短短的三十年，显示出了巨大的活力，基因工程的前景将更加灿烂辉煌。今后，基因工程的重点研究方向是基因组学、基因工程药物、动植物生物反应器和环保等方面。

第四节基因工程的意义与发展前景19第二章基因工程的工具酶

工具酶是指基因工程操作中所使用的核酸酶类。根据其用途分为四类：限制性内切酶、连接酶、聚合酶、修饰酶。第一节限制性核酸内切酶一、宿主的限制-修饰现象(见下图)

限制作用(restriction)：指一定类型的细菌可以通过限制酶的作用，破坏入侵的噬菌体DNA，导致噬菌体的寄主幅度受到限制。这是维护宿主遗传稳定的保护机制。

修饰作用(modification)：指寄主本身的DNA，由于在合成后通过甲基化酶的作用得以甲基化，使DNA得以修饰，从而免遭自身限制性酶的破坏。这是宿主细胞识别自身遗传物质和外来遗传物质的作用机制。第二章基因工程的工具酶20R/M系统①DNA甲基化酶②限制性核酸内切酶R/M系统的作用①限制作用②修饰作用R/M系统211953年，Arber发现限制-修饰现象，预见限制性核酸内切酶的存在；1970年，H.O.Smith从流感嗜血杆菌中分离出第一个II型限制性核酸内切酶HindII。Nathans首次用限制性酶切割SV40DNA。1953年，Arber发现限制-修饰现象，预22基因工程原理和技术-1-2-课件23

根据限制-修饰系统的遗传分析，大肠杆菌K12有以下4种表型：①rk+mk+：野生型，具有完整的限制和修饰功能。②rk-mk+：限制缺陷型，不能降解外源DNA，但具有修饰功能，这类突变株经常用于基因工程的受体。③rk-mk-：限制和修饰缺陷型，既无限制功能，又无修饰功能，也常用于基因工程的受体。④rk+mk-：修饰缺陷型，缺乏修饰自身DNA的功能，但具有限制功能，故也称为“自杀性表型”(suicidephenotype)。根据限制-修饰系统的遗传分析，大肠杆菌K12有24二、限制性核酸内切酶的类型

限制性核酸内切酶是指一类能识别双链DNA分子中特定核苷酸序列，并在识别序列内或附近特异切割双链DNA的核酸内切酶。

简称限制性内切酶或限制性酶，目前已经鉴定出三种不同类型。至今，已发现近4000种限制酶。rebase.neb特性Ⅰ型Ⅱ型Ⅲ型酶分子结构功能辅助因子识别序列切割位点切割方式应用价值举例异源三聚体限制与修饰ATPMg2+SAM非对称序列距识别序列1kb处随机性切割无EcoK、EcoB同源三聚体限制Mg2+

4-6bp回文序列识别序列内或附近特异切割广泛EcoRI、HindIII…异源二聚体限制与修饰ATPMg2+SAM非对称序列识别序列下游24-26bp处随机性切割小EcoPI二、限制性核酸内切酶的类型特性Ⅰ型Ⅱ型Ⅲ型酶分子结构异源三聚25三、限制性核酸内切酶的命名

1973年H.O.Smith和D.Nathams提出命名系统，1980年Roberts在此基础上进行了修改。①限制性核酸内切酶第一个字母(大写，斜体)代表该酶的宿主菌属名(genus)第一个字母；第二、三个字母(小写，斜体)代表宿主菌种名(species)前两个字母。②第四个字母代表宿主菌的菌株名的第一个字母(小写，正体)或染色体外成分(质粒或噬菌体，大写，正体)。③若从一种菌株中发现了几种限制性核酸内切酶，即根据发现和分离的先后顺序用罗马字母表示(正体)。

Haemophilusinfluenzae

d

流感嗜血杆菌d株

HindⅡ

HindⅢ三、限制性核酸内切酶的命名26四、II型限制性核酸内切酶的基本特性1、II型限制性内切酶的识别序列

一般为4～6bp的回文序列。也有6bp以上的，如NotI，称为稀有切割限制酶。有些为反向重复序列(间断回文序列)，如SfiI。有些II型限制酶的识别序列中，某一位或二位碱基并非严格专一，如HindII可识别4种核苷酸序列。

酶识别序列酶识别序列BamHIG↓GATCCPstICTGCA↓GBglIIA↓GATCTSalIG↓TCGACEcoRIG↓AATTCSau3AI↓GATCHindIIGTPy↓PuACSfiIGGCCNNNN↓NGGCCHindIIIA↓AGCTTSmaICCC↓GGGKpnIGGTAC↓CXbaIT↓CTAGANotIGC↓GGCCGCXhoIC↓TCGAG四、II型限制性核酸内切酶的基本特性酶识别序列酶识别序列Ba272、II型限制性核酸内切酶的切割方式大多数II型限制性核酸内切酶均在其识别位点内部切割双链DNA，水解磷酸二酯键中3’位的酯键，产生3’端为羟基、5’端为磷酸基团的片段。有三种切割方式：①在识别序列的对称轴的5’末端切割，产生5’黏性末端，如EcoRI2、II型限制性核酸内切酶的切割方式28②在识别序列的对称轴的3’端切割，则产生3’黏性末端，如PstI②在识别序列的对称轴的3’端切割，则产生3’黏性末端，29③在识别序列的对称轴上切割，产生平头末端，如PvuII有些识别序列为间断型回文序列的II限制酶，其切点位于不确定核苷酸中，如：BglIGCCNNNN↓NGGC

SfiIGGCCNNNNN↓NGGCC

XmnIGAANN↓NNTTC③在识别序列的对称轴上切割，产生平头末端，如PvuII30有极少数II型限制性核酸内切酶的切割位点远离识别序列，如MboII识别GAAGA序列，切割位点则是：5’－GAAGANNNNNNNN↓N－3’3’－CTTCTNNNNNNNN↓N－5’

同裂酶是指识别序列相同、切割方式相同或不同、来源不同的II限制性核酸内切酶。如：HpaII与MspI的识别序列和切割位点都相同(C↓CGG)，但MspI还可以识别已甲基化的序列CmCGG；

