最新基因诊断治疗课件

进入夏天，少不了一个热字当头，电扇空调陆续登场，每逢此时，总会想起那一把蒲扇。蒲扇，是记忆中的农村，夏季经常用的一件物品。记忆中的故乡，每逢进入夏天，集市上最常见的便是蒲扇、凉席，不论男女老少，个个手持一把，忽闪忽闪个不停，嘴里叨叨着“怎么这么热”，于是三五成群，聚在大树下，或站着，或随即坐在石头上，手持那把扇子，边唠嗑边乘凉。孩子们却在周围跑跑跳跳，热得满头大汗，不时听到“强子，别跑了，快来我给你扇扇”。孩子们才不听这一套，跑个没完，直到累气喘吁吁，这才一跑一踮地围过了，这时母亲总是，好似生气的样子，边扇边训，“你看热的，跑什么？”此时这把蒲扇，是那么凉快，那么的温馨幸福，有母亲的味道！蒲扇是中国传统工艺品，在我国已有三千年多年的历史。取材于棕榈树，制作简单，方便携带，且蒲扇的表面光滑，因而，古人常会在上面作画。古有棕扇、葵扇、蒲扇、蕉扇诸名，实即今日的蒲扇，江浙称之为芭蕉扇。六七十年代，人们最常用的就是这种，似圆非圆，轻巧又便宜的蒲扇。蒲扇流传至今，我的记忆中，它跨越了半个世纪，也走过了我们的半个人生的轨迹，携带着特有的念想，一年年，一天天，流向长长的时间隧道，袅基因诊断治疗进入夏天，少不了一个热字当头，电扇空调陆续登场，每逢此时1基因诊断基因诊断2最新基因诊断治疗课件3最新基因诊断治疗课件4最新基因诊断治疗课件5最新基因诊断治疗课件6最新基因诊断治疗课件7最新基因诊断治疗课件8(2)几种不同形式的核酸分子杂交

a.Southern印迹(southernblot)杂交:

用于DNA的检测，可用于基因的限制性内切酶谱分析，基因突变分析等．b.Northern印迹(Northernblot)杂交:

用于RNA的检测，能对组织细胞中的总RNA或mRNA进行定性和定量分析．c.斑点杂交（dotblot):

既可以检测DNA也可以检测RNA,用于特定基因及其表达的定性和定量分析．方法简单、灵敏；但特异性低．

d.原位杂交（insituhybridization):

是细胞学技术与核酸杂交技术结合的一种核酸分析检测技术．可分为DNA原位杂交和RNA原位杂交,用于检测染色体中特定的基因位置，用于染色体疾病的诊断．

分类:①玻片原位杂交:如中期的染色体和组织切片.②膜上原位杂交:将菌落或噬菌斑影印在尼龙膜(如硝酸纤维膜)

(2)几种不同形式的核酸分子杂交9原位杂交的镜像图原位杂交的镜像图10(二)PCR技术在基因诊断中的应用（１）等位基因特异性寡聚核苷酸（allelespecificoligonnucleotide,ASO)探针斑点杂交：PCR-ASO该方法是诊断已知点的突变：需分别合成野生型和突变型探针．在基因诊断时，只需用PCR扩增受检者目的DNA片段，再分别与上述探针杂交．杂交的结果有如下几种情况：

①PCR扩增产物与正常探针杂交，不与突变探针杂交—不存在这种突变；②只与突变探针杂交--突变基因为纯合子；③与正常探针和突变探针都可杂交--突变基因为杂合子；④与正常探针和突变探针都不能杂交--突变基因不属于已发现的类型(二)PCR技术在基因诊断中的应用（１）等位基因特异性寡聚核11ASO探针杂交检测已知点突变受检者基因组DNA或含突变位点的PCR扩增产物与标记的ASO探针杂交ASO1ASO2NormalHeteroHomoASO探针杂交检测已知点突变受检者基因组DNA或含ASO1A12（２）PCR-单链构象多态性（PCRsinglestrandconformationploymorphism,PCR-SSCP)分析

是一种基于单链DNA构象差别来检测点突变的方法．DNA变性形成单链，在中性条件下长度相同的单链DNA,如果碱基组成和(或)排列顺序不同,形成的构象就不同,这样就形成了单链构象多态性.这些分子在非变性PAGE电泳中表现出不同的迁移率.

SSCP特别适于分析小于400bp的PCR产物。据认为SSCP可以区分1bp的差异

PCR-SSCP分析不能确定基因变异的内容，因此电泳后结果有差异后还需进行测序分析，确定变异性质

（２）PCR-单链构象多态性（PCRsinglestra13PCR-SSCP分析原理示意PCR-SSCP分析原理示意14(3)PCR-限制性片段长度多态性（PCRrestrictionfragmentlengthpolymorphisms,PCR-RFLP）分析基因突变导致的基因碱基组成或(和)顺序发生改变,会在基因结构中产生新的限制性内切酶位点或使原有的位点消失.用限制酶对不同个体基因组进行消化时，其电泳条带的数目和大小就会产生改变，根据这些改变可以判断出突变是否存在.(3)PCR-限制性片段长度多态性（PCRrestric15

限制性片段长度多态性

RFLPs(restrictionfragmentlengthpolymorphisms)样品一样品二1987年,H.Donis-Keller等人以RFLP为遗传标记绘制了第一张人类遗传图谱限制性片段长度多态性样品一样品二1987年,H.Don16(4)PCR-变性梯度凝胶电泳分析技术

