染色体工程课件

第六章染色体工程第六章染色体工程16.1人工诱导多倍体6.2人工诱导雌雄核发育6.3动物的性别控制6.4染色体分离与转移6.5人工染色体染色体工程课件2染色体工程是人们按照一定的设计，有计划地消减、添加或代换同种或异种染色体的技术。它不但在遗传学等生命科学基础理论研究上大有可为，在人工诱导多倍体的育种研究、人工诱导雌、雄核发育及性别控制等研究领域都将大显身手，为人类造福染色体工程是人们按照一定的设计，有计划地消减、添加或代换同种36.1人工诱导多倍体多倍体(polyploid)是指每个体细胞中含有三个或更多染色体组的个体，在自然界高等植物中较多出现，而动物界较少。1939年，Frankhauser和Griftiths首先在两栖类中成功地诱发了三倍体。由于多倍体动物具有生长速度快，成活率高及抗病能力强等特点，所以人工诱导多倍体，改善动物经济性状倍受重视。现在，该技术已成为低等经济动物育种的主要技术之一，其成果已经应用于生产实践，取得了明显的经济效益和社会效益6.1人工诱导多倍体多倍体(polyploid)是指每个体细4多倍体的形成多倍体是由于细胞内染色体加倍而形成的，即通过抑制受精卵第二极体的放出了产生三倍体或抑制第一次卵裂产生四倍体，可以利用生物、化学和物理的方法得到多倍体。生物学上主要通过杂交尤其是种间杂交获得异源多倍体。物理学方法包括温度休克法、水静压法和高盐高碱法等。有些化学物质也可以用来阻止第二极体的排出或受精卵的有丝分裂而产生三倍体或四倍体，如细胞松弛素B。多倍体的形成多倍体是由于细胞内染色体加倍而形成的，即通过抑制5生物学方法生物学上主要通过杂交尤其是种间杂交获得异源多倍体。例如用雌性草鱼（2n＝48）与雄性三角鲂（2n＝48）杂交可以获得子一代草鲂杂种三倍体。这种不同科、属、种之间的远源杂交、会导致第二极体不排出，而产生多倍体。生物学方法生物学上主要通过杂交尤其是种间杂交获得异源多倍体。6物理学方法温度休克法：冷休克法（0～5度）和热休克法（30度左右）。定义：用略高于或略低于致死温度的冷或热休克来诱导三倍体或四倍体的方法。关键：能否成功地阻止第二次成熟分裂或第二极体的排出。要达到这一点，必须考虑温度处理的开始时间（TA）、处理持续时间（D）和处理温度（T）这三个因素。目前对鱼类使用温度休克法诱导三倍体的工作报道较多。一般来说，冷水性鱼类如鲑科种类应用热休克法、而温水性鱼类用冷休克效果较好。优点：廉价、易操作，是诱导动物细胞多倍体化的常用手段，也有利于大规模生产使用。物理学方法温度休克法：冷休克法（0～5度）和热休克法（30度7该法的成功率为80％。染色体介导技术:使细胞经有丝分裂阻断秋水仙胺处理而同步，再洗涤数次以去除残存于细胞破碎和保持染色体的形状；性别控制（sexcontrol）：通过人为地干预或操作，使动物按人们的愿望繁殖出所需性别的后代的技术。多倍体(polyploid)是指每个体细胞中含有三个或更多染色体组的个体，在自然界高等植物中较多出现，而动物界较少。细胞毒性分析法:将H-Y抗血清与补体（豚鼠血清）加入培养液中对胚胎进行培养，将在培养过程中继续发展发育胚胎分类微H-Y－（雌性），将出现个别卵裂球溶解以及不能发育到囊胚期者分类为H-Y＋（雄性），用这种方法鉴定的H-Y胚胎移植后所生仔鼠有86％为雌性。但是仍旧在遗传学基础理论和育种中都有一定的价值，利用雄核生殖的精子可用育冷冻基因库，保存种质资源对基因世代克隆系的建立，不同种间核质的杂种的产生和YY雄性引起的性别控制等也有特殊的意义。人工诱导雌核发育是指用经过紫外线、X射线或Y射线等处理后的失活精子来“受精”，再在适当时间施以冷、热、高压等物理处理，以抑制第二极体的排出，使卵子发育为正常的二倍体动物。要达到这一点，必须考虑温度处理的开始时间（TA）、处理持续时间（D）和处理温度（T）这三个因素。一般来说，冷水性鱼类如鲑科种类应用热休克法、而温水性鱼类用冷休克效果较好。质量好的染色体标本可以从胚胎获得，因为胚胎细胞分裂指数高。秋水仙碱可以抑制细胞分裂中纺锤丝的形成，因而抑制有丝分裂，这在植物中已经广泛应用。温度对某些生物而言，是一条控制性别发育的途径。这种方法分析的灵敏度之高，甚至单个精子细胞的性别也可在3小时之内鉴定出来。假如二倍体源自第一次有丝分裂的抑制，杂和雌性个体的子代应该都是纯合型；1939年，Frankhauser和Griftiths首先在两栖类中成功地诱发了三倍体。ZW型，大部分鸟类、鳞翅目昆虫、一部分鱼类和两栖类属于这种类型。但试验证明，温度变化只改变了性别发育的方向，并没有改变染色体组成。γ射线和X射线具有较高的穿通能力，有利于处理大量精子，其主要作用可能是诱使染色体断裂，因而对精子的存活可能有一定影响。多倍体是由于细胞内染色体加倍而形成的，即通过抑制受精卵第二极体的放出了产生三倍体或抑制第一次卵裂产生四倍体，可以利用生物、化学和物理的方法得到多倍体。蛋白质电泳鉴定：间接法物理学方法水静压法：采用较高的水静压（65kg/cm2）来抑制第二极体的放出或第一次卵裂产生多倍体。这种方法诱导率高（一般在90％～100％）、处理时间（3～5min）短，对受精卵损伤小、成活率高。但是，该法需要专门的设备——水压机，成本较高，其样品室容量有限，处理卵的量有限，所以不适于大规模生产的。该法的成功率为80％。物理学方法水静压法：采用较高的水静压（8化学方法有些化学物质也可以用来阻止第二极体的排出或受精卵的有丝分裂而产生三倍体或四倍体。细胞松弛素B能抑制肌动蛋白聚合微丝，从而抑制细胞质分裂。秋水仙碱可以抑制细胞分裂中纺锤丝的形成，因而抑制有丝分裂，这在植物中已经广泛应用。其它药物还有麻醉剂，如N2O、CHClF2和聚乙二醇等。缺点：化学药品一般比较昂贵、且具有毒性，影响处理后的胚胎发育，同时加上化学药物诱导产生的多倍体往往是在育种上没有价值的镶嵌体，所以化学方法在实际中的应用不及物理方法。化学方法有些化学物质也可以用来阻止第二极体的排出或受精卵的有9鉴定方法核体积测量：间接法测量红血球来鉴定：间接法蛋白质电泳鉴定：间接法染色体计数是鉴定多倍体倍性：直接法另外，利用血液成分、酶的含量等进行生化分析也可以鉴定多倍体。采用何种方法均有利有弊，进行鉴定主要依赖于所测样本的发育时期、实验要求和所具备的仪器设备条件。鉴定方法核体积测量：间接法10主要方法的介绍核体积测量属于间接法。一般，细胞核大小与染色体数目成比例增加，而且为维持恒定的核质比例，随着细胞核的增大，细胞大小也按比例增加。因此组成多倍体有机体的细胞及细胞核通常要比二倍体大一些。但多倍体的器官或身体并不一定都比二倍体大。主要方法的介绍核体积测量属于间接法。11主要方法的介绍在鱼类，通常通过测量红血球来鉴定多倍体倍性，其中核体积之比最为常用，也有用核面积甚至单独用核长X或短X之比来表示的。蛋白质电泳也可以用来鉴定多倍体倍性，属于间接法，但在鉴定时要慎用。利用血清蛋白质电泳图差异来辨别二倍体和三倍体卵胎生帆锵，但不能用来分辨关东银鲫。染色体计数是鉴定多倍体倍性的一个准确的直接方法，但比较费时。质量好的染色体标本可以从胚胎获得，因为胚胎细胞分裂指数高。流式细胞仪测定DNA含量是较准确的方法主要方法的介绍在鱼类，通常通过测量红血球来鉴定多倍体倍性，其12优点和缺点多倍体育种技术方法简单、见效快，具有潜在的理论和应用价值。许多诱导的多倍体动物如两栖类、鱼类、贝类等却具有良好的生存力和生长率。种间杂交生长快，可以同时具有两个不同的种的优良特性，但成活率较低。利用三倍体不育的特性，将生殖腺发育消耗的能量用于动物生长，可以避免因繁殖季节及肉质下降而延误上市时间或影响商品价值，缩短了养殖周期，减少了养殖成本，这在鲍鱼、昆虫等方面已有应用。