SmaI(CCC↓GGG)和XmaI(C↓CCGGG)，识别序列相同，但切割位点不同。有极少数II型限制性核酸内切酶的切割位点远离31同尾酶是指来源各异、识别序列不同，但产生相同的黏性末端的II限制性核酸内切酶。如：BamHI(5’-G↓GATCC-3’)

BglII(5’-A↓GATCT-3’)3、II型限制性核酸内功酶不具有甲基化功能如EcoRI限制性核酸内切酶与EcoRI甲基化酶，两者均识别GAATTC序列，而前者能对G↓AATTC序列进行切割，后者的作用是使第二个A甲基化。目前已经分离到许多II型限制性核酸内切酶与其对应的甲基化酶。同尾酶是指来源各异、识别序列不同，但产生相同324、II型限制性核酸内切酶对单链DNA的切割有一些II限制性核酸内切酶，除双链DNA外，还可以特异识别并切割单链DNA的相应位点，只是切割效率比较低。如HhaI能切割单链噬菌体ФX174和M13mp18DNA，只是切割单链DNA比切割双链DNA效率低50％。五、Ⅱ限制性核酸内切酶的主要用途①产生具有相同粘性末端的DNA片段，以便重组克隆；②建立DNA分子的限制酶图谱；③构建基因文库；④构建载体。4、II型限制性核酸内切酶对单链DNA的切割33六、II型限制性核酸内切酶的酶切反应1、标准酶解体系的建立

反应体积一般为20μl(根据DNA量可适当扩大)。

①10×酶切缓冲液2μl(大部分酶反应缓冲液基本相似：

50mmol/LTris-HClpH7.0~7.5、0~100mmol/LNaCl、10mmol/LMgCl2、1mmol/LDTT)②酶(根据酶活力大小及工作性质确定酶量，不超过反应总体积10％

③DNA样品(μ

g~mg)④无菌水

限制性核酸内切酶的一个活力单位(U)为：在合适的温度和缓冲液中，在20μ

L反应体系中，1h完全降解1ug标准DNA所需要的酶量。六、II型限制性核酸内切酶的酶切反应342、酶解反应①混匀②酶解(温度、时间)③酶解鉴定④终止a、加EDTA至10mmol/L；b、加SDS至0.1%(W/V)；c、65℃水浴保温20min(有些最适反应温度较高的酶不能使之完全失活，如AceIII、BelI、BstXI、TaqI)；d、酚/氯仿抽提酶，乙醇沉淀DNA

3、限制性核酸内切酶对DNA的不完全酶解(见下图)不完全酶解对于构建物理图谱和基因组文库是非常必要的。其方法有减少酶量、增加反应体积、缩短反应时间和降低反应温度等。

2、酶解反应35incomplete1231+3incompletedigestion123SmaIcomplete1+2+3incomplete1231+3incompletedig364、Ⅱ限制性核酸内切酶操作的注意事项①商品化的限制性核酸内切酶均为浓缩液，每次操作时应使用新的吸头去取酶；②加入酶的体积应不超过总体积的10%，否则酶液中的甘油浓度超过5%时将会抑制酶的活性；③整个操作应在0℃进行，即在冰浴中进行，而且是在加入其它试剂之后，最后加入酶；④尽可能使反应体积减到最小，即尽可能少加水；⑤当切割大量DNA时，通常采用延长反应时间，减少酶的用量；⑥当DNA需2种或以上酶切时，应用通用缓冲液。若没有通用缓冲液时，只有用1种酶切完后，纯化酶切产物，再进行下一个酶切反应。4、Ⅱ限制性核酸内切酶操作的注意事项37七、影响限制性核酸内切酶活性与酶切效果的因素

1、酶的纯度；要求不存在其他核酸内切酶或外切酶的污染。

2、DNA样品的纯度；DNA样品中的蛋白质、苯酚、氯仿、乙醇、EDTA、SDS、高NaCl等，都能抑制酶活性。样品中DNase会降解DNA，影响酶切。3、酶切反应的温度、时间；多数II型限制酶最适反应温度是37℃，但SmaI为25℃或30℃，SfiI为50℃，TaqI为65℃

。反应温度过高或过低都会影响酶活性，甚至导致酶失活。七、影响限制性核酸内切酶活性与酶切效果的因素384、DNA的甲基化程度；限制性核酸内切酶不能切割甲基化的核苷酸序列。这一特性有特殊用途：①改变某些限制性核酸内切酶的识别序列；②产生新的限制酶识别序列；③保护限制性核酸内切酶的切点；④利用一些同裂酶对甲基化的敏感性不同，研究细胞DNA位点专一性甲基化的程度和分布。

大肠杆菌中的DNA腺嘌呤甲基化酶(dam)在5’GATC3’序列中的腺嘌呤N6位引入甲基，受其影响的酶有BclI、MboI等，但BamHI、BglII、Sau3AI不受影响。大肠杆菌中的DNA胞嘧啶甲基化酶(dcm)在5’CCAGG3’或5’CCTGG3’序列中的胞嘧啶C5位上引入甲基，受其影响的酶有EcoRII等，但BglI、KpnI不受影响。采用去甲基化酶的大肠杆菌菌株来制备质粒DNA，可防止DNA的甲基化。4、DNA的甲基化程度；395、DNA分子的构型

限制性内切酶对不同构型DNA分子的酶切效果是不同的，例如超螺旋DNA酶解所需要的酶量，比线性DNA酶解所需要的酶量高许多，甚至可高达20倍。有些限制性核酸内切酶对于同一DNA分子上不同位置的识别序列，切割效率明显不同。例如，EcoR

I、HindIII对λDNA的酶切。6、反应缓冲液主要成分：pH(Tris-HCl)、离子强度(NaCl)、Mg2+；

辅助成分：β-巯基乙醇或二硫苏糖醇(DTT)防止酶氧化；

牛血清蛋白(BSA)组分V对于某些酶是必需的，可防止酶在低浓度蛋白质溶液中变性。5、DNA分子的构型40

星号活性是指在极端非标准反应条件下，限制性核酸内切酶能切割与特异识别序列相似的序列的特性。

例如EcoRI在高pH(＞8)、低盐(50mmol/L)和高浓度甘油(＞5％)存在的情况下，其识别序列由GAATTC改变为NAATTN。以EcoRI表示其星号活性。