双链DNA在一定浓度变性剂(尿素,甲酰胺)作用下,会变性而解链,导致DNA分子电泳迁移率变化.当在不同梯度浓度变性胶中电泳时,

DNA泳动到变性剂浓度能使DNA发生变性，DNA开始解链，从而不同的DNA片段会形成不同的迁移率条带．优点：可靠，检出单碱基突变率可达９５％．缺点：富含高熔点GC区时，则难以检测出突变．(4)PCR-变性梯度凝胶电泳分析技术双链DNA在一定17变性梯度凝胶电泳图18变性梯度凝胶电泳图18荧光定量PCR(FQ-PCR)技术是一种目前国内外应用较为广泛的定量PCR技术,是通过始点定量和荧光检测系统实时监测累计荧光强度而实现,具有灵敏度高,特异性强等优点.FQ-PCR技术的两种定量形式:

①绝对定量:一般采用外标准品定量的制备来实现绝对定量.如合成目的基因;将PCR产物直接梯度稀释;或将PCR产物克隆到载体上,抽取质粒,经过测量浓度和拷贝数可准确定量.优点:稳定,准确.

②相对定量:指在测定目的基因的同时测定一内源性管家基因(如β-actin,rRNA等),该管家基因主要是用于核苷酸的拷贝数的比较,反映反应体系内是否存在PCR扩增的影响因素.(6)定量PCR(quantiativePCR,Q-PCR)

荧光定量PCR(FQ-PCR)技术(6)定量PCR(quan19(7）DNA序列测序1.1977年Sanger创建的链终止反应序列测序法用放射性同位素标记引物，用双脱氧核苷酸随机终止DNA链的延伸，产生长度不同的DNA片段，再用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离这些片段，放射自显影读出结果。(7）DNA序列测序1.1977年Sanger创建的链终止反20最新基因诊断治疗课件212.自动测序法采用四色荧光标记代替了放射性同位素标记。

DNA测序测定是基因突变检测的最直接，最准确的方法，它不仅可确定突变的部位，还可确定突变的性质222.自动测序法22（8）DNA芯片技术DNA芯片（DNAchip)又称为基因芯片，DNA微阵列（DNAmicroarray)该技术的基础仍然是利用核酸分子杂交原理：首先将一系列预先设计好的核酸探针（oligosorcDNA)有序地，高密度地排列在玻璃，硅片或尼龙膜等固体支持物上，制成DNA微阵列。用荧光标记待测样品（DNA,cDNA,RNA)与位于芯片上的核酸探针杂交后，通过激光共聚焦荧光扫描系统检测杂交信号强度，再用特定的软件对荧光信号进行综合分析，就能获得待测样品的大量基因序列信息或表达信息。

（8）DNA芯片技术DNA芯片（DNAchip)又称为基23基因芯片技术基因芯片技术24

基因芯片按照用途分为：表达芯片，诊断芯片，指纹图谱芯片，测序芯片，毒理芯片等。该技术可用于新基因鉴定，突变检测，表达监控和遗传制图等。25基因芯片按照用途分为：表达芯片，诊断芯片，指纹图谱芯

基因表达的分析基因表达的分析26三、遗传病的基因诊断一.遗传病基因诊断的策略1.直接策略：采用基因突变的诊断方法，直接检测致病基因。该策略的前提是基因已被克隆.

2.间接策略：即通过检测与致病基因连锁

的遗传标记进行基因诊断.三、遗传病的基因诊断一.遗传病基因诊断的策略27二、人类基因组上的DNA遗传标记

限制性片段长度多态性(RFLPs

)1985短串联重复序列(shorttendemrepeats,STRs,mini-satellites)1990s单核苷酸多态性(single-nucleotidepolymor-phismsSNPs)二、人类基因组上的DNA遗传标记限制性片段长度多态性(RF28短串联重复序列STRs(shorttendemrepeats,Microsatellites)STR广泛存在于人基因组，占约5%，基本单位是1bp-8bp的串联重复，重复次数n=15-60，已知8000多个主要形式为：

(CA)n，(GA)n，(AA)n，(GG)n，(CAA)n，

(CGG)n，其中以

(CA)n，(GT)n为多见。1992年，Welssenbanch等以STR为标记的第二代连锁图取代了RFLP连锁图。短串联重复序列STR广泛存在于人基因组，占约5%，基本单位是29

主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。与RFLP与STR不同,它是直接以序列的变异作为标记,而不是以片段的长度差异作为标记.人类基因组图谱的初步分析表明，共有3万至3.5万个基因。有300多万个单核苷酸多态性,SNP在人类基因组中广泛存在，平均每500～1000个碱基对中就有1个，3-4个相邻的标记构成的单倍型（haplotype）就可有8-16种。

1996年，Lander报道了用单核苷酸多态性标记制备第三代遗传连锁图的遗传标记。单核苷酸多态性（singlenucleotidpolymorphism，SNP）主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA30

SNP用作遗传标记具有以下优点：①SNP在人群中是二等位基因性的，在任何人群中其等位基因频率都可估计出来。②它在基因组中的分布较微卫星标记广泛得多。③与串联重复的微卫星位点(STR)相比，SNP是高度稳定的.尤其是处于编码区的SNP(cSNP),而前者的高突变率容易引起对人群的遗传分析出现困难。④部分位于基因内部的SNP可能会直接影响产物蛋白质的结构或基因表达水平，因此，它们本身可能就是疾病遗传机制的候选改变位点。⑤易于进行自动化分析，缩短了研究时间.SNP用作遗传标记具有以下优点：①SNP在人群中是二等位31四、基因诊断技术在临床的应用32四、基因诊断技术在临床的应用3232血红蛋白病的基因诊断

分为异常血红蛋白病和地中海贫血,前者是由于珠蛋白的基因突变；后者是由于珠蛋白合成速率降低，a链和b链合成不平衡。（一）异常血红蛋白病的基因诊断：

如镰状红细胞贫血病:β链第六位氨基酸:GAA(谷)→GUA(缬)代替.