某些多倍体动物肉质量、含氧量、抗病性等经济性状较二倍体好。虽然，还有一些难点比如准确的处理时间、诱导率、成活率、孵化率、倍性鉴定方法等还未解决，但随生命科学的进一步发展，多倍体育种技术将为人类做出更大的贡献。优点和缺点多倍体育种技术方法简单、见效快，具有潜在的理论和应135.2人工诱导雌、雄发育雌核发育（gynogenesis），俗称假受精，意指精子虽然正常地钻入和激活卵子，但精子的细胞核并未参与卵球的发育，精子的染色体很快消失，胚胎的发育仅在母体遗传的控制下进行。自然界中一些无脊椎动物和鱼类等存在。人工诱导雌核发育是指用经过紫外线、X射线或Y射线等处理后的失活精子来“受精”，再在适当时间施以冷、热、高压等物理处理，以抑制第二极体的排出，使卵子发育为正常的二倍体动物。凡雌核发育的个体，都具有纯母系的单倍体染色体组，依赖于卵子染色体组的二倍体化。5.2人工诱导雌、雄发育雌核发育（gynogenesis），14历史1911年，赫特威氏就第一个成功地人工消除了精子染色体活性，并发现了“赫特威氏效应”。赫特威氏效应指只有在适当的高辐射剂量下，才能导致精子染色体完全失活，届时精子虽能穿入卵内，却能起到激活卵球启动发育的作用。历史15雌核发育的关键问题要达到实验性二倍体雌核发育目的，必须解决两个最主要的问题。第一：人为地使精子的遗传物质失活；第二：阻止雌性个体染色体数目的减少。不同种类的物理辐射和化学药品的处理对精子遗传物质失活颇为有效。雌核发育的关键问题要达到实验性二倍体雌核发育目的，必须解决两16辐射处理包括γ射线（通常用60Co或173Cs）、X射线和紫外光线。γ射线和X射线具有较高的穿通能力，有利于处理大量精子，其主要作用可能是诱使染色体断裂，因而对精子的存活可能有一定影响。紫外光的主要作用是诱使胸腺嘧啶二聚化，因此这一过程能在光作用下修补复活，但对较厚的、不透明的精细胞样品，失活的效果较差，不适易处理大体积精子。辐射处理包括γ射线（通常用60Co或173Cs）、X射线和紫17采用显微手术也可以直接去除受精卵中雄性原核，再在第一次卵裂时期二倍体化，而得到雌核发育的二倍体，这在小鼠实验中已经成功。另外，甲苯胺蓝、乙烯尿素、二甲基硫酸等化学物质具有消除精子染色体遗传活性的能力，其机理可能是与精子DNA相互作用。采用显微手术也可以直接去除受精卵中雄性原核，再在第一次卵裂时18核体积测量属于间接法。此外,胚胎质量似乎也与荧光强度和类型有关，第二抗体有时发生非特异性结合，如与同卵周隙的细胞碎片结合等。间接免疫荧光法:将胚胎先用H-Y抗体处理30分钟，再用异硫氰酸盐荧光素（FITC）标记的二抗处理，根据特异荧光判断，有荧光者为雄胚，无荧光者为雌胚，将两类胚胎移植后，判为雄胚者有78％发育成雄鼠，判微雌胚者有81％发育为雌鼠。胚胎性别鉴定研究注意采用四种方法：细胞遗传学方法、生物化学方法、免疫学方法、分子生物学方法当前用PCR进行胚胎性别鉴定的最大问题是污染，在采胚细胞时采到粘在胚胎上的精子、或切割刀粘上另一个胚胎的细胞、空气中的污染、PCR、试剂的污染以及培养液中的BSA、FCS都可能成为污染源、引致假阳性结果。YAC是酵母人工染色体的缩写。3）雄性单倍体型：没有单独的性染色体存在，其性别决定于卵细胞是否受精。对胚胎的H-Y抗原检测有三种方法：即细胞毒性分析法、间接免疫荧光分析法和囊胚形成抑制法。1kb，编码204个氨基酸蛋白质，其高泳动类非组蛋白(HMG)高度保守。测量红血球来鉴定：间接法免疫学方法：利用H-Y抗血清或H-Y单克隆抗体检测胚胎上是否存在雄性特异性H-Y抗原，从而进行胚胎性别鉴定的一种方法。环境决定性别可以分为两种类型SRY启动睾丸分化，然后由睾丸分泌睾酮（T）和AMH(转化因子B家族的一员)控性别的分化。性别控制（sexcontrol）：通过人为地干预或操作，使动物按人们的愿望繁殖出所需性别的后代的技术。人工诱导雌核发育是指用经过紫外线、X射线或Y射线等处理后的失活精子来“受精”，再在适当时间施以冷、热、高压等物理处理，以抑制第二极体的排出，使卵子发育为正常的二倍体动物。缺点：化学药品一般比较昂贵、且具有毒性，影响处理后的胚胎发育，同时加上化学药物诱导产生的多倍体往往是在育种上没有价值的镶嵌体，所以化学方法在实际中的应用不及物理方法。对胚胎的H-Y抗原检测有三种方法：即细胞毒性分析法、间接免疫荧光分析法和囊胚形成抑制法。1911年，赫特威氏就第一个成功地人工消除了精子染色体活性，并发现了“赫特威氏效应”。染色体计数是鉴定多倍体倍性：直接法例如某些蛙类XX为雌体，XY为雄体，若蝌蚪在20℃下发育，子代一半为雄性，一半为雌性；雄核发育的个体的生存率非常低，这是由于精子基因型的纯合性、卵子由于照射的损伤和阻止第一次卵裂处理的损伤等原因造成的。实现二倍体化利用保留卵球第二极体，或者阻碍受精卵早期有丝分裂，都可以实现二倍体化。如前节所述，利用温度、压力或化学方法可以诱使卵球二倍体化，如冷休克、热休克、流体静水压、细胞松弛素B、聚乙二醇处理等，这些都已经在鱼类上实现。核体积测量属于间接法。实现二倍体化利用保留卵球第二极体，或者19鉴定方法鉴别雌核发育的个体，通常以颜色、形态以及生化等方面的指标为依据，也可以通过细胞学的研究。若是雌核发育，其囊胚细胞中只出现一套来自雌核的染色体，否则雌核和雄核染色体各占一半，得到的是杂交种。用遗传标志的方法来鉴别雄核发育的二倍体化，即由第一次有丝分裂的阻碍，还是由保留极体而来。假如二倍体源自第一次有丝分裂的抑制，杂和雌性个体的子代应该都是纯合型；而如果是通过阻止第二极体的外排产生的雌核发育个体，则子代的情况取决于着丝点与基因间的距离。在着丝点－基因距离远离时，将明显增加杂和型子代的比例。鉴定方法鉴别雌核发育的个体，通常以颜色、形态以及生化等方面的20优缺点雌核发育具有产生单性种群的能力，用之已经成功地得到100％草鱼、鲤鱼的雌性个体，其核型与同型雌性配子一样，但也不可避免地会导致后代的近亲繁殖的衰退，因此其实际应用价值有待研究。能得到同源型的二倍体克隆，在育种上具有重要性，也提供了一种优越的研究品系。如果用激素致使性反转为雄性，再与同胞姐妹交配，可以获得强壮的纯系同型配子的二倍体。借助雌核发育，可以得到新的纯系来筛选，除去有害的等位基因，改良近亲繁殖系。雌核发育还可以为遗传学研究提供某些致死突变种的生物品系，精确地测定雌核发育引起的近亲繁殖衰退程度，影响生存力的致死基因的测定和分析，成为个体发育研究和遗传育种实践的好材料。优缺点雌核发育具有产生单性种群的能力，用之已经成功地得到1021雄核发育（androgenesis）是指因经过紫外线、X射线或Y射线处理的卵子与正常的精子受精，再在适当时间施以冷、热或高压等物理处理，使进入卵子内的精子染色体加倍，而发育成为完全为父本性状的二倍体。雄核发育的个体的生存率非常低，这是由于精子基因型的纯合性、卵子由于照射的损伤和阻止第一次卵裂处理的损伤等原因造成的。但是仍旧在遗传学基础理论和育种中都有一定的价值，利用雄核生殖的精子可用育冷冻基因库，保存种质资源对基因世代克隆系的建立，不同种间核质的杂种的产生和YY雄性引起的性别控制等也有特殊的意义。雄核发育（androgenesis）是指因经过紫外线、X射线225.3动物的性别控制

性别控制（sexcontrol）：通过人为地干预或操作，使动物按人们的愿望繁殖出所需性别的后代的技术。动物性别控制在畜牧业、家禽养殖业、水产养殖业和家蚕养殖业等方面有重要的经济意义。一般，雌性的经济效益较雄性的经济效益高。实现性别控制，不仅可以提高大量雌性个体如奶牛、奶羊、母鸡的数量，节省怀公犊（羔）雌体繁殖年度的饲料消耗。雄性肉牛、绵羊和猪等则以雄性增重要快，肉质优，故可通过性别控制多产雄性后代。同时通过性别控制可以消灭不理想的隐性疾病，防止性连锁疾病；加快珍惜动物的繁殖、保种进程；促进遗传科学的发展。在有性生殖的生物中，不同生物性别决定的机制有所不同，大多数决定于性染色体的差异，少数取决于体细胞染色体的倍数性，极少数决定于个体发育所处的内外环境条件。5.3动物的性别控制