引起星号活性的原因有：①高甘油含量，大于5%；②酶用量过大，大于100U/微克DNA；③低离子强度，小于25mmol/L；④高pH，大于8.0；⑤含有机剂，如乙醇、二甲基亚砜、二甲基乙酰胺等；⑥Mn2+、Cu2+、Co2+、Zn2+等非Mg2+的二价阳离子的存在。常发生星活性的内切酶有：EcoRI、HindⅢ、KpnI、PstI、SalI、HinfI等。星号活性是指在极端非标准反应条件下，限制性核酸41第二节DNA连接酶

1967年几个实验室几乎同时发现DNA连接酶。一、定义与反应机理

DNA连接酶是指能催化双链DNA分子内或分子间的5’-磷酸基和3’-羟基生成磷酸二酯键而使DNA链连接的一类酶。大肠杆菌和其他细菌：NAD+动物细胞和噬菌体：ATP第二节DNA连接酶大肠杆菌和其他细菌：NAD+42T4DNA连接酶连接DNA/RNA杂合分子中DNA链的切口DNA连接酶无连接T4DNA连接酶连接DNA/RNA杂合分子中DNA链的切口43DNA连接酶的作用机理DNA连接酶的作用机理44二、DNA连接酶的种类1、T4噬菌体DNA连接酶(T4DNA连接酶)

T4DNA连接酶DNA/RNARNA

平头末端的Km比黏性末端的Km高约1000倍。提高平头末端连接效率的方法：①加大酶浓度(10~100倍于粘性末端)；②加大底物浓度；③加入适量的一价阳离子(150-200mmol/LNaCl)；④加入低浓度的PEG(10%PEG8000)。ATP的最适终浓度为0.5mmol/L。二、DNA连接酶的种类T4DNA连接酶DNA/RNARNA452、大肠杆菌DNA连接酶

E.coliDNA连接酶DNA/RNAE.coliDNA连接酶无连接3、T4噬菌体RNA连接酶

用途：RNA末端标记pNpNNNNT4RNA连接酶2、大肠杆菌DNA连接酶E.coliDNA连接酶DNA/46三、DNA连接酶的反应体系DNA连接酶的活性单位较通用的是韦氏(Weiss)单位，一个韦氏单位是指在37℃，20min内催化从γ,β-32P-ATP的焦磷酸根置换出1nmol32P所需要的酶量。M-L单位：以d(A-T)n作为底物黏性末端连接单位：以λDNA/HindIII片段为底物一个韦氏单位相当于0.2个M-L单位或者60个黏性末端连接单位。

反应体系：10μL或20μL，DNA片段，连接酶，Buffer，温度(12~16℃或<30℃)，时间(4~16h)

Buffer：50mmol/LTris-HClpH7.6，10mmol/LMgCl2，0.5mmol/LATP，5mmol/LDTT三、DNA连接酶的反应体系47四、影响连接反应的因素1、DNA末端的浓度连接产物的分子构型(线形或环状)与DNA浓度及DNA分子长度存在密切关系。在一定浓度下，小分子DNA片段进行分子内连接，有利于形成环化分子。对于长度一定的DNA分子，其浓度增加有利于分子间连接。此外，分子间连接还与两种片段的末端浓度的比例有关。原则上一种片段的浓度大于另一一种片段的浓，如：在克隆中，插入片段:载体片段=2:1。2、反应温度

介于最适温度与其Tm之间。＞30℃会导致T4DNA连接酶的不稳定。

3、ATP浓度ATP最适的终浓度为0.5mmol/L，浓度过高会抑制连接。四、影响连接反应的因素48第三节DNA聚合酶

DNA聚合酶分为：①依赖于DNA的DNA聚合酶；②依赖于RNA的DNA聚合酶。常用的DNA聚合酶：大肠杆菌DNA聚合酶I、Klenow片段酶、T4噬菌体DNA聚合酶、T7噬DNA聚合酶、TaqDNA聚合酶、逆转录酶。酶聚合反应速度5’→3’外切酶活性3’→5’外切酶活性持续合成能力E.ColiDNA聚合酶I中速有低低Klenow酶中速无低低T4DNA聚合酶中速无高低T7DNA聚合酶快速无高高修饰T7DNA聚合酶快速无低或无高TaqDNA聚合酶快速有无高逆转录酶低速无无中第三节DNA聚合酶酶聚合反应速度5’→3’外切酶活性3’49一、大肠杆菌DNA聚合酶I5’→3’聚合酶活性5’→3’外切酶活性：双链DNA带磷酸基团的5’端或DNA/RNA杂合分子中的RNA5’端3’→5’外切酶活性切口平移作用DNAPolI一、大肠杆菌DNA聚合酶I5’→3’聚合酶活性5’→3’外50主要用途：切口平移法制备DNA探针反应体系：在25μl反应体系中含有1μg纯化的特定DNA片断，并加入适量的DNaseＩ、PolＩ、α-32p-dNTPs和未标记的dNTPs。

DNaseI，Mg2+PolI，α-32p-dCTP，dNTPs主要用途：切口平移法制备DNA探针DNaseI，Mg2+Po51二、Klenow片段

Klenow酶具有5’→3’聚合酶活性和3’→5’外切酶活性，缺失5`→3`核酸外切酶活性。其主要用途如下：①补平限制性核酸内切酶产生的5’黏性末端；

二、Klenow片段52②标记3’凹陷末端的DNA分子或平末端；DNA末端标记一般标记活性不高，极少用于分子杂交探针的标记，主要用于DNA序列测定等所需片段的标记。

②标记3’凹陷末端的DNA分子或平末端；53③合成cDNA第二链；④双脱氧末端终止法测定DNA序列；⑤在单链模板上延伸寡核苷酸引物，以合成杂交探针和进行体外突变。