对该病的基因诊断应采用:

1)PCR-限制酶切,即用PCR从患者基因组扩增含突变位点的珠蛋白基因片段,再选适当的内切酶消化PCR产物,根据电泳图谱上片段数量和大小做出判断

2)Southern印迹杂交分析血红蛋白病的基因诊断分为异常血红蛋白病和地中海贫血,前者是33

HbA、HbS和HbC的密码子及蛋白质区别

β珠蛋白基因的第6位密码子有三种形式：正常红细胞的基因βA、镰状红细胞的基因βS和另一种相对常见的血红蛋白C的基因βC。HbA、HbS和HbC的密码子及蛋白质区别β珠蛋白基因的34设计一对引物进行PCR扩增，扩增序列中必须包括第5、6、7密码子，扩增后用MstⅡ限制性内切酶对扩增产物进行水解，通过对水解片段的电泳分析或进行Southern杂交分析可以做出正确的诊断。限制性内切酶MstⅡ识别序列为CCTNAGG，N可以是任意核苷酸。因此β珠蛋白基因的第5、6密码子和第7密码子的第一个核苷酸序列是该内切酶的识别位点。但是在发生镰状突变后该酶切位点消失。设计一对引物进行PCR扩增，扩增序列中必须包括第5、6、7密35×MstⅡ酶切位点(GCTNAGG)5´3´正常基因5´3´突变基因1.15kb1.35kb镰状红细胞贫血患者基因组的限制性酶切分析×MstⅡ酶切位点(GCTNAGG)5´3´正常基因5´3´36+﹣0.2kb1.15kb1.35kb正常人突变携带着患者酶切产物电泳分析+﹣0.2kb1.15kb1.35kb正常人突变携带着患者酶37酶切产物Southern印迹杂交分析用寡核苷酸探针和PCR产物进行杂交检测点突变被检靶片段经PCR扩增、酶切，并经电泳分离后转移到膜上，与经标记寡核苷酸探针杂交探针为β珠蛋白基因5′端的基因片断酶切产物Southern印迹杂交分析用寡核苷酸探针和PCR产38图示β珠蛋白基因纯合子A（AA）、纯合子S(SS)和杂合子AS个体的DNA杂交结果图示β珠蛋白基因纯合子A（AA）、纯合子S(SS)和杂合子A39PCR产物仅与完全互补的探针进行杂交含突变序列的产物仅与突变探针杂交PCR产物分别与经标记的野生型和突变型靶基因序列的寡核苷酸探针杂交，根据有无杂交信号判断被检扩增片段中是否带有突变点PCR产物仅与完全互补的探针进行杂交40

b-珠蛋白基因点突变

GAG(Glu)-->GTG(Val)

bAprobeACTCCTGAGGAGAAGTCTGCCbSprobeACTCCTGTGGAGAAGTCTGCC

HeterobAprobebSprobeHomoNormalHeterobAprobebSprobeHomoNorm41（二）α地贫的基因诊断：1.定性分析：PCR法直接扩增α1和α2，基因的3’端有差别，针对此可设计引物进行PCR，如有缺失，则不能扩增出产物。2.定量分析:α地贫的共同特点是α珠蛋白mRNA的量减少，因此可用RT-PCR定量分析mRNA的量以助诊断。（二）α地贫的基因诊断：42重型地贫:胎儿水肿综合征

早产死胎或出生前后死亡

可导致严重产科并发症

无理想治疗方法重型地贫:胎儿水肿综合征43α基因不同程度的缺失引起不同类型的α地贫，α基因缺失1～4个。正常Gene组用BamHI切割，可得到14kb的片段，而缺失一个αGene时可得到10kb片段。BamHIBamHIα2α1α210kb14kbprobeα地贫的Gene诊断

44BamHIBamHIα2α1α210kb14kbpro以αGene为探针，Southernblot方法检测αα/αααα/α-αα/--α-/----/--

正常缺1缺2缺3缺414kb10kb45以αGene为探针，Southernblot方法检测αα（三）β-地贫的基因诊断

1.DNA检测与分析：①PCR-ASO探针法为主要方法：根据β-珠蛋白主要突变位点，设计2对引物，扩增可能发生突变的2个片段,再分别与相应野生型探针和突变探针进行斑点杂交。②PCR-RFLP连锁分析法：检测与β-珠蛋白基因连锁的遗传标记进行基因诊断,如β-珠蛋白5’端有一限制内切酶HgiAI的多态性位点,在中国人群的频率为0.5③DNA芯片技术

2.RNA检测与分析：RT-PCR定量分析mRNA的量以助诊断（三）β-地贫的基因诊断46杜氏肌营养不良症的基因诊断

(Duchennemusculardystrophy,DMD)