性别控制（sexcontrol）：通23性别决定的遗传类型1）雄性异配子型：该类型的雌性个体只产生一种染色体组成的配子，雄性个体产生两种不同类型的配子。包括：XO型，属于这一类的有大部分直翅目昆虫以及臭虫、蜘蛛、多足类昆虫和线虫等；XY型，绝大部分哺乳类动物、双翅目、鞘翅目昆虫，以及某些鱼类和两栖类为此类型。2）雌性异配子型：雄性个体只产生一种染色体组成的配子，而雌性个体产生两种不同的配子。ZO型，主要发生在某些昆虫中；ZW型，大部分鸟类、鳞翅目昆虫、一部分鱼类和两栖类属于这种类型。3）雄性单倍体型：没有单独的性染色体存在，其性别决定于卵细胞是否受精。由孤雌生殖产生的单倍体卵发育为雄性个体，二倍体的受精卵发育为雌性个体。这一类型主要是膜翅目昆虫，包括蜜蜂、马蜂、叶蜂和蚂蚁等性别决定的遗传类型1）雄性异配子型：该类型的雌性个体只产生一24环境决定性别可以分为两种类型内在环境型：即某些低等的雌雄同体动物和绝大部分雌雄同株和雌雄同花植物，它们的同一个体能够分化出两种性器官，产生两种配子，例如蚯蚓、苹果、蜗牛和多数显花植物属于此类，它们不同性腺和配子的产生仅仅取决于所处位置及内在发育环境的差异。外在环境型：因所处外界环境条件的不同，而引起性别的表现不同。例如某些蛙类XX为雌体，XY为雄体，若蝌蚪在20℃下发育，子代一半为雄性，一半为雌性；在30℃下发育，则全部发育为雄蛙。但试验证明，温度变化只改变了性别发育的方向，并没有改变染色体组成。环境决定性别可以分为两种类型内在环境型：即某些低等的雌雄同体25性别决定的理论1.性倾向的平衡学说1932年，布里奇斯提出平衡学说，又称Bridges平衡学说。用二倍体的雄果蝇（2n=8）与三倍体的雌果蝇(2n=12)杂交，在后代中获得了具有不同染色体组合的个体。根据X染色体和常染色体(A)之间的平衡性，他观察到不同程度的雄性和雌性。以X染色体与常染色体间的X/A比率来表示这种平衡，在果蝇中，Y染色体在性别决定上似乎不具有任何效应。性别决定的理论1.性倾向的平衡学说262.Y染色体决定雄性理论在人类和其他哺乳动物中，Y染色体是强有力的雄性决定因子。雌性个体为XX，雄性个体为XY，据试验观察证实，凡是Y染色体存在的，无论X染色体多少，都表现为雄性个体，这不符合性倾向的平衡理论，性别表现主要取决于Y染色体的存在与否。2.Y染色体决定雄性理论在人类和其他哺乳动物中，Y染色体是强273.Goldschmidt学说戈尔德施密特(Goldschmidt，1934)的研究是在舞毒蛾上进行的。这种生物的雄性是同配性别的（WW），而雌性是异配性别的(WZ),雌雄嵌合体的中间性别很普通。Goldschmidt认为，舞毒蛾的性别是由母蛾遗传来的雌性性别决定因子(F)和位于W染色体上的雄性性别决定因子（M）这两种力量的对比或平衡所决定的。认为雌性组成方式是F/W(F>W),而雄性是F/MM(F<MM)，若雄性和雌性决定因子强度平衡，则出现雌雄嵌合体的中间性别。3.Goldschmidt学说戈尔德施密特(Goldschm28另外，利用血液成分、酶的含量等进行生化分析也可以鉴定多倍体。但试验证明，温度变化只改变了性别发育的方向，并没有改变染色体组成。蛋白质电泳鉴定：间接法在鱼类，通常通过测量红血球来鉴定多倍体倍性，其中核体积之比最为常用，也有用核面积甚至单独用核长X或短X之比来表示的。缺点是可鉴定的胚胎较少。YAC是酵母人工染色体的缩写。一般来说，冷水性鱼类如鲑科种类应用热休克法、而温水性鱼类用冷休克效果较好。1kb，编码204个氨基酸蛋白质，其高泳动类非组蛋白(HMG)高度保守。在有性生殖的生物中，不同生物性别决定的机制有所不同，大多数决定于性染色体的差异，少数取决于体细胞染色体的倍数性，极少数决定于个体发育所处的内外环境条件。其它药物还有麻醉剂，如N2O、CHClF2和聚乙二醇等。水静压法：采用较高的水静压（65kg/cm2）来抑制第二极体的放出或第一次卵裂产生多倍体。两种类型配子的分离是由异配型的性别来实现的。间接免疫荧光法:将胚胎先用H-Y抗体处理30分钟，再用异硫氰酸盐荧光素（FITC）标记的二抗处理，根据特异荧光判断，有荧光者为雄胚，无荧光者为雌胚，将两类胚胎移植后，判为雄胚者有78％发育成雄鼠，判微雌胚者有81％发育为雌鼠。性染色体引起性别分化的途径3）在果蝇中发现，当某一条染色体集中较多的与性别有关的基因时，可以变成性染色体。此外,胚胎质量似乎也与荧光强度和类型有关，第二抗体有时发生非特异性结合，如与同卵周隙的细胞碎片结合等。一般来说，冷水性鱼类如鲑科种类应用热休克法、而温水性鱼类用冷休克效果较好。最后使细胞经注射针喷射而破碎，即可使染色体释放出来。但是，该法需要专门的设备——水压机，成本较高，其样品室容量有限，处理卵的量有限，所以不适于大规模生产的。常染色体集中了许多雄性倾向基因，因而也对性别起作用。温度休克法：冷休克法（0～5度）和热休克法（30度左右）。酵母人工染色体是典型的克隆系统，可以用来分离和克隆极大的DNA片段。多倍体(polyploid)是指每个体细胞中含有三个或更多染色体组的个体，在自然界高等植物中较多出现，而动物界较少。水静压法：采用较高的水静压（65kg/cm2）来抑制第二极体的放出或第一次卵裂产生多倍体。在类似的研究中，用生物素标记的Y特异性探针进行原位杂交，准确率达100％。XY型，绝大部分哺乳类动物、双翅目、鞘翅目昆虫，以及某些鱼类和两栖类为此类型。要达到这一点，必须考虑温度处理的开始时间（TA）、处理持续时间（D）和处理温度（T）这三个因素。多倍体(polyploid)是指每个体细胞中含有三个或更多染色体组的个体，在自然界高等植物中较多出现，而动物界较少。一般来说，冷水性鱼类如鲑科种类应用热休克法、而温水性鱼类用冷休克效果较好。3）在果蝇中发现，当某一条染色体集中较多的与性别有关的基因时，可以变成性染色体。细胞毒性分析法:将H-Y抗血清与补体（豚鼠血清）加入培养液中对胚胎进行培养，将在培养过程中继续发展发育胚胎分类微H-Y－（雌性），将出现个别卵裂球溶解以及不能发育到囊胚期者分类为H-Y＋（雄性），用这种方法鉴定的H-Y胚胎移植后所生仔鼠有86％为雌性。人的SRY基因位于YP11.测量红血球来鉴定：间接法3）在果蝇中发现，当某一条染色体集中较多的与性别有关的基因时，可以变成性染色体。在类似的研究中，用生物素标记的Y特异性探针进行原位杂交，准确率达100％。用遗传标志的方法来鉴别雄核发育的二倍体化，即由第一次有丝分裂的阻碍，还是由保留极体而来。利用保留卵球第二极体，或者阻碍受精卵早期有丝分裂，都可以实现二倍体化。这就对操作过程提出了更严格的要求但是，该法需要专门的设备——水压机，成本较高，其样品室容量有限，处理卵的量有限，所以不适于大规模生产的。生物学上主要通过杂交尤其是种间杂交获得异源多倍体。反之，易形成XY的雄性合子。利用三倍体不育的特性，将生殖腺发育消耗的能量用于动物生长，可以避免因繁殖季节及肉质下降而延误上市时间或影响商品价值，缩短了养殖周期，减少了养殖成本，这在鲍鱼、昆虫等方面已有应用。性染色体引起性别分化的途径1)由单个基因或单个基因的复合体决定的。两种类型配子的分离是由异配型的性别来实现的。单个基因可能有三种基因型为AA、AA’和A’A’。如果以同配性别AA出现则为雌性，而异配性别AA’出现则为雄性。