平末端标记③合成cDNA第二链；平末端标记54三、T4噬菌体DNA聚合酶

具有5’→3’聚合酶活性和3’→5’外切酶活性，缺少5’→3’外切酶活性。其3’→5’外切酶活性比Klenow酶高100~1000倍。

在无dNTP时，可以从任何3`-OH端外切(即可降解dsDNA，只是其活性比ssDNA低很多)，在只有一种dNTP时，外切至互补核苷酸，在四种dNTP均存在时，聚合活性占主导地位。T4DNA聚合酶的置换合成作用无dNTP时，T4DNA聚合酶有dNTP时，T4DNA聚合酶三、T4噬菌体DNA聚合酶T4DNA聚合酶的置换合成作用无55T4DNA聚合酶的用途：①切平核酸内切酶产生的3’黏性末端T4DNA聚合酶的用途：56②末端标记。特别是不需要核酸外切酶帮助就可进行平末端标记，这种探针标记方法称为置换(取代)合成法。

置换合成法将产生一组末端完全标记、而从末端到中点其标记量递减的分子。

②末端标记。特别是不需要核酸外切酶帮助就可进行57四、T7噬菌体DNA聚合酶与测序酶

T7DNA聚合酶具有5`→3`聚合酶活性及很强的单链、双链DNA的3`→5`外切酶活性，但无5`→3`外切酶活性。其最大特点是有最强的持续合成能力。其用途如下：

①用于长模板(M13DNA)的引物延伸；(不受DNA二级结构的影响，聚合能力较强可延伸合成数千个核苷酸)②通过延伸或取代合成法标记DNA3’末端；

③将双链DNA的5’或3’突出末端转变成平末端的结构。对天然的T7DNA聚合酶进行修饰，使之降低或完全失去3’→5’的外切酶活性，而聚合酶活性增加了3倍。因此，修饰的T7DNA聚合酶主要用于双脱氧测序，又称作为测序酶。此外，还用于末端标记、探针制备(可催化较低水平<0.1μmol/L的dNTP参入)、体外诱变中DNA链的合成。

四、T7噬菌体DNA聚合酶与测序酶58五、TaqDNA聚合酶TaqDNA聚合酶具有5’→3’聚合酶活性和5’→3’外切酶活性，缺少3’→5’外切酶活性。其最大特点是热稳定(95℃以上高温半小时不失活)，最适反应温度高(7075℃)。因此，其主要用途是PCR及DNA测序(具有二级结构的DNA)。保真的PCR酶有TmaDNA聚合酶(Thermotoamaritima

海栖热袍菌)、TliDNA聚合酶(Thermococcuslitoralis

海栖热球菌)、PfuDNA聚合酶(Pyrococcusfuriosus

激烈火球菌)、PwoDNA聚合酶(Pyrococcuswoesi

沃氏火球菌)。五、TaqDNA聚合酶59六、逆转录酶①5’→3’聚合酶活性。逆转录酶能以RNA或DNA为模板合成DNA分子，但是后者的合成很慢；

六、逆转录酶60②RNA酶H活性。能从5’或3’方向特异地降解DNA/RNA杂交分子中的RNA链。

②RNA酶H活性。能从5’或3’方向特异地降61商品化的逆转录酶主要是鸟类骨髓母细胞瘤病毒(avianmyeloblastosisvirus，AMV)逆转录酶和Moloney鼠白血病病毒(Moloneymurineleukemiavirus，Mo-MLV)逆转录酶。

其用途有：

①合成cDNA第一链，构建cDNA文库；②RT-PCR；③以RNA为模板制备DNA探针；④补平和标记5’-末端突出的DNA片段；⑤代替Klenow酶用于DNA序列分析。商品化的逆转录酶主要是鸟类骨髓母细胞瘤病毒(62第四节修饰酶一、末端脱氧核苷酸转移酶(末端转移酶)末端转移酶能在二价阳离子作用下，催化DNA的聚合作用，但不需要模板，将脱氧核糖核苷酸加到DNA分子的3’-OH末端。AAAAAAMg2+dATP末端转移酶效率高Co2+dATP末端转移酶AAAAAAAAAAAAAAAAAAA效率低第四节修饰酶AAAAAAMg2+dATP末端转移63用途：①给载体和外源DNA(如cDNA或随机切割DNA)接上同聚物尾，以便连接；②末端标记用途：①给载体和外源DNA(如cDNA或随机切割DNA)接64二、核酸酶核糖核酸酶(RNase)：水解RNA脱氧核糖核酸酶(DNase)：水解DNA核酸酶(nuclease)：水解RNA和DNA(一)核糖核酸酶1、核糖核酸酶A(RNaseA)RNaseA是一种内切核糖核酸酶，可特异攻击RNA上嘧啶残基的3’端磷酸酯键。其反应条件极宽，且极难失活。在低盐浓度(0~100mmol/LNaCl)下，RNaseA切割单链和双链RNA、DNA/RNA中的RNA；当NaCl浓度为300mmol/L或更高时，RNaseA就特异性切割单链RNA。

二、核酸酶核糖核酸酶(RNase)：水解RNA脱氧核糖核酸酶65RNaseA的用途:①确定RNA或DNA中的单碱基突变的位置；②核糖核酸酶保护分析法检测特定RNA(特异降解单链RNA，对杂交双链RNA不起作用)，其灵敏度比核酸酶S1保护分析法高数倍；③转录起始点及内含子剪接位点的分析

④降解DNA样品中的RNA分子。2、核糖核酸酶T1

RNaseT1也是一种内切核糖核酸酶，可特异攻击RNA上鸟嘌呤残基的3’端磷酸酯键。其催化活性与用途类似于RNaseA。RNaseA的用途:663、核糖核酸酶HRNaseH特异地降解DNA/RNA杂交双链中的RNA链，产生具有3’-OH和5’-磷酸末端的寡核苷酸和单核苷酸，不能降解单链或双链的DNA或RNA。