DMD：是性连锁隐性遗传病,是由抗肌萎缩蛋白(dystrophin)基因突变(突变或缺失)。其突出特点为横纹肌进行性萎缩，引起无力和挛缩。DMD患儿在5岁前发病，20岁左右由于心力衰竭和呼吸衰竭而死亡，发病率在男性活婴中约1/3500。杜氏肌营养不良症的基因诊断

(Duchennemuscul47DMD是一种严重致死性疾病（XR），临床症状表现肌肉进行性萎缩和乏力。BMD临床症状与DMD相似，但症状较轻。Gene定位Xp21，Gene2300kb,79个Exon，cDNA全长13974bp编码3685Aa，分子量427kD。DMD/BMD70%左右为缺失型，基因很大，缺失可能发生在不同的部位。应用多重PCR扩增检测，判断缺失状态。4848杜氏和贝氏肌营养不良症的基因诊断

多重PCR检测患者缺失凝胶电泳图（9对引物）P1除外显子1外其余均缺失；

P2外显子8－19有小的缺失；P3外显子44-50缺失；

P4外显子45－52有小的缺失；B1空白对照；C1、C2正常对照。杜氏和贝氏肌营养不良症的基因诊断多重PCR检测患者缺失凝49临床表现为腰痛，蛋白尿，血尿，高血压，肾盂性肾炎，肾结石。最终导致肾功能衰竭和尿毒症。APKD——Gene定位16p13，但致病基因尚未克隆，基因产物的生化性质和疾病发病机理也尚未阐明，但已证实APKDGene与α珠蛋白基因3’端附近的一段小卫星DNA序列（3’HVR）紧密连锁，因此，可以通过RFLP连锁分析进行诊断。成年型多囊肾病的基因诊断—APKD，AD50临床表现为腰痛，蛋白尿，血尿，高血压，肾盂性肾炎，肾结石。最

以3’HVR为probe与PvuII酶切后的家系有关成员的Gene组DNA杂交——SouthernBlot杂交

Gene组DNAprobe（3'HVR）PvuII酶切

DNA片段

杂交结果51以3’HVR为probe与PvuII酶切后的家系有结果1212345

5．7kb3．4kb2．3kb

52结果1结果分析

患者（I1、II1和II2）有3.4kb片段,说明致病基因与3.4kb片段连锁,并按孟德尔方式遗传.II5不含3.4kb片段,产前诊断正常.53结果分析

53甲型血友病的基因诊断血友病是一种遗传性凝血功能障碍的出血性疾病，由于正常凝血过程中血浆凝血的活力有缺陷所致。患者常因出血不止或继发病而夭折，治疗主要靠替代疗法，输入缺乏的血浆因子。重型血友病甲和乙的男性发病率为1/5000~1/50000。为甲型血友病和乙型血友病。

54甲型血友病的基因诊断血友病是一种遗传性凝血功能障碍的出血性疾已知甲型血友病XR，获得家系成员基因组DNA。

PCR142bpBcLI

142bp+99bp+43bp

电泳结果分析？p1p2142bp99bp43bpBclIBclI-BclI+55p1p2142bp99bp43bpBclIBclI-B问:1：Ⅱ2、Ⅲ1诊断；2：

Ⅲ1是男或是女发病？

142bp99bp12123ⅠⅡIII156问:1：Ⅱ2、Ⅲ1诊断；2：Ⅲ1是男或是女发病？142bp结果分析1）先症者II2具有99bp片段而发病，该片段来自母亲。2）II2有142bp/99bp杂合子。142bp来自父亲，为正常片段，99bp片段是来自母亲而成为携带者。3）Ⅲ1为99bp片段如果是男性为患者（99bp片段来自母亲）；女性为携带者（来自父母双方）。57结果分析1）先症者II2具有99bp片段而发病，该片段来自母肿瘤的基因诊断肿瘤的发生涉及多个基因、多种因素、发生过程呈多阶段性、发生的分子机制十分复杂,因此对不同的肿瘤要采用不同的基因诊断策略.58肿瘤的基因诊断肿瘤的发生涉及多个基因、多种因素、发生

一.通过检测肿瘤染色体易位及融合基因诊断肿瘤淋巴造血系统肿瘤:

染色体易位及基因融合是较普遍的现象.如:淋巴瘤和淋巴结反应性增生.它是由于T细胞受体(TCR)基因和IgH基因重排,使原来相隔数百个碱基的IgH和TCR基因的V区和J区靠近在一起.用PCR扩增该区域片段,通过长度分析就能判断是否发生了基因重排.

59二.通过检测癌基因和抑癌基因诊断肿瘤

癌基因的激活及抑癌基因的失活与肿瘤的发生密切相关.大多人类肿瘤组织或细胞中都能检测到癌基因和(或)抑癌基因的突变1.癌基因-ras与肿瘤:ras是肿瘤中最常被激活的癌基因.激活的分子机制主要是点突变,高发区是第12、13和61位密码子.如90%的胰腺癌,50%的结直肠癌和1/3的肺腺癌都在是K-ras基因第12位密码子突变.ras癌基因点突变检测方法:

a.PCR-ASO法:检测速度快，灵敏度高，检测样品量大等优点；但点突变的检出仅限于寡核苷酸探针的探测位点和突变类型。

b.PCR-SSCP法：根据PCR扩增的目标DNA片段在非变性凝胶电泳中迁移率，将突变基因检测出来。该法检测点突变更方便；缺点：不能检测出突变的具体位点和具体类型。二.通过检测癌基因和抑癌基因诊断肿瘤癌基因的激活及抑癌60