前提是没有A’A’产生。另外，利用血液成分、酶的含量等进行生化分析也可以鉴定多倍体。292）有些生物的性别决定是由于位于某染色体上的主基因发生突变来实现的。通过长期的逐步分化，一个普通染色体可能会演变为决定性别的性染色体。玉米这种雌雄异花同株的植物就是如此，当空杆6a基因或无花丝8k基因发生突变后，可以抑制雌穗发育。2）有些生物的性别决定是由于位于某染色体上的主基因发生突变来303）在果蝇中发现，当某一条染色体集中较多的与性别有关的基因时，可以变成性染色体。X染色体事实上已集中了许多雌性倾向基因，成为决定雌性的主要遗传基础。常染色体集中了许多雄性倾向基因，因而也对性别起作用。3）在果蝇中发现，当某一条染色体集中较多的与性别有关的基因时313）在果蝇中发现，当某一条染色体集中较多的与性别有关的基因时，可以变成性染色体。X染色体事实上已集中了许多雌性倾向基因，成为决定雌性的主要遗传基础。常染色体集中了许多雄性倾向基因，因而也对性别起作用。3）在果蝇中发现，当某一条染色体集中较多的与性别有关的基因时324）在哺乳动物所以种类中，均发现了SRY基因，它是Y染色体性别决定区基因。人的SRY基因位于YP11.3，只含有一个外显子，无内含子，转录单位长约1.1kb，编码204个氨基酸蛋白质，其高泳动类非组蛋白(HMG)高度保守。哺乳动物性腺发育的基本途径是雌性的，最早由DAX－1编码的一种蛋白质启动，这一途径在雄性体内被SRY的活动所掩盖。SRY启动睾丸分化，然后由睾丸分泌睾酮（T）和AMH(转化因子B家族的一员)控性别的分化。4）在哺乳动物所以种类中，均发现了SRY基因，它是Y染色体性33实现性别控制的方法对于较高等的动物，如家畜等，可以利用X、Y精子分离和胚胎性别鉴定技术来实现性别控制。依赖X和Y型精子不同的特性，人们试图分离精子。早在1925年，Lush就通过离心法分离兔子的X与Y精子，但没有成功。后来，人们试图通过受精前阴道输入精氨酸，改变生殖道pH的方式选择性利用精子来控制性别比率为目的。pH值碱性，雌兔比例高，但结果不稳定。利用免疫亲和柱层析技术的方法，可以将表达H-Y抗原的Y精子于不表达的X精子分开。实现性别控制的方法对于较高等的动物，如家畜等，可以利用X、Y34利用流式细胞仪鉴定精子DNA的含量，可以将X与Y精子分开。这类方法目前对精子分离的准确率为79％，对Y精子分离的准确率为70％。其主要缺点是分离速度慢，一台分类器1小时仅能分离40万个精子，不够一次子宫颈内输精应用，只能通过手术进行输卵管输精。利用流式细胞仪鉴定精子DNA的含量，可以将X与Y精子分开。这35温度对某些生物而言，是一条控制性别发育的途径。例如:鳄鱼的性别完全由胚胎发育的温度所决定，受精卵在30度发育起来的全是雌性，34度以上，孵化起来的全是雄性。另外，在牡蛎、蛙、和鳖等动物中也存在这样的现象。温度对某些生物而言，是一条控制性别发育的途径。36性激素也可以控制性别，这甚至在鸟类和其它一些高等哺乳动物中也有体现，只是不同的动物受影响的程度有所不同罢了，这在鱼类性别控制中有广泛的应用。利用甲基睾丸素、雄性激素等可以实现性反转得到全部雄性个体，但指数表现型改变，不能遗传。性激素也可以控制性别，这甚至在鸟类和其它一些高等哺乳动物中也37如果调整阴道酸碱度，也可以达到性别筛选的目的。当阴道液偏酸时，Y型精子移动慢，而X型精子速度快，因而受精卵是XX的概率高；反之，易形成XY的雄性合子。该法的成功率为80％。如在精液中加入睾丸，胎血、脑垂体等生物制剂或激素，也可控制生物性别，该法的成功率也有60～70％。在低等动物中，通过人工雌雄核发育，三倍体激素等实现性别控制。如果调整阴道酸碱度，也可以达到性别筛选的目的。当阴道液偏酸时38性别鉴定雌性胚胎中存在的X染色体相关酶的活性、雄性胚胎存在的H-Y抗原以及SRY基因可以对植前胚进行性别鉴定。胚胎性别鉴定研究注意采用四种方法：细胞遗传学方法、生物化学方法、免疫学方法、分子生物学方法

性别鉴定雌性胚胎中存在的X染色体相关酶的活性、雄性胚胎存在的39细胞遗传学方法：指通过核型分析对胚胎进行性别鉴定。其准确率为100％，但获得高质量的中期染色体分散相难度很大。生物化学微量分析法：指通过测定与X染色体相关联的酶活性来鉴定雌性胚胎的一种方法。其原理是早期雌性胚胎的两条X染色体中必有一条失活，在胚胎基因组的激活与X染色体失活之间的短暂时期内，雌性的两条X染色体都可以被转移，这反映在雌性胚胎中与X染色体相关连的细胞内浓度及活性是雄性胚胎的两倍。此点可作为进行胚胎性鉴的依据细胞遗传学方法：指通过核型分析对胚胎进行性别鉴定。其准确率为40免疫学方法：利用H-Y抗血清或H-Y单克隆抗体检测胚胎上是否存在雄性特异性H-Y抗原，从而进行胚胎性别鉴定的一种方法。对胚胎的H-Y抗原检测有三种方法：即细胞毒性分析法、间接免疫荧光分析法和囊胚形成抑制法。免疫学方法：利用H-Y抗血清或H-Y单克隆抗体检测胚胎上是否41细胞毒性分析法:将H-Y抗血清与补体（豚鼠血清）加入培养液中对胚胎进行培养，将在培养过程中继续发展发育胚胎分类微H-Y－（雌性），将出现个别卵裂球溶解以及不能发育到囊胚期者分类为H-Y＋（雄性），用这种方法鉴定的H-Y胚胎移植后所生仔鼠有86％为雌性。但该方法是以破坏一部分胚胎为代价。细胞毒性分析法:将H-Y抗血清与补体（豚鼠血清）加入培养液中42间接免疫荧光法:将胚胎先用H-Y抗体处理30分钟，再用异硫氰酸盐荧光素（FITC）标记的二抗处理，根据特异荧光判断，有荧光者为雄胚，无荧光者为雌胚，将两类胚胎移植后，判为雄胚者有78％发育成雄鼠，判微雌胚者有81％发育为雌鼠。此方法的主要优点是不损害胚胎，亦具有适当的性别鉴定准确率，但对荧光强度的估价则具有高度的主观性。此外,胚胎质量似乎也与荧光强度和类型有关，第二抗体有时发生非特异性结合，如与同卵周隙的细胞碎片结合等。间接免疫荧光法:将胚胎先用H-Y抗体处理30分钟，再用异硫氰43细胞毒性分析法:将H-Y抗血清与补体（豚鼠血清）加入培养液中对胚胎进行培养，将在培养过程中继续发展发育胚胎分类微H-Y－（雌性），将出现个别卵裂球溶解以及不能发育到囊胚期者分类为H-Y＋（雄性），用这种方法鉴定的H-Y胚胎移植后所生仔鼠有86％为雌性。第一：人为地使精子的遗传物质失活；辐射处理包括γ射线（通常用60Co或173Cs）、X射线和紫外光线。每个YAC都可以装进100万碱基以上的DNA片段，既可以保证基因结构的完整性，又可以大大减少核基因库所需的克隆数目，从而使文库的操作难度减少。蛋白质电泳鉴定：间接法利用流式细胞仪鉴定精子DNA的含量，可以将X与Y精子分开。多倍体(polyploid)是指每个体细胞中含有三个或更多染色体组的个体，在自然界高等植物中较多出现，而动物界较少。温度对某些生物而言，是一条控制性别发育的途径。但是仍旧在遗传学基础理论和育种中都有一定的价值，利用雄核生殖的精子可用育冷冻基因库，保存种质资源对基因世代克隆系的建立，不同种间核质的杂种的产生和YY雄性引起的性别控制等也有特殊的意义。人工诱导雌核发育是指用经过紫外线、X射线或Y射线等处理后的失活精子来“受精”，再在适当时间施以冷、热、高压等物理处理，以抑制第二极体的排出，使卵子发育为正常的二倍体动物。真核生物的染色体的关键序列：人工诱导雌核发育是指用经过紫外线、X射线或Y射线等处理后的失活精子来“受精”，再在适当时间施以冷、热、高压等物理处理，以抑制第二极体的排出，使卵子发育为正常的二倍体动物。如果以同配性别AA出现则为雌性，而异配性别AA’出现则为雄性。但是仍旧在遗传学基础理论和育种中都有一定的价值，利用雄核生殖的精子可用育冷冻基因库，保存种质资源对基因世代克隆系的建立，不同种间核质的杂种的产生和YY雄性引起的性别控制等也有特殊的意义。