其用途是产生cDNA第二链合成的引物。RNaseHPolIdNTPPolIdNTPDNA连接酶3、核糖核酸酶HRNaseHPolIdNTPPol67(二)

脱氧核糖核酸酶I

DNaseI是一种内切脱氧核糖核酸酶，可从嘧啶核苷酸5’-端磷酸随机降解单链或双链DNA，生成具有5’-磷酸末端的寡核苷酸。Mg2+Mn2+用途：①产生大肠杆菌DNA聚合酶I切口平移的切口；②在Mn2+存在下，产生构建基因组文库的大片段DNA；③DNasel足迹法测定DNA结合蛋白在DNA上的精确结合位点；④除去RNA样品中的DNA。(二)脱氧核糖核酸酶IMg2+Mn2+用途：①产生大肠68(三)S1核酸酶作用特点：①需要Zn2+和酸性条件(pH4.0~4.5)；②降解单链DNA或RNA，但降解DNA的速度大于降解RNA的速度(7倍)；③降解方式为内切和外切，内切为主；④酶量过大时也可降解双链核酸，为单链的1/75000。用途：①切掉DNA片段的单链突出末端产生平头末端；②在双链cDNA合成时切除发夹环结构；③S1核酸酶作图分析。

如内含子的数目、大小、位置分析及转录起始位点与终止位点分析等。

(三)S1核酸酶69内含子数量及大小的分析DNAmRNA分子杂交RERES1核酸酶变性凝胶电泳MABM：分子量MarkerA：未经S1酶处理B：经S1酶处理但不能定位内含子内含子数量及大小的分析DNAmRNA分子杂交RERES1核酸70转录起始点的定位分析RERERE酶切碱性磷酸酯酶多核苷酸激酶**变性后与mRNA杂交*S1核酸酶*变性凝胶电泳MAB转录起始点的定位分析RERERE酶切碱性磷酸酯酶**变性后与71三、核酸外切酶核酸外切酶(exonuclease)是一类从多核苷酸链的末端开始逐个降解核苷酸的酶。

单链核酸外切酶：E.coliexoⅠ、exoⅦ双链核酸外切酶：exoⅢ单双链核酸外切酶：Bal31核酸酶1、大肠杆菌核酸外切酶VII

3’→5’外切酶活性5’→3’外切酶活性用途:①抹平DNA末端；②回收dA/dT接尾克隆的cDNA。三、核酸外切酶单链核酸外切酶：E.coliexoⅠ、e722、大肠杆菌核酸外切酶III

3’→5’外切酶活性ExoIIIMg2+核酸外切酶活性PPExoIIIMg2+3’磷酸酶活性ExoIIIMg2+

ssDNA无反应无嘌呤或无嘧啶位点ExoIIIMg2+核酸内切酶活性RNA/DNA2、大肠杆菌核酸外切酶III3’→573构建单向缺失突变体库3’突出黏性末端5’突出黏性末端ExoIIIS1核酸酶克隆单向缺失突变体克隆构建单向缺失突变体库3’突出黏性末端5’突出黏性末端Exo743、Bal31核酸酶

Bal31核酸酶主要为3’外切酶活性，同时伴有5’外切及较弱的内切活性，需要Mg2+和Ca2+。

①对于单链DNA，具有特异的内切酶活性，可从3’-OH末端迅速降解DNA，而5’端切割速率较慢；②对于双链DNA，具有3’→5’外切酶活性和5’→3’外切酶活性，以3’外切酶活性迅速降解一条链，随后在互补链上进行缓慢的5’端内切反应，产物大部分为5’端突出5个碱基的双链分子(80%~90%)，少量为带平头末端的双链分子(10%~20%)。对双链RNA分子也能发生类似反应；③当共价闭合环型双链DNA上出现单链缺口时，通过其内切酶活性，将其切开成线性双链DNA，并按上述方式进一步降解。

用途：与ExoIII相同，构建双向缺失突变体库，分析大片段DNA。3、Bal31核酸酶75四、T4噬菌体多核苷酸激酶催化ATP的γ-磷酸基团转移到单链或双链的DNA或RNA的5’-OH末端。催化速度：双链>单链>双链切口或缺口；

5’突出末端>平末端>5’凹陷末端。T4多核苷酸激酶的激酶活性(正向反应)四、T4噬菌体多核苷酸激酶催化速度：双链>单链>双链切口或缺76交换反应(过量ADP存在时)交换反应(过量ADP存在时)77T4多核苷酸激酶的3’磷酸酶活性

PPPPPPPNpPNPOHNpOHNOHOHT4多核苷酸激酶Mg2+pH6.0T4多核苷酸激酶的3’磷酸酶活性PPPPPPPNpPNPO78T4多核苷酸激酶的用途①DNA的5’末端标记(如DNA的化学测序)；②使DNA5’末端磷酸化，以便连接(如衔接头的克隆方式)。

+T4多核苷酸激酶的用途①DNA的5’末端标记(如DNA的化学79五、碱性磷酸酶催化核酸分子的脱磷作用，使DNA或RNA或核苷酸的5’磷酸变为5’-OH末端。细菌碱性磷酸酶(BAP)、小牛肠碱性磷酸酶(CIP)CIP的活性比BAP高10~20倍，反应后易失活(68℃10min)

五、碱性磷酸酶80碱性磷酸酶的用途①5’末端标记前的处理；②去除载体片段的5’磷酸基因，防止载体自身连接。

碱性磷酸酶的用途81基因工程中常用的工具酶工具酶功能限制性核酸内切酶特异切割DNA，产生具有特定末端的DNA片段DNA连接酶DNA片段间连接，产生重组DNA分子DNA聚合酶Ⅰ合成双链cDNA分子切口平移制作高比活探针DNA序列分析填补3´末端Klenow片段cDNA第二链合成，双链DNA3末端标记等TaqDNA聚合酶PCR反转录酶合成cDNA替代DNA聚合酶I进行填补，标记或DNA序列分析多聚核苷酸激酶催化多聚核苷酸5´羟基末端磷酸化，或末端标记碱性磷酸酶防止载体自身连接末端转移酶同聚物加尾连接基因工程中常用的工具酶工具酶功82基因工程原理与技术授课教师：林良斌教授参考书：