2.P53基因与肿瘤：p53基因是最常被失活的抑癌基因，失活的分子机制主要是基因突变，也有因为基因表达异常而使p53失活，约50%以上的恶性肿瘤有p53基因突变。突变类型：130〜290密码子间常发生点突变，也有少量的插入或缺失突变。

基因检测方法：①PCR-SSCP:可检出有无突变

②

PCR-RFLP:通过内切酶位点的消失或增加

检测p53的基因突变。2.P53基因与肿瘤：61三.通过检测肿瘤相关病毒诊断肿瘤

已经发现多种病毒与肿瘤的发生有关，它们有DNA病毒，也有RNA病毒,其中逆转录病毒(retro-virus)对动物细胞的致瘤作用已得到公认.还发现一些与人肿瘤发生有关的病毒如:

Burkitt

淋巴瘤人类乳头瘤病毒(HPV)宫颈癌通过检测这些病毒的基因就可以帮助诊断相应的肿瘤.EB病毒三.通过检测肿瘤相关病毒诊断肿瘤已经发现多种病毒与肿瘤62四.通过检测肿瘤标记物基因或mRNA诊断肿瘤肿瘤标志物（tumormarker)是由肿瘤组织细胞产生的，与肿瘤形成和发展相关的物质，包括：肿瘤抗原，激素，酶和同工酶。仅存在肿瘤细胞中。

类型：基因标志：是指基因本身突变和异常表达，能反映癌前启动阶段的变化。基因表型标志：基因产物表达和调控异常，表现为所编码的表达产物合成紊乱，产生胚胎性抗原，一般出现较晚。

基因诊断方法：①基因变异导致肿瘤标记物的产生或含量改变，可选择：PCR-RFLP,PCR-ASO,PCR-测序，PCR-SSCP等技术。②导致肿瘤标记物产生或含量改变分子机制不清楚，可用RT-PCR技术检测肿瘤标记物mRNA的存在或含量的改变。如：端粒活性酶活性被用来作为肿瘤标记物，在肿瘤细胞中该酶的活性增高。四.通过检测肿瘤标记物基因或mRNA诊断肿瘤肿瘤标志物（tu63感染性疾病的基因诊断

每种病原体都有各自特异的遗传物质,可以是DNA,也可以是RNA.每种病原生物都有各自种属特异的基因.一.病毒感染性疾病的诊断

a.乙型肝炎病毒:

目前采用免疫法检测血清中病毒抗原.HBV基因组包含4个开放阅读框,S、C、P和X区,C区变异性小,是基因诊断采用的目标部位.在用PCR检测时可扩增HBV的特异核苷酸序列,通过PCR产物的直接电泳分析、或内切酶谱分析、或点杂交、或Southern印迹等结果作出判断.也可采用基因芯片技术.感染性疾病的基因诊断每种病原体都有各自特异的遗传物质64PCR检测HIV病毒携带者PCR检测HIV病毒携带者65

b.传染性非典型肺炎(SARS):

是由新型变异冠状病毒(SARS-CoV)感染引起.SARS-CoV基因组为正链单股RNA,有11个开放阅读框,基因组的特异保守序列为编码RNA聚合酶的序列.基因诊断方法:

①

采用RT-PCR技术扩增保守序列

②

DNA芯片二.诊断细菌感染性的疾病用PCR技术通过对致病细菌所含质粒的特异序列,设计引物,检测引起的疾病的细菌类型.

b.传染性非典型肺炎(SARS):66基因诊断方法在法医学上的应用微卫星核心区重复序列的拷贝数的差异是微卫星DNA多态性的主要成因，微卫星的侧翼序列多是相对保守的非重复序列，因此可以设计特异性引物，用PCR技术检测微卫星DNA的多态性。人工合成很短的重复序列作为探针，与酶切的人体DNA作southernblot，同一个体的不同组织来源的DNA谱带完全一致，而不同个体之间（除非同卵双生）谱带都不相同，如同人的指纹具有高度个体特异性一样，这种southern印迹图被称为DNA指纹。基因诊断方法在法医学上的应用67

PCR-STR技术在法医学中的应用PCR-STR技术在法医学中的应用68基因诊断用于亲子鉴定69基因诊断用于亲子鉴定69DNA指纹分析用于个体鉴定

DNA指纹分析用于个体鉴定70基因诊断意义

现证病人的诊断：争取有效、针对性治疗。产前诊断：意义更为重要，预防遗传病患儿的出生71基因诊断意义

现证病人的诊断：争取有效、针对性治疗。71基因诊断存在的问题与发展前景一.基因诊断技术应用存在的问题

1.理论问题目前找到的致病基因不多,由多基因及基因与环境互作所引发多种疾病的分子机制还不清楚

2.技术问题设备条件;操做人员;污染造成的假阳性.3.伦理问题二.发展前景基因诊断存在的问题与发展前景一.基因诊断技术应用存在的问题72结束语

基因诊断利用分子生物学技术,从DNA/RNA水平检测基因的存在、分析基因的结构变异和表达状态,从而对疾病作出诊断.基因诊断的基本技术是核酸分子杂交和PCR扩增.前者是最直接、最准确的基因诊断技术,后者则是应用前景最为广阔的诊断技术.目前,基因诊断技术已广泛地应用到遗传病、肿瘤和感染性疾病的诊断.随着医学和分子生物学技术的不断发展,基因诊断技术将会更加广泛.结束语基因诊断利用分子生物学技术,从DNA/RNA水73基因治疗