其它药物还有麻醉剂，如N2O、CHClF2和聚乙二醇等。最后使细胞经注射针喷射而破碎，即可使染色体释放出来。但试验证明，温度变化只改变了性别发育的方向，并没有改变染色体组成。染色体计数是鉴定多倍体倍性：直接法雄核发育的个体的生存率非常低，这是由于精子基因型的纯合性、卵子由于照射的损伤和阻止第一次卵裂处理的损伤等原因造成的。对胚胎的H-Y抗原检测有三种方法：即细胞毒性分析法、间接免疫荧光分析法和囊胚形成抑制法。最后使细胞经注射针喷射而破碎，即可使染色体释放出来。YAC既可以大到连在一起很容易形成很长的连续排列的DNA，又可以小到能够方便地通过亚克隆进行DNA序列分析研究，这种特性对于目前正在实施的各种基因组计划意义极大。囊胚形成抑制法:利用H-Y抗体对雄性桑椹胚向囊胚发育具有可逆性抑制的原理发展起的一种胚胎性别鉴定法。这种方法是一种简单而有效的胚胎性别鉴定方法。不足之处是容易将一部分发育迟缓的雄性胚胎误判为雌性胚胎细胞毒性分析法:将H-Y抗血清与补体（豚鼠血清）加入培养液中44分子生物学方法:指从胚胎取下少量细胞，将其DNA与Y染色体特异标记的DNA序列（探针）杂交。在类似的研究中，用生物素标记的Y特异性探针进行原位杂交，准确率达100％。此法的优点是不用放射性标记、设备简单、技术难度低，且可在24小时之内得到结果.缺点是可鉴定的胚胎较少。通过聚合酶连式反应扩增Y染色体DNA可大大增加灵敏度，改善准确度。这种方法分析的灵敏度之高，甚至单个精子细胞的性别也可在3小时之内鉴定出来。当前用PCR进行胚胎性别鉴定的最大问题是污染，在采胚细胞时采到粘在胚胎上的精子、或切割刀粘上另一个胚胎的细胞、空气中的污染、PCR、试剂的污染以及培养液中的BSA、FCS都可能成为污染源、引致假阳性结果。这就对操作过程提出了更严格的要求分子生物学方法:指从胚胎取下少量细胞，将其DNA与Y染色体特455.4染色体转移染色体转移又称为染色体转导，是指把同特定基因表达有关的染色体或染色体片段取出转入受体细胞，使之表达，并能在细胞分裂中一代一代传递下去的技术。前面所讲述的微细胞核移植是一种方法。5.4染色体转移染色体转移又称为染色体转导，是指把同特定基因46染色体介导技术:使细胞经有丝分裂阻断秋水仙胺处理而同步，再洗涤数次以去除残存于细胞破碎和保持染色体的形状；同时，在分离缓冲液中加入的乙烯乙二醇可维系染色体的完整性，提高钙离子的浓度则能防止染色体的解离；最后使细胞经注射针喷射而破碎，即可使染色体释放出来。分离到中期染色体后，可以通过细胞的吞噬作用进入受体细胞。由于近年技术的改进，可先用磷酸钙和染色体共沉淀，再用二甲亚砜处理受体细胞，或采用卵磷脂与胆固醇制备脂质体，将染色体转入受体细胞内。转移频率可达10－5～10－4水平染色体介导技术:使细胞经有丝分裂阻断秋水仙胺处理而同步，再洗47受体细胞的分离和鉴定导入基因的受体细胞还要利用HAT培养基等筛选系统将含有外源遗传物质的受体细胞分离出来。再进一步鉴定，以防有的突变体细胞以极低频率发生自发回复突变而逃避选择。多用染色体分带作组型分析，或通过电泳迁移带谱分离细胞的某些组分中的酶如LDH、MDH及GGPD，免疫学技术可测定同功酶的表达等进行鉴定受体细胞的分离和鉴定导入基因的受体细胞还要利用HAT培养基等485.5人工染色体（YAC）YAC是酵母人工染色体的缩写。真核生物的染色体的关键序列：一是着丝粒；二是端粒；三是自主复制序列。用DNA重组技术分离开这些重要组分然后再将它们连接起来产生人工染色体。酵母人工染色体载体有两个臂，每个臂的末端有一个端粒，而臂上则有着丝粒等染色体必备元件，还有供选择的标记基因；当外源DNA片段连接进两个臂中以后，通过选择标记人们可以从酵母宿主细胞中筛选出重组的人工染色体。5.5人工染色体（YAC）YAC是酵母人工染色体的缩写。49YAC的构建YAC的构建50pYAC长约8kb，带有人工染色体所需的一切元件。当要用它进行克隆时，先用BamHI和SmaI对它进行双酶解，回收两个臂，然后平末端的外源大片段DNA就可以两个臂连接，形成真正意义上的人工染色体

pYAC长约8kb，带有人工染色体所需的一切元件。当要用它进51分离到中期染色体后，可以通过细胞的吞噬作用进入受体细胞。有些化学物质也可以用来阻止第二极体的排出或受精卵的有丝分裂而产生三倍体或四倍体。染色体转移又称为染色体转导，是指把同特定基因表达有关的染色体或染色体片段取出转入受体细胞，使之表达，并能在细胞分裂中一代一代传递下去的技术。第一：人为地使精子的遗传物质失活；常染色体集中了许多雄性倾向基因，因而也对性别起作用。对于较高等的动物，如家畜等，可以利用X、Y精子分离和胚胎性别鉴定技术来实现性别控制。蛋白质电泳鉴定：间接法这类方法目前对精子分离的准确率为79％，对Y精子分离的准确率为70％。但试验证明，温度变化只改变了性别发育的方向，并没有改变染色体组成。细胞毒性分析法:将H-Y抗血清与补体（豚鼠血清）加入培养液中对胚胎进行培养，将在培养过程中继续发展发育胚胎分类微H-Y－（雌性），将出现个别卵裂球溶解以及不能发育到囊胚期者分类为H-Y＋（雄性），用这种方法鉴定的H-Y胚胎移植后所生仔鼠有86％为雌性。性染色体引起性别分化的途径多倍体(polyploid)是指每个体细胞中含有三个或更多染色体组的个体，在自然界高等植物中较多出现，而动物界较少。此外,胚胎质量似乎也与荧光强度和类型有关，第二抗体有时发生非特异性结合，如与同卵周隙的细胞碎片结合等。分离到中期染色体后，可以通过细胞的吞噬作用进入受体细胞。蛋白质电泳鉴定：间接法测量红血球来鉴定：间接法优点：廉价、易操作，是诱导动物细胞多倍体化的常用手段，也有利于大规模生产使用。测量红血球来鉴定：间接法每个YAC都可以装进100万碱基以上的DNA片段，既可以保证基因结构的完整性，又可以大大减少核基因库所需的克隆数目，从而使文库的操作难度减少。转移频率可达10－5～10－4水平温度对某些生物而言，是一条控制性别发育的途径。每个YAC都可以装进100万碱基以上的DNA片段，既可以保证基因结构的完整性，又可以大大减少核基因库所需的克隆数目，从而使文库的操作难度减少。YAC既可以大到连在一起很容易形成很长的连续排列的DNA，又可以小到能够方便地通过亚克隆进行DNA序列分析研究，这种特性对于目前正在实施的各种基因组计划意义极大。目前人们仍在不断更新，改进YAC载体，逐步克服其插入片段重组率高的缺陷。酵母人工染色体是典型的克隆系统，可以用来分离和克隆极大的DNA片段。此外还有细菌、人的人工染色体BAC、HAC分离到中期染色体后，可以通过细胞的吞噬作用进入受体细胞。每个52第六章染色体工程第六章染色体工程536.1人工诱导多倍体6.2人工诱导雌雄核发育6.3动物的性别控制6.4染色体分离与转移6.5人工染色体染色体工程课件54染色体工程是人们按照一定的设计，有计划地消减、添加或代换同种或异种染色体的技术。它不但在遗传学等生命科学基础理论研究上大有可为，在人工诱导多倍体的育种研究、人工诱导雌、雄核发育及性别控制等研究领域都将大显身手，为人类造福染色体工程是人们按照一定的设计，有计划地消减、添加或代换同种556.1人工诱导多倍体多倍体(polyploid)是指每个体细胞中含有三个或更多染色体组的个体，在自然界高等植物中较多出现，而动物界较少。1939年，Frankhauser和Griftiths首先在两栖类中成功地诱发了三倍体。由于多倍体动物具有生长速度快，成活率高及抗病能力强等特点，所以人工诱导多倍体，改善动物经济性状倍受重视。