1、《基因工程原理》吴乃虎主编

2、《植物基因工程原理与技术》王关林主编基因工程原理与技术83第一章绪论第一节基因工程的概念基因工程(geneengineering)是现代生物技术的核心内容。

基因工程是在分子水平上进行的遗传操作，是指将一种或多种生物体的基因分离出来或人工合成基因，按照人们的愿望，进行严密的设计和体外加工重组，转移到另一种生物体的细胞内，使之能在受体细胞中遗传表达并获得新的遗传性状而形成新的生物类型的生物技术。

基因工程的核心内容是基因体外重组(DNA体外重组)。基因工程的四大要素(或基本条件)：目的基因、载体、工具酶、受体。

相关名词：遗传工程、基因工程、基因操作、重组DNA技术、分子克隆、基因克隆、基因无性繁殖。基因工程的突出特点：打破物种间基因交流的界限。

第一章绪论84第二节基因工程的诞生与发展

基因工程诞生于1973年。一、基因工程诞生的理论和技术基础1、理论基础

①DNA是遗传物质；

②DNA分子的双螺旋结构和半保留复制；

③遗传密码的通用性和遗传信息传递的方式。2、技术基础

①限制性核酸内切酶的发现与DNA的切割；

②DNA连接酶的发现与DNA片段的连接；

③基因工程载体的构建与应用。

第二节基因工程的诞生与发展85二、基因工程的诞生1972年，美国斯坦福大学P.Berg研究小组的DNA体外重组实验。

1973年，斯坦福大学的S.Cohen研究小组的DNA体外重组和大肠杆菌转化实验。(见下两张幻灯片)同年，加利福尼亚大学的H.Boyer也进行了类似的实验。这一实验的成功标志着基因工程的诞生，因此，1973年被定为基因工程诞生的元年。

二、基因工程的诞生这一实验的成功标志着基因工程的诞生，因此，86pSC101抗四环素pR6-5抗卡那霉素DNA连接酶重组DNA分子EcoRI抗卡那霉素基因pSC101抗四环素pR6-5抗卡那霉素DNA连接酶重组DN87培养平皿卡那霉素平板四环素\卡那霉素平板大肠杆菌四环素平板培养平皿卡那霉素平板四环素\卡那霉素平板大肠杆菌四环素平88三、基因工程的发展

分为艰难阶段、逐渐成熟阶段、迅速发展阶段、鼎盛发展阶段。1、基因工程的艰难阶段(1973~1976，载体和受体系统的安全性改造)

基因工程的安全性问题，导致许多国家限制基因重组的实验。2、基因工程的逐渐成熟阶段(1976~1982，基因工程药物的研制)1976年,Genentech(GeneticEngineeringTechnology)公司成立(byRobertSwansonandHerbBoyer)。

1977年Boyer等首先将人工合成的生长激素释放抑制因子14肽的基因重组入质粒，成功地在大肠杆菌中合成得到这14肽(见下图)；1978年Itakura（板仓）等使人生长激素191肽在大肠杆菌中表达成功；1979年美国基因技术公司用人工合成的人胰岛素基因重组转入大肠杆菌中，并通过发酵生产人胰岛素。从而揭开了基因工程产业化的序幕。

三、基因工程的发展89大肠杆菌生长激素释放抑制因子重组体+SS基因目的基因基因载体从动物脑中提取5mg---50万只羊脑9升工程大肠杆菌培养液大肠杆菌生长激素释放抑制因子重组体+SS基因目的基因基因载体903、基因工程的迅速发展阶段(1982~2000，动植物基因工程育种与基因治疗)

发展了一系列新的基因工程操作技术，构建了多种转化原核生物和动物、植物细胞的载体。

1982年首次通过显微注射培育出世界上第一个转基因动物——转基因小鼠。

1983年采用农杆菌介导法培育出世界上第一例转基因植物——转基因烟草。1990年美国政府首次批准一项人体基因治疗临床研究计划，对一名因腺苷脱氨酶基因缺陷而患有重度联合免疫缺陷症的儿童进行基因治疗获得成功。1991年，美国提出人类基因组计划并实施。3、基因工程的迅速发展阶段(1982~2000，动植物基因工914、鼎盛发展阶段(21世纪)

2019年完成人类基因组计划。至今，基因工程药物上市的有几十种，上百种正在进行临床试验。

转基因植物迅速发展，目前至少有150种转基因植物问世。自从1986年抗除草剂转基因烟草被首次批准进入田间试验以来,至今国际上已有30个国家批准上千例转基因植物进入田间试验,涉及的植物种类达50多种。自从1994年转基因延熟西红柿获准上市以来，目前至少有51种转基因植物上市。

4、鼎盛发展阶段(21世纪)92据国际有关方面预测，到20l0年，全世界转基因食物的种植面积将增至10000万公顷。据国际有关方面预测，到20l0年，全世界93虽然转基因动物比转基因植物诞生早，但其发展比转基因植物要慢得多！主要原因是动物转基因技术操作烦琐、困难，动物细胞培养要求高，不易再生出个体。荷兰的GenPharm公司用转基因牛生产乳铁蛋白，预计每年从牛奶生产出来营养奶粉的销售额是50亿美元。虽然转基因动物比转基因植物诞生早，但其发展比转94

英国罗斯林研究所研制成功的转基因羊，其乳汁中含有α[1]-抗胰蛋白酶，可治疗肺气肿病。这种病在北美比较常见，病人以前只能依赖于注射人的α[1]-抗胰蛋白酶做替代疗法，价格昂贵，而现在用转基因羊来生产，每升这种羊奶可售6000美元。英国罗斯林研究所研制成功的转基因羊，其乳汁中含95