GeneTherapy基因治疗

GeneTherapy74基因治疗（Genetherapy

）

基因治疗（Genetherapy

）

：指应用DNA重组技术，将外源正常基因导入靶细胞，以纠正或补偿因基因缺陷和异常引起的疾病,以达到治疗的目的。为达到这一目的，实施相应的策略。基因治疗（Genetherapy

）基因治疗75基因治疗三要素1.合适的目的基因：补充缺损基因；矫正异常基因；其他具有治疗作用的基因。2.合适的基因转移方法。3.必须在体内正常表达：基因表达调控机制。基因治疗三要素1.合适的目的基因：补充缺损基因；矫正异常基因76基因治疗流程1.确定病因（致病基因）2.治疗基因的获得：DNA重组3.将治疗基因导入基因治疗靶细胞靶细胞：体细胞、生殖细胞（符合易培养、易取出和移植、寿命长等条件）导入方法：物理法、化学法、融合法、病毒载体法4.将治疗基因修饰的靶细胞回输体内5.观察治疗效果基因治疗流程1.确定病因（致病基因）77本章内容提示基因治疗(genetherapy)概念基因治疗策略治疗靶细胞：体细胞、生殖细胞的基因治疗基因转移方法靶细胞特点、靶细胞种类反义寡核苷酸技术自杀基因与旁观者效应本章内容提示基因治疗(genetherapy)概念78一、基因治疗策略策略：直接基因治疗和间接基因治疗1、直接基因治疗：纠正突变基因

在原位修复缺陷的基因，以达到治疗目的。为较理想的基因治疗策略，由于存在某些问题，目前正在努力之中。（未实现）一、基因治疗策略792、间接疗法：以正常的基因替代致病基因。

导入外源正常基因，代替有缺陷的基因。而对靶细胞而言，没有去除或修复有缺陷的基因。用DNA重组技术设法修复患者细胞中有缺陷的基因，使细胞恢复正常功能而达到治疗遗传病的目的。

2、间接疗法：80途径:

就基因转移的受体细胞不同，基因治疗有两种途径：

1、生殖细胞基因治疗

2、体细胞基因治疗途径:

就基因转移的受体细胞不同，基因治疗有两种途径81

1、生殖细胞基因治疗将正常基因转移到患者生殖细胞（精细胞，卵细胞，早期胚胎）使其发育成正常个体。为理想的治疗方法，从根本上治疗遗传病，使其有害基因不能在人群中散播。

1、生殖细胞基因治疗将正常基因转移到患者生殖细胞（精细胞82但还存在某些问题：1）靶细胞的遗传修饰至今尚无实质性进展；2）基因转移效率不高，只能用显微注射方法；3）只适用于排卵周期短而次数多的动物，很难适用于人类。（但目前辅助生殖技术的发展较为有效的解决了获取卵细胞的办法。一次可获取少者3-5个，多者十几个。）但还存在某些问题：1）靶细胞的遗传修饰至今尚无实质性进展；832．体细胞基因治疗

somaticcellgenetherapy

将正常基因转移到体细胞，使之表达基因产物，以达到治疗的目的。但有害基因能遗传给后代。2．体细胞基因治疗

somaticcellgeneth84

措施：（1）正常基因转移至体外培养的体细胞，有效表达后，再回输到体内。（2）正常基因导入靶细胞，定位整合到染色体上，准确的替换异常基因，是理想的措施。（3）随机整合，非特定座位，只要有效的表达即可达到治疗的目的。（4）体细胞基因治疗理论上不必矫正所有的体细胞。措施：（1）正常基因转移至体外培养的体细胞，85存在的问题

对特定座位基因转移，目前还存在较大困难；随机插入可能引起后代的基因突变。存在的问题86二、基因治疗的方法基因治疗的关键性步骤

目的基因的获得与转移

二、基因治疗的方法87基因治疗首先获得目的基因通常从基因组中分离

基因克隆↓定位↓表达↓评价表达情况一）目的基因的获得—

正常基因的分离与克隆基因治疗首先获得目的基因通常从基因组中分离一）目的基因的获得88二）外源基因的转移通过不同方法，将目的基因转移至受体细胞。二）外源基因的转移通过不同方法，将目的基因转移至受体细胞。891）物理方法（1）电穿孔法（electroporotion）将细胞置于高压脉冲电场中，通过电压使细胞产生可逆性的穿孔。周围基质中的DNA可渗进细胞，进而表达。

瞬间细胞细胞膜核膜通透性增加

高压脉冲

DNA渗入细胞1）物理方法（1）电穿孔法（electroporotion）90（2）显微注射法（microinjection）利用显微操作把目的基因直接注入靶细胞或细胞核

（2）显微注射法（microinjection）利用显微操91例：转基因动物的制备

重组基因DNA

微注射（体外）

小鼠受精卵回植假妊娠

仔鼠

动物模型：转基因鼠

(每个鼠细胞中都含有外源基因，按孟德尔方式遗传)例：转基因动物的制备92最新基因诊断治疗课件93clonesheepDolly体细胞提取核重组细胞回植Dolly卵细胞去核细胞clonesheepDolly94（3）微粒子轰击法