现在，该技术已成为低等经济动物育种的主要技术之一，其成果已经应用于生产实践，取得了明显的经济效益和社会效益6.1人工诱导多倍体多倍体(polyploid)是指每个体细56多倍体的形成多倍体是由于细胞内染色体加倍而形成的，即通过抑制受精卵第二极体的放出了产生三倍体或抑制第一次卵裂产生四倍体，可以利用生物、化学和物理的方法得到多倍体。生物学上主要通过杂交尤其是种间杂交获得异源多倍体。物理学方法包括温度休克法、水静压法和高盐高碱法等。有些化学物质也可以用来阻止第二极体的排出或受精卵的有丝分裂而产生三倍体或四倍体，如细胞松弛素B。多倍体的形成多倍体是由于细胞内染色体加倍而形成的，即通过抑制57生物学方法生物学上主要通过杂交尤其是种间杂交获得异源多倍体。例如用雌性草鱼（2n＝48）与雄性三角鲂（2n＝48）杂交可以获得子一代草鲂杂种三倍体。这种不同科、属、种之间的远源杂交、会导致第二极体不排出，而产生多倍体。生物学方法生物学上主要通过杂交尤其是种间杂交获得异源多倍体。58物理学方法温度休克法：冷休克法（0～5度）和热休克法（30度左右）。定义：用略高于或略低于致死温度的冷或热休克来诱导三倍体或四倍体的方法。关键：能否成功地阻止第二次成熟分裂或第二极体的排出。要达到这一点，必须考虑温度处理的开始时间（TA）、处理持续时间（D）和处理温度（T）这三个因素。目前对鱼类使用温度休克法诱导三倍体的工作报道较多。一般来说，冷水性鱼类如鲑科种类应用热休克法、而温水性鱼类用冷休克效果较好。优点：廉价、易操作，是诱导动物细胞多倍体化的常用手段，也有利于大规模生产使用。物理学方法温度休克法：冷休克法（0～5度）和热休克法（30度59该法的成功率为80％。染色体介导技术:使细胞经有丝分裂阻断秋水仙胺处理而同步，再洗涤数次以去除残存于细胞破碎和保持染色体的形状；性别控制（sexcontrol）：通过人为地干预或操作，使动物按人们的愿望繁殖出所需性别的后代的技术。多倍体(polyploid)是指每个体细胞中含有三个或更多染色体组的个体，在自然界高等植物中较多出现，而动物界较少。细胞毒性分析法:将H-Y抗血清与补体（豚鼠血清）加入培养液中对胚胎进行培养，将在培养过程中继续发展发育胚胎分类微H-Y－（雌性），将出现个别卵裂球溶解以及不能发育到囊胚期者分类为H-Y＋（雄性），用这种方法鉴定的H-Y胚胎移植后所生仔鼠有86％为雌性。但是仍旧在遗传学基础理论和育种中都有一定的价值，利用雄核生殖的精子可用育冷冻基因库，保存种质资源对基因世代克隆系的建立，不同种间核质的杂种的产生和YY雄性引起的性别控制等也有特殊的意义。人工诱导雌核发育是指用经过紫外线、X射线或Y射线等处理后的失活精子来“受精”，再在适当时间施以冷、热、高压等物理处理，以抑制第二极体的排出，使卵子发育为正常的二倍体动物。要达到这一点，必须考虑温度处理的开始时间（TA）、处理持续时间（D）和处理温度（T）这三个因素。一般来说，冷水性鱼类如鲑科种类应用热休克法、而温水性鱼类用冷休克效果较好。质量好的染色体标本可以从胚胎获得，因为胚胎细胞分裂指数高。秋水仙碱可以抑制细胞分裂中纺锤丝的形成，因而抑制有丝分裂，这在植物中已经广泛应用。温度对某些生物而言，是一条控制性别发育的途径。这种方法分析的灵敏度之高，甚至单个精子细胞的性别也可在3小时之内鉴定出来。假如二倍体源自第一次有丝分裂的抑制，杂和雌性个体的子代应该都是纯合型；1939年，Frankhauser和Griftiths首先在两栖类中成功地诱发了三倍体。ZW型，大部分鸟类、鳞翅目昆虫、一部分鱼类和两栖类属于这种类型。但试验证明，温度变化只改变了性别发育的方向，并没有改变染色体组成。γ射线和X射线具有较高的穿通能力，有利于处理大量精子，其主要作用可能是诱使染色体断裂，因而对精子的存活可能有一定影响。多倍体是由于细胞内染色体加倍而形成的，即通过抑制受精卵第二极体的放出了产生三倍体或抑制第一次卵裂产生四倍体，可以利用生物、化学和物理的方法得到多倍体。蛋白质电泳鉴定：间接法物理学方法水静压法：采用较高的水静压（65kg/cm2）来抑制第二极体的放出或第一次卵裂产生多倍体。这种方法诱导率高（一般在90％～100％）、处理时间（3～5min）短，对受精卵损伤小、成活率高。但是，该法需要专门的设备——水压机，成本较高，其样品室容量有限，处理卵的量有限，所以不适于大规模生产的。该法的成功率为80％。物理学方法水静压法：采用较高的水静压（60化学方法有些化学物质也可以用来阻止第二极体的排出或受精卵的有丝分裂而产生三倍体或四倍体。细胞松弛素B能抑制肌动蛋白聚合微丝，从而抑制细胞质分裂。秋水仙碱可以抑制细胞分裂中纺锤丝的形成，因而抑制有丝分裂，这在植物中已经广泛应用。其它药物还有麻醉剂，如N2O、CHClF2和聚乙二醇等。缺点：化学药品一般比较昂贵、且具有毒性，影响处理后的胚胎发育，同时加上化学药物诱导产生的多倍体往往是在育种上没有价值的镶嵌体，所以化学方法在实际中的应用不及物理方法。化学方法有些化学物质也可以用来阻止第二极体的排出或受精卵的有61鉴定方法核体积测量：间接法测量红血球来鉴定：间接法蛋白质电泳鉴定：间接法染色体计数是鉴定多倍体倍性：直接法另外，利用血液成分、酶的含量等进行生化分析也可以鉴定多倍体。采用何种方法均有利有弊，进行鉴定主要依赖于所测样本的发育时期、实验要求和所具备的仪器设备条件。鉴定方法核体积测量：间接法62主要方法的介绍核体积测量属于间接法。一般，细胞核大小与染色体数目成比例增加，而且为维持恒定的核质比例，随着细胞核的增大，细胞大小也按比例增加。因此组成多倍体有机体的细胞及细胞核通常要比二倍体大一些。但多倍体的器官或身体并不一定都比二倍体大。主要方法的介绍核体积测量属于间接法。63主要方法的介绍在鱼类，通常通过测量红血球来鉴定多倍体倍性，其中核体积之比最为常用，也有用核面积甚至单独用核长X或短X之比来表示的。蛋白质电泳也可以用来鉴定多倍体倍性，属于间接法，但在鉴定时要慎用。利用血清蛋白质电泳图差异来辨别二倍体和三倍体卵胎生帆锵，但不能用来分辨关东银鲫。染色体计数是鉴定多倍体倍性的一个准确的直接方法，但比较费时。质量好的染色体标本可以从胚胎获得，因为胚胎细胞分裂指数高。流式细胞仪测定DNA含量是较准确的方法主要方法的介绍在鱼类，通常通过测量红血球来鉴定多倍体倍性，其64优点和缺点多倍体育种技术方法简单、见效快，具有潜在的理论和应用价值。许多诱导的多倍体动物如两栖类、鱼类、贝类等却具有良好的生存力和生长率。种间杂交生长快，可以同时具有两个不同的种的优良特性，但成活率较低。利用三倍体不育的特性，将生殖腺发育消耗的能量用于动物生长，可以避免因繁殖季节及肉质下降而延误上市时间或影响商品价值，缩短了养殖周期，减少了养殖成本，这在鲍鱼、昆虫等方面已有应用。某些多倍体动物肉质量、含氧量、抗病性等经济性状较二倍体好。虽然，还有一些难点比如准确的处理时间、诱导率、成活率、孵化率、倍性鉴定方法等还未解决，但随生命科学的进一步发展，多倍体育种技术将为人类做出更大的贡献。优点和缺点多倍体育种技术方法简单、见效快，具有潜在的理论和应655.2人工诱导雌、雄发育雌核发育（gynogenesis），俗称假受精，意指精子虽然正常地钻入和激活卵子，但精子的细胞核并未参与卵球的发育，精子的染色体很快消失，胚胎的发育仅在母体遗传的控制下进行。自然界中一些无脊椎动物和鱼类等存在。人工诱导雌核发育是指用经过紫外线、X射线或Y射线等处理后的失活精子来“受精”，再在适当时间施以冷、热、高压等物理处理，以抑制第二极体的排出，使卵子发育为正常的二倍体动物。凡雌核发育的个体，都具有纯母系的单倍体染色体组，依赖于卵子染色体组的二倍体化。