中国工程院院士曾溢涛教授研究小组获得5只转基因山羊。其中一只奶山羊的乳汁中，含有堪称血友病人救星的药物蛋白——有活性的人凝血因子Ⅸ。

中国工程院院士曾溢涛教授研究小组获得5只转基因山96第三节基因工程研究的主要内容一、基因工程研究的主要内容主要包括：基础研究（载体的研究、受体系统的研究、目的基因研究、工具酶的研究、转化方法的研究、生物基因组学研究）和应用研究等。1、载体的研究构建各种用途载体及提高外源基因表达的效率。2、受体系统的研究

包括细菌、真菌、植物、动物。

受体系统的安全性及转化效率。3、目的基因研究目的基因的分离、克隆及改造。

第三节基因工程研究的主要内容974、工具酶的研究开发新的工具酶。5、转化方法的研究开发各种受体细胞的高效转化方法。6、生物基因组学研究具有重要经济价值的各种生物的基因组测序、挖掘新的基因等。7、应用研究

包括基因工程药物研究、基因疫苗研究、转基因植物研究、转基因动物研究以及在酶制剂工业、食品工业、化学与能源工业及环境保护等方面的应用。

4、工具酶的研究98二、基因工程的基本操作程序

①分离获得带有目的基因的DNA片段及载体选择与构建。

②限制性核酸内切酶分别切割外源DNA和载体。

③通过DNA连接酶将外源基因DNA片段连接到载体上，形成重组DNA分子。

④将重组DNA分子引入到受体细胞(转化)。

⑤带有重组体细胞(转化体)的扩增及选择培养。

⑥转化体的鉴定，获得外源基因高效稳定表达的基因工程菌或细胞。⑦目的基因的进一步研究分析，并设法使之实现功能蛋白的表达(基因功能研究或基因改造研究)。

二、基因工程的基本操作程序99基因工程原理和技术-1-2-课件100第四节基因工程的意义与发展前景一、基因工程研究的意义①大规模生产其他生物体内含量极微但却具有较高经济价值的生物分子；②设计构建新物种(新性状乃至全新物种

)；③搜寻、分离和鉴定生物体尤其是人体内的遗传信息资源(基因)。二、基因工程发展前景基因工程问世以来短短的三十年，显示出了巨大的活力，基因工程的前景将更加灿烂辉煌。今后，基因工程的重点研究方向是基因组学、基因工程药物、动植物生物反应器和环保等方面。

第四节基因工程的意义与发展前景101第二章基因工程的工具酶

工具酶是指基因工程操作中所使用的核酸酶类。根据其用途分为四类：限制性内切酶、连接酶、聚合酶、修饰酶。第一节限制性核酸内切酶一、宿主的限制-修饰现象(见下图)

限制作用(restriction)：指一定类型的细菌可以通过限制酶的作用，破坏入侵的噬菌体DNA，导致噬菌体的寄主幅度受到限制。这是维护宿主遗传稳定的保护机制。

修饰作用(modification)：指寄主本身的DNA，由于在合成后通过甲基化酶的作用得以甲基化，使DNA得以修饰，从而免遭自身限制性酶的破坏。这是宿主细胞识别自身遗传物质和外来遗传物质的作用机制。第二章基因工程的工具酶102R/M系统①DNA甲基化酶②限制性核酸内切酶R/M系统的作用①限制作用②修饰作用R/M系统1031953年，Arber发现限制-修饰现象，预见限制性核酸内切酶的存在；1970年，H.O.Smith从流感嗜血杆菌中分离出第一个II型限制性核酸内切酶HindII。Nathans首次用限制性酶切割SV40DNA。1953年，Arber发现限制-修饰现象，预104基因工程原理和技术-1-2-课件105

根据限制-修饰系统的遗传分析，大肠杆菌K12有以下4种表型：①rk+mk+：野生型，具有完整的限制和修饰功能。②rk-mk+：限制缺陷型，不能降解外源DNA，但具有修饰功能，这类突变株经常用于基因工程的受体。③rk-mk-：限制和修饰缺陷型，既无限制功能，又无修饰功能，也常用于基因工程的受体。④rk+mk-：修饰缺陷型，缺乏修饰自身DNA的功能，但具有限制功能，故也称为“自杀性表型”(suicidephenotype)。根据限制-修饰系统的遗传分析，大肠杆菌K12有106二、限制性核酸内切酶的类型

限制性核酸内切酶是指一类能识别双链DNA分子中特定核苷酸序列，并在识别序列内或附近特异切割双链DNA的核酸内切酶。

简称限制性内切酶或限制性酶，目前已经鉴定出三种不同类型。至今，已发现近4000种限制酶。rebase.neb特性Ⅰ型Ⅱ型Ⅲ型酶分子结构功能辅助因子识别序列切割位点切割方式应用价值举例异源三聚体限制与修饰ATPMg2+SAM非对称序列距识别序列1kb处随机性切割无EcoK、EcoB同源三聚体限制Mg2+

4-6bp回文序列识别序列内或附近特异切割广泛EcoRI、HindIII…异源二聚体限制与修饰ATPMg2+SAM非对称序列识别序列下游24-26bp处随机性切割小EcoPI二、限制性核酸内切酶的类型特性Ⅰ型Ⅱ型Ⅲ型酶分子结构异源三聚107三、限制性核酸内切酶的命名

1973年H.O.Smith和D.Nathams提出命名系统，1980年Roberts在此基础上进行了修改。①限制性核酸内切酶第一个字母(大写，斜体)代表该酶的宿主菌属名(genus)第一个字母；第二、三个字母(小写，斜体)代表宿主菌种名(species)前两个字母。②第四个字母代表宿主菌的菌株名的第一个字母(小写，正体)或染色体外成分(质粒或噬菌体，大写，正体)。③若从一种菌株中发现了几种限制性核酸内切酶，即根据发现和分离的先后顺序用罗马字母表示(正体)。

Haemophilusinfluenzae

d

流感嗜血杆菌d株

HindⅡ

HindⅢ三、限制性核酸内切酶的命名108四、II型限制性核酸内切酶的基本特性1、II型限制性内切酶的识别序列

一般为4～6bp的回文序列。也有6bp以上的，如NotI，称为稀有切割限制酶。有些为反向重复序列(间断回文序列)，如SfiI。有些II型限制酶的识别序列中，某一位或二位碱基并非严格专一，如HindII可识别4种核苷酸序列。