利用亚微粒的钨和金能吸附DNA，并将其包裹起来形成微粒，通过物理途径获得高速度，微粒瞬间既可进入靶细胞，达到转移目的基因的目的，而不损伤靶细胞。该方法可使目的基因在皮肤、肝、胰、胃及乳腺等细胞中表达。（3）微粒子轰击法利用亚微粒的钨和金能吸附DNA，并将其包952）化学法磷酸钙沉淀法：目的基因与磷酸钙等物质混合，形成沉淀的DNA微细颗粒，易通过细胞膜进入细胞内，并整合到受体细胞基因组中，在适当条件下得以表达。2）化学法磷酸钙沉淀法：96磷酸钙+DNA→混合微细颗粒↓

沉淀反应20~30min

↓

细胞在沉淀物中暴露5~24h

方法简单，但转化效率低。磷酸钙+DNA→混合微细颗粒973）脂质体法（liposome）应用人工制备的类似细胞膜的膜性结构——脂质体，包装外源基因，再与靶细胞融合，外源DNA导入靶细胞，使其表达。

DNA细胞融合转化细胞

PEG

仙苔病毒DNA脂膜3）脂质体法（liposome）应用人工制备的类似细胞膜的膜984）同源重组法

同源重组（homologusrecombination）:外源基因和染色体上的基因在同源序列间发生重组而插入染色体。

是将外源基因定位导入细胞的染色体上。

单交换

双交换

4）同源重组法同源重组（homologusreco99通过同源重组定点插入珠蛋白基因XbaIBstXIXbaIδβ△βneoXbaIBstXIδΔββneo正常基因座位带有珠蛋白基因的质粒

C重组后，插入外源基因片段带有——neo基因（新霉素抗性基因），重组后的细胞在含有neo的培养基中生长，没有插入新基因的细胞死亡，将有重组的细胞筛选出来。通过同源重组定点插入珠蛋白基因XbaIBstXIXbaI1005）病毒介导基因内转移（Viralmediatedtransfer）是通过病毒为载体（vector），将外源基因通过重组技术与病毒重组，然后去感染受体细胞感染细胞重组病毒5）病毒介导基因内转移（Viralmediatedtra101

逆转录病毒(RNA)

常用的病毒载体

DNA病毒

1)逆转录病毒（retrovirus）

目前应用最多、最成功.病毒感染细胞后，其基因组RNA经逆转录产生双链DNA拷贝，插入宿主染色体形成前病毒（provirus），前病毒转录产生的正链既是病毒RNA，再与前病毒编码的外壳蛋白包装成新的病毒颗粒。

102最新基因诊断治疗课件103例如：小鼠白血病病毒（Mo-MLV）基因组结构：

LTRLTRψgagpolenvU3RU5U3RU5

U3=增强子，R=启动子，U5=转录起始位点。

Ψ=病毒包装信号，gag=核心抗原，pol=逆转录酶，env=外壳蛋白。例如：小鼠白血病病毒（Mo-MLV）基因组结构：104逆转录病毒载体优点：①高效感染宿主细胞，转染率可达100%②病毒基因和所载的外源基因都可能表达③宿主范围广，可同时感染大量细胞并长期存留逆转录病毒载体优点：105缺点

①病毒基因容量有限，一般只能插入7kb左右片段；②病毒随机插入靶细胞基因组中，因病毒具有强大的启动子和增强子，能使插入点附近的基因过度表达或失活，插入的外源基因可能不适当的表达；缺点106③逆转录病毒有致癌作用，可能使受体细胞癌变。

根据逆转录病毒的缺点，人们有目的地将其改造，保留其优点，除去癌基因和病毒基因，保留LTR和ψ包装信号。③逆转录病毒有致癌作用，可能使受体细胞癌变。1076）受体载体转移法将含有目的基因的重组质粒和某些细胞表面受体能识别的特异性多肽（配体）形成复合物，通过细胞内吞途径达到转移基因的目的。重组质粒配体细胞膜复合物6）受体载体转移法将含有目的基因的重组质粒和某些细胞表面受体108三）靶细胞的选择靶细胞是指接受外源Gene的体细胞选择靶细胞的原则是：1）必须较坚固，便于体外培养和进行遗传技术操作；2）易于由人体分离又便于输回体内3）具有增殖优势，生命周期长（能存活几月至几年，或整个生命周期）4）易于受外源遗传物质转化。三）靶细胞的选择靶细胞是指接受外源Gene的体细胞109常见的靶细胞外周血T淋巴细胞上皮细胞内皮皮肤成纤维细胞造血干细胞——β地中海贫血、严重复合免疫缺陷病等基因治疗肝C——家族性高胆固醇血症、低密度脂蛋白病的基因治疗肌细胞常见的靶细胞外周血T淋巴细胞110三、Gene治疗的现状与前景体细胞Gene治疗临床实验已经开始，生殖细胞Gene治疗正在完善。进行基因治疗必须具备下列条件：三、Gene治疗的现状与前景体细胞Gene治疗临床实验已经开111具备下列条件选择适当的疾病，清楚疾病的发病机理，Gene的结构和功能。被纠正的基因已克隆，并清楚Gene表达与调控机制与条件。选择适当的受体细胞并在体外有效表达。安全有效的基因转移方法，以及供利用的动物模型。具备下列条件选择适当的疾病，清楚疾病的发病机理，Gene的结112肿瘤基因治疗临床实践