5.2人工诱导雌、雄发育雌核发育（gynogenesis），66历史1911年，赫特威氏就第一个成功地人工消除了精子染色体活性，并发现了“赫特威氏效应”。赫特威氏效应指只有在适当的高辐射剂量下，才能导致精子染色体完全失活，届时精子虽能穿入卵内，却能起到激活卵球启动发育的作用。历史67雌核发育的关键问题要达到实验性二倍体雌核发育目的，必须解决两个最主要的问题。第一：人为地使精子的遗传物质失活；第二：阻止雌性个体染色体数目的减少。不同种类的物理辐射和化学药品的处理对精子遗传物质失活颇为有效。雌核发育的关键问题要达到实验性二倍体雌核发育目的，必须解决两68辐射处理包括γ射线（通常用60Co或173Cs）、X射线和紫外光线。γ射线和X射线具有较高的穿通能力，有利于处理大量精子，其主要作用可能是诱使染色体断裂，因而对精子的存活可能有一定影响。紫外光的主要作用是诱使胸腺嘧啶二聚化，因此这一过程能在光作用下修补复活，但对较厚的、不透明的精细胞样品，失活的效果较差，不适易处理大体积精子。辐射处理包括γ射线（通常用60Co或173Cs）、X射线和紫69采用显微手术也可以直接去除受精卵中雄性原核，再在第一次卵裂时期二倍体化，而得到雌核发育的二倍体，这在小鼠实验中已经成功。另外，甲苯胺蓝、乙烯尿素、二甲基硫酸等化学物质具有消除精子染色体遗传活性的能力，其机理可能是与精子DNA相互作用。采用显微手术也可以直接去除受精卵中雄性原核，再在第一次卵裂时70核体积测量属于间接法。此外,胚胎质量似乎也与荧光强度和类型有关，第二抗体有时发生非特异性结合，如与同卵周隙的细胞碎片结合等。间接免疫荧光法:将胚胎先用H-Y抗体处理30分钟，再用异硫氰酸盐荧光素（FITC）标记的二抗处理，根据特异荧光判断，有荧光者为雄胚，无荧光者为雌胚，将两类胚胎移植后，判为雄胚者有78％发育成雄鼠，判微雌胚者有81％发育为雌鼠。胚胎性别鉴定研究注意采用四种方法：细胞遗传学方法、生物化学方法、免疫学方法、分子生物学方法当前用PCR进行胚胎性别鉴定的最大问题是污染，在采胚细胞时采到粘在胚胎上的精子、或切割刀粘上另一个胚胎的细胞、空气中的污染、PCR、试剂的污染以及培养液中的BSA、FCS都可能成为污染源、引致假阳性结果。YAC是酵母人工染色体的缩写。3）雄性单倍体型：没有单独的性染色体存在，其性别决定于卵细胞是否受精。对胚胎的H-Y抗原检测有三种方法：即细胞毒性分析法、间接免疫荧光分析法和囊胚形成抑制法。1kb，编码204个氨基酸蛋白质，其高泳动类非组蛋白(HMG)高度保守。测量红血球来鉴定：间接法免疫学方法：利用H-Y抗血清或H-Y单克隆抗体检测胚胎上是否存在雄性特异性H-Y抗原，从而进行胚胎性别鉴定的一种方法。环境决定性别可以分为两种类型SRY启动睾丸分化，然后由睾丸分泌睾酮（T）和AMH(转化因子B家族的一员)控性别的分化。性别控制（sexcontrol）：通过人为地干预或操作，使动物按人们的愿望繁殖出所需性别的后代的技术。人工诱导雌核发育是指用经过紫外线、X射线或Y射线等处理后的失活精子来“受精”，再在适当时间施以冷、热、高压等物理处理，以抑制第二极体的排出，使卵子发育为正常的二倍体动物。缺点：化学药品一般比较昂贵、且具有毒性，影响处理后的胚胎发育，同时加上化学药物诱导产生的多倍体往往是在育种上没有价值的镶嵌体，所以化学方法在实际中的应用不及物理方法。对胚胎的H-Y抗原检测有三种方法：即细胞毒性分析法、间接免疫荧光分析法和囊胚形成抑制法。1911年，赫特威氏就第一个成功地人工消除了精子染色体活性，并发现了“赫特威氏效应”。染色体计数是鉴定多倍体倍性：直接法例如某些蛙类XX为雌体，XY为雄体，若蝌蚪在20℃下发育，子代一半为雄性，一半为雌性；雄核发育的个体的生存率非常低，这是由于精子基因型的纯合性、卵子由于照射的损伤和阻止第一次卵裂处理的损伤等原因造成的。实现二倍体化利用保留卵球第二极体，或者阻碍受精卵早期有丝分裂，都可以实现二倍体化。如前节所述，利用温度、压力或化学方法可以诱使卵球二倍体化，如冷休克、热休克、流体静水压、细胞松弛素B、聚乙二醇处理等，这些都已经在鱼类上实现。核体积测量属于间接法。实现二倍体化利用保留卵球第二极体，或者71鉴定方法鉴别雌核发育的个体，通常以颜色、形态以及生化等方面的指标为依据，也可以通过细胞学的研究。若是雌核发育，其囊胚细胞中只出现一套来自雌核的染色体，否则雌核和雄核染色体各占一半，得到的是杂交种。用遗传标志的方法来鉴别雄核发育的二倍体化，即由第一次有丝分裂的阻碍，还是由保留极体而来。假如二倍体源自第一次有丝分裂的抑制，杂和雌性个体的子代应该都是纯合型；而如果是通过阻止第二极体的外排产生的雌核发育个体，则子代的情况取决于着丝点与基因间的距离。在着丝点－基因距离远离时，将明显增加杂和型子代的比例。鉴定方法鉴别雌核发育的个体，通常以颜色、形态以及生化等方面的72优缺点雌核发育具有产生单性种群的能力，用之已经成功地得到100％草鱼、鲤鱼的雌性个体，其核型与同型雌性配子一样，但也不可避免地会导致后代的近亲繁殖的衰退，因此其实际应用价值有待研究。能得到同源型的二倍体克隆，在育种上具有重要性，也提供了一种优越的研究品系。如果用激素致使性反转为雄性，再与同胞姐妹交配，可以获得强壮的纯系同型配子的二倍体。借助雌核发育，可以得到新的纯系来筛选，除去有害的等位基因，改良近亲繁殖系。雌核发育还可以为遗传学研究提供某些致死突变种的生物品系，精确地测定雌核发育引起的近亲繁殖衰退程度，影响生存力的致死基因的测定和分析，成为个体发育研究和遗传育种实践的好材料。优缺点雌核发育具有产生单性种群的能力，用之已经成功地得到1073雄核发育（androgenesis）是指因经过紫外线、X射线或Y射线处理的卵子与正常的精子受精，再在适当时间施以冷、热或高压等物理处理，使进入卵子内的精子染色体加倍，而发育成为完全为父本性状的二倍体。雄核发育的个体的生存率非常低，这是由于精子基因型的纯合性、卵子由于照射的损伤和阻止第一次卵裂处理的损伤等原因造成的。但是仍旧在遗传学基础理论和育种中都有一定的价值，利用雄核生殖的精子可用育冷冻基因库，保存种质资源对基因世代克隆系的建立，不同种间核质的杂种的产生和YY雄性引起的性别控制等也有特殊的意义。雄核发育（androgenesis）是指因经过紫外线、X射线745.3动物的性别控制

性别控制（sexcontrol）：通过人为地干预或操作，使动物按人们的愿望繁殖出所需性别的后代的技术。动物性别控制在畜牧业、家禽养殖业、水产养殖业和家蚕养殖业等方面有重要的经济意义。一般，雌性的经济效益较雄性的经济效益高。实现性别控制，不仅可以提高大量雌性个体如奶牛、奶羊、母鸡的数量，节省怀公犊（羔）雌体繁殖年度的饲料消耗。雄性肉牛、绵羊和猪等则以雄性增重要快，肉质优，故可通过性别控制多产雄性后代。同时通过性别控制可以消灭不理想的隐性疾病，防止性连锁疾病；加快珍惜动物的繁殖、保种进程；促进遗传科学的发展。在有性生殖的生物中，不同生物性别决定的机制有所不同，大多数决定于性染色体的差异，少数取决于体细胞染色体的倍数性，极少数决定于个体发育所处的内外环境条件。5.3动物的性别控制