酶识别序列酶识别序列BamHIG↓GATCCPstICTGCA↓GBglIIA↓GATCTSalIG↓TCGACEcoRIG↓AATTCSau3AI↓GATCHindIIGTPy↓PuACSfiIGGCCNNNN↓NGGCCHindIIIA↓AGCTTSmaICCC↓GGGKpnIGGTAC↓CXbaIT↓CTAGANotIGC↓GGCCGCXhoIC↓TCGAG四、II型限制性核酸内切酶的基本特性酶识别序列酶识别序列Ba1092、II型限制性核酸内切酶的切割方式大多数II型限制性核酸内切酶均在其识别位点内部切割双链DNA，水解磷酸二酯键中3’位的酯键，产生3’端为羟基、5’端为磷酸基团的片段。有三种切割方式：①在识别序列的对称轴的5’末端切割，产生5’黏性末端，如EcoRI2、II型限制性核酸内切酶的切割方式110②在识别序列的对称轴的3’端切割，则产生3’黏性末端，如PstI②在识别序列的对称轴的3’端切割，则产生3’黏性末端，111③在识别序列的对称轴上切割，产生平头末端，如PvuII有些识别序列为间断型回文序列的II限制酶，其切点位于不确定核苷酸中，如：BglIGCCNNNN↓NGGC

SfiIGGCCNNNNN↓NGGCC

XmnIGAANN↓NNTTC③在识别序列的对称轴上切割，产生平头末端，如PvuII112有极少数II型限制性核酸内切酶的切割位点远离识别序列，如MboII识别GAAGA序列，切割位点则是：5’－GAAGANNNNNNNN↓N－3’3’－CTTCTNNNNNNNN↓N－5’

同裂酶是指识别序列相同、切割方式相同或不同、来源不同的II限制性核酸内切酶。如：HpaII与MspI的识别序列和切割位点都相同(C↓CGG)，但MspI还可以识别已甲基化的序列CmCGG；

SmaI(CCC↓GGG)和XmaI(C↓CCGGG)，识别序列相同，但切割位点不同。有极少数II型限制性核酸内切酶的切割位点远离113同尾酶是指来源各异、识别序列不同，但产生相同的黏性末端的II限制性核酸内切酶。如：BamHI(5’-G↓GATCC-3’)

BglII(5’-A↓GATCT-3’)3、II型限制性核酸内功酶不具有甲基化功能如EcoRI限制性核酸内切酶与EcoRI甲基化酶，两者均识别GAATTC序列，而前者能对G↓AATTC序列进行切割，后者的作用是使第二个A甲基化。目前已经分离到许多II型限制性核酸内切酶与其对应的甲基化酶。同尾酶是指来源各异、识别序列不同，但产生相同1144、II型限制性核酸内切酶对单链DNA的切割有一些II限制性核酸内切酶，除双链DNA外，还可以特异识别并切割单链DNA的相应位点，只是切割效率比较低。如HhaI能切割单链噬菌体ФX174和M13mp18DNA，只是切割单链DNA比切割双链DNA效率低50％。五、Ⅱ限制性核酸内切酶的主要用途①产生具有相同粘性末端的DNA片段，以便重组克隆；②建立DNA分子的限制酶图谱；③构建基因文库；④构建载体。4、II型限制性核酸内切酶对单链DNA的切割115六、II型限制性核酸内切酶的酶切反应1、标准酶解体系的建立

反应体积一般为20μl(根据DNA量可适当扩大)。

①10×酶切缓冲液2μl(大部分酶反应缓冲液基本相似：

50mmol/LTris-HClpH7.0~7.5、0~100mmol/LNaCl、10mmol/LMgCl2、1mmol/LDTT)②酶(根据酶活力大小及工作性质确定酶量，不超过反应总体积10％

③DNA样品(μ

g~mg)④无菌水

限制性核酸内切酶的一个活力单位(U)为：在合适的温度和缓冲液中，在20μ

L反应体系中，1h完全降解1ug标准DNA所需要的酶量。六、II型限制性核酸内切酶的酶切反应1162、酶解反应①混匀②酶解(温度、时间)③酶解鉴定④终止a、加EDTA至10mmol/L；b、加SDS至0.1%(W/V)；c、65℃水浴保温20min(有些最适反应温度较高的酶不能使之完全失活，如AceIII、BelI、BstXI、TaqI)；d、酚/氯仿抽提酶，乙醇沉淀DNA

3、限制性核酸内切酶对DNA的不完全酶解(见下图)不完全酶解对于构建物理图谱和基因组文库是非常必要的。其方法有减少酶量、增加反应体积、缩短反应时间和降低反应温度等。

2、酶解反应117incomplete1231+3incompletedigestion123SmaIcomplete1+2+3incomplete1231+3incompletedig1184、Ⅱ限制性核酸内切酶操作的注意事项①商品化的限制性核酸内切酶均为浓缩液，每次操作时应使用新的吸头去取酶；②加入酶的体积应不超过总体积的10%，否则酶液中的甘油浓度超过5%时将会抑制酶的活性；③整个操作应在0℃进行，即在冰浴中进行，而且是在加入其它试剂之后，最后加入酶；④尽可能使反应体积减到最小，即尽可能少加水；⑤当切割大量DNA时，通常采用延长反应时间，减少酶的用量；⑥当DNA需2种或以上酶切时，应用通用缓冲液。若没有通用缓冲液时，只有用1种酶切完后，纯化酶切产物，再进行下一个酶切反应。4、Ⅱ限制性核酸内切酶操作的注意事项119七、影响限制性核酸内切酶活性与酶切效果的因素

1、酶的纯度；要求不存在其他核酸内切酶或外切酶的污染。

2、DNA样品的纯度；DNA样品中的蛋白质、苯酚、氯仿、乙醇、EDTA、SDS、高NaCl等，都能抑制酶活性。样品中DNase会降解DNA，影响酶切。3、酶切反应的温度、时间；多数II型限制酶最适反应温度是37℃，但