性别控制（sexcontrol）：通75性别决定的遗传类型1）雄性异配子型：该类型的雌性个体只产生一种染色体组成的配子，雄性个体产生两种不同类型的配子。包括：XO型，属于这一类的有大部分直翅目昆虫以及臭虫、蜘蛛、多足类昆虫和线虫等；XY型，绝大部分哺乳类动物、双翅目、鞘翅目昆虫，以及某些鱼类和两栖类为此类型。2）雌性异配子型：雄性个体只产生一种染色体组成的配子，而雌性个体产生两种不同的配子。ZO型，主要发生在某些昆虫中；ZW型，大部分鸟类、鳞翅目昆虫、一部分鱼类和两栖类属于这种类型。3）雄性单倍体型：没有单独的性染色体存在，其性别决定于卵细胞是否受精。由孤雌生殖产生的单倍体卵发育为雄性个体，二倍体的受精卵发育为雌性个体。这一类型主要是膜翅目昆虫，包括蜜蜂、马蜂、叶蜂和蚂蚁等性别决定的遗传类型1）雄性异配子型：该类型的雌性个体只产生一76环境决定性别可以分为两种类型内在环境型：即某些低等的雌雄同体动物和绝大部分雌雄同株和雌雄同花植物，它们的同一个体能够分化出两种性器官，产生两种配子，例如蚯蚓、苹果、蜗牛和多数显花植物属于此类，它们不同性腺和配子的产生仅仅取决于所处位置及内在发育环境的差异。外在环境型：因所处外界环境条件的不同，而引起性别的表现不同。例如某些蛙类XX为雌体，XY为雄体，若蝌蚪在20℃下发育，子代一半为雄性，一半为雌性；在30℃下发育，则全部发育为雄蛙。但试验证明，温度变化只改变了性别发育的方向，并没有改变染色体组成。环境决定性别可以分为两种类型内在环境型：即某些低等的雌雄同体77性别决定的理论1.性倾向的平衡学说1932年，布里奇斯提出平衡学说，又称Bridges平衡学说。用二倍体的雄果蝇（2n=8）与三倍体的雌果蝇(2n=12)杂交，在后代中获得了具有不同染色体组合的个体。根据X染色体和常染色体(A)之间的平衡性，他观察到不同程度的雄性和雌性。以X染色体与常染色体间的X/A比率来表示这种平衡，在果蝇中，Y染色体在性别决定上似乎不具有任何效应。性别决定的理论1.性倾向的平衡学说782.Y染色体决定雄性理论在人类和其他哺乳动物中，Y染色体是强有力的雄性决定因子。雌性个体为XX，雄性个体为XY，据试验观察证实，凡是Y染色体存在的，无论X染色体多少，都表现为雄性个体，这不符合性倾向的平衡理论，性别表现主要取决于Y染色体的存在与否。2.Y染色体决定雄性理论在人类和其他哺乳动物中，Y染色体是强793.Goldschmidt学说戈尔德施密特(Goldschmidt，1934)的研究是在舞毒蛾上进行的。这种生物的雄性是同配性别的（WW），而雌性是异配性别的(WZ),雌雄嵌合体的中间性别很普通。Goldschmidt认为，舞毒蛾的性别是由母蛾遗传来的雌性性别决定因子(F)和位于W染色体上的雄性性别决定因子（M）这两种力量的对比或平衡所决定的。认为雌性组成方式是F/W(F>W),而雄性是F/MM(F<MM)，若雄性和雌性决定因子强度平衡，则出现雌雄嵌合体的中间性别。3.Goldschmidt学说戈尔德施密特(Goldschm80另外，利用血液成分、酶的含量等进行生化分析也可以鉴定多倍体。但试验证明，温度变化只改变了性别发育的方向，并没有改变染色体组成。蛋白质电泳鉴定：间接法在鱼类，通常通过测量红血球来鉴定多倍体倍性，其中核体积之比最为常用，也有用核面积甚至单独用核长X或短X之比来表示的。缺点是可鉴定的胚胎较少。YAC是酵母人工染色体的缩写。一般来说，冷水性鱼类如鲑科种类应用热休克法、而温水性鱼类用冷休克效果较好。1kb，编码204个氨基酸蛋白质，其高泳动类非组蛋白(HMG)高度保守。在有性生殖的生物中，不同生物性别决定的机制有所不同，大多数决定于性染色体的差异，少数取决于体细胞染色体的倍数性，极少数决定于个体发育所处的内外环境条件。其它药物还有麻醉剂，如N2O、CHClF2和聚乙二醇等。水静压法：采用较高的水静压（65kg/cm2）来抑制第二极体的放出或第一次卵裂产生多倍体。两种类型配子的分离是由异配型的性别来实现的。间接免疫荧光法:将胚胎先用H-Y抗体处理30分钟，再用异硫氰酸盐荧光素（FITC）标记的二抗处理，根据特异荧光判断，有荧光者为雄胚，无荧光者为雌胚，将两类胚胎移植后，判为雄胚者有78％发育成雄鼠，判微雌胚者有81％发育为雌鼠。性染色体引起性别分化的途径3）在果蝇中发现，当某一条染色体集中较多的与性别有关的基因时，可以变成性染色体。此外,胚胎质量似乎也与荧光强度和类型有关，第二抗体有时发生非特异性结合，如与同卵周隙的细胞碎片结合等。一般来说，冷水性鱼类如鲑科种类应用热休克法、而温水性鱼类用冷休克效果较好。最后使细胞经注射针喷射而破碎，即可使染色体释放出来。但是，该法需要专门的设备——水压机，成本较高，其样品室容量有限，处理卵的量有限，所以不适于大规模生产的。常染色体集中了许多雄性倾向基因，因而也对性别起作用。温度休克法：冷休克法（0～5度）和热休克法（30度左右）。酵母人工染色体是典型的克隆系统，可以用来分离和克隆极大的DNA片段。多倍体(polyploid)是指每个体细胞中含有三个或更多染色体组的个体，在自然界高等植物中较多出现，而动物界较少。水静压法：采用较高的水静压（65kg/cm2）来抑制第二极体的放出或第一次卵裂产生多倍体。在类似的研究中，用生物素标记的Y特异性探针进行原位杂交，准确率达100％。XY型，绝大部分哺乳类动物、双翅目、鞘翅目昆虫，以及某些鱼类和两栖类为此类型。要达到这一点，必须考虑温度处理的开始时间（TA）、处理持续时间（D）和处理温度（T）这三个因素。多倍体(polyploid)是指每个体细胞中含有三个或更多染色体组的个体，在自然界高等植物中较多出现，而动物界较少。一般来说，冷水性鱼类如鲑科种类应用热休克法、而温水性鱼类用冷休克效果较好。3）在果蝇中发现，当某一条染色体集中较多的与性别有关的基因时，可以变成性染色体。细胞毒性分析法:将H-Y抗血清与补体（豚鼠血清）加入培养液中对胚胎进行培养，将在培养过程中继续发展发育胚胎分类微H-Y－（雌性），将出现个别卵裂球溶解以及不能发育到囊胚期者分类为H-Y＋（雄性），用这种方法鉴定的H-Y胚胎移植后所生仔鼠有86％为雌性。人的SRY基因位于YP11.测量红血球来鉴定：间接法3）在果蝇中发现，当某一条染色体集中较多的与性别有关的基因时，可以变成性染色体。在类似的研究中，用生物素标记的Y特异性探针进行原位杂交，准确率达100％。用遗传标志的方法来鉴别雄核发育的二倍体化，即由第一次有丝分裂的阻碍，还是由保留极体而来。利用保留卵球第二极体，或者阻碍受精卵早期有丝分裂，都可以实现二倍体化。这就对操作过程提出了更严格的要求但是，该法需要专门的设备——水压机，成本较高，其样品室容量有限，处理卵的量有限，所以不适于大规模生产的。生物学上主要通过杂交尤其是种间杂交获得异源多倍体。反之，易形成XY的雄性合子。利用三倍体不育的特性，将生殖腺发育消耗的能量用于动物生长，可以避免因繁殖季节及肉质下降而延误上市时间或影响商品价值，缩短了养殖周期，减少了养殖成本，这在鲍鱼、昆虫等方面已有应用。性染色体引起性别分化的途径1)由单个基因或单个基因的复合体决定的。两种类型配子的分离是由异配型的性别来实现的。单个基因可能有三种基因型为AA、AA’和A’A’。如果以同配性别AA出现则为雌性，而异配性别AA’出现则为雄性。前提是没有A’A’产生。另外，利用血液成分、酶的含量等进行生化分析也可以鉴定多倍体。812）有些生物的性别决定是由于位于某染色体上的主基因发生突变来实现的。通过长期的逐步分化，一个普通染色体可能会演变为决定性别的性染色体。玉米这种雌雄异花同株的植物就是如此，当空杆6a基因或无花丝8k基因发生突变后，可以抑制雌穗发育。2）有些生物的性别决定是由于位于某染色体上的主基因发生突变来823）在果蝇中发现，当某一条染色体集中较多的与性别有关的基因时，可以变成性染色体。X染色体事实上已集中了许多雌性倾向基因，成为决定雌性的主要遗传基础。常染色体集中了许多雄性倾向基因，因而也对性别起作用。3）在果蝇中发现，当某一条染色体集中较多的与性别有关的基因时833）在果蝇中发现，当某一条染色体集中较多的与性别有关的基因时，可以变成性染色体。X染色体事实上已集中了许多雌性倾向基因，成为决定雌性的主要遗传基础。常染色体集中了许多雄性倾向基因，因而也