肿瘤基因治疗临床实践113

肿瘤基因治疗是应用基因转移的技术将外源基因导入宿主细胞，直接修复或纠正肿瘤相关基因的结构与功能缺陷，或者通过增强宿主的免疫防御功能杀伤肿瘤细胞，因此，肿瘤的基因治疗也是生物治疗的重要组成部分。肿瘤基因治疗是应用基因转移的技术将外源基因导入114目前肿瘤基因治疗仍处于早期阶段，尽管其在体外或动物实验上有许多理想结果，但在临床实践中的应用还面临许多困难，具体问题体现在：如何选择更有效的目的基因？如何确保载体的安全性？如何将带有治疗作用的载体高效率的转移到人体内？如何保持这些重组载体在人体内长期和稳定的高效表达出预定的基因产物？如何有效地将基因治疗与其他治疗方法的联合应用？如何更有效的减轻人体对重组载体的免疫作用？这些都是当前基因治疗实践中所遇到的重大困难，并成为目前肿瘤基因治疗研究的热点。目前肿瘤基因治疗仍处于早期阶段，尽管其在体外或动物实验上有许115

目的基因成功转移入靶细胞是基因治疗最重要的环节。目前临床上肿瘤基因治疗方式可分为间接体内（回体法）(exvivo)和直接体内（invivo）两种。所谓间接体内法就是将靶细胞由患者体内取出，于体外完成基因转移后再回输患者体内，此种方法的优点为靶细胞明确、转染效率高；而直接体内法是将目的基因插入载体，经修饰后直接注入肿瘤部位或通过血液循环注入体内，在体内完成向靶细胞的基因转移，具有一定盲目性,转染效率低，但较前者简便、费用低，已被越来越多的临床研究所选用。

目的基因成功转移入靶细胞是基因治疗最重要的环节116

肿瘤基因治疗基因转移方法较多，可分为物理、化学和生物三大类。前两种是非病毒方法，包括裸露DNA直接注射、多价阳离子-DNA复合物转化，电转化，脂质体共转化和受体介导的转化等。第三种方法为病毒方法，指通过携带有目的基因的病毒感染靶细胞并表达出目的基因的方法。一、基因转移的方式及所采用的载体肿瘤基因治疗基因转移方法较多，可分为物理、化学和117二、肿瘤基因治疗的靶向性和目的基因调控的研究肿瘤基因治疗中目的基因有选择的进入肿瘤细胞等靶细胞（靶向性基因治疗），是治疗成功的关键。近年来，人们对这些方面进行了广泛研究，并提出了许多方案。如通过改进给药途径和方式，或通过修饰载体和基因，均可望提高肿瘤基因治疗的定向性和可控性。二、肿瘤基因治疗的靶向性和目的基因调控的研究肿瘤基因1181、给药途径：

肿瘤基因治疗给药途径中，最多见的是向肿瘤组织直接注射，或者在超声或CT导向下定位注射。这种方法简单易行，常用于体表的晚期肿瘤。但由于使用时很难达到瘤内均匀分布，虽然有所谓旁观者效应的存在，仍可能使疗效受一定影响。对于盆腹腔肿瘤可以采取腹腔注射的方法。而肺癌基因治疗则可采取气管内给药的方式。1、给药途径：1192、载体构建

构建出能特异结合进入靶细胞的载体是实现肿瘤基因治疗定向性的主要工作，具体研究成果有：（1）利用某些病毒能选择性感染人体特异组织的性能，选择和构建特异性载体。如EB病毒和B淋巴细胞和鼻咽上皮细胞等。Kenney等以EB病毒为基础，构建出表达胞苷脱氨酶基因的载体，结果显示有无复制能力的载体均可感染EB病毒受体CD21阳性的细胞。（2）利用肿瘤细胞表达的一些相对特异的受体来构建载体。如研究发现VEGF在黑色素瘤、大肠癌、乳腺癌等多种肿瘤中表达升高，Li等据此设计了含VEGF受体结合区的多肽，并将之与目的基因相连，可以介导目的基因在表达VEGF受体的细胞特异性转导。

2、载体构建1203、目的基因的调控对目的基因的修饰，主要是为了能在局部选择性的攻击肿瘤细胞，即通过构建含有细胞特异性启动子序列的重组载体来调控目的基因定向表达于肿瘤细胞。如AFP启动子对肝肿瘤细胞的选择性等。3、目的基因的调控121三、肿瘤基因治疗的常用方法1、抑癌基因的导入：

目前对抑癌基因研究较多的是p53基因。1990年Baker等首先观察到p53导入肿瘤细胞后，肿瘤细胞出现了明显的凋亡。Roth于1993年应用载有野生型p53的重组逆转录或腺病毒载体进行人体肺癌的实验治疗，出现了8%的部分缓解率，64%病情稳定的效果。美国已从1995年起进行了重组腺病毒p53制品的临床试验。

三、肿瘤基因治疗的常用方法1、抑癌基因的导入：1222、癌基因的反义核酸导入治疗针对癌细胞癌基因异常活化而设计的反义核酸技术可有效调节肿瘤细胞中基因表达。具体应用方法有二：一是利用质粒载体或病毒载体转化或转染肿瘤细胞，在细胞内转录出能与目的基因正义RNA相互补的反义RNA，从而阻断目的基因蛋白质的表达；二是体外人工合成反义寡核苷酸。由于第二种方法相对简单，故多数反义核酸基因治疗研究均采用了这种技术。反义核酸基因治疗在靶基因选择上，可以分为癌基因、抑癌基因、生长因子及其受体细胞信号传导系统、细胞周期调控物质、酶类及其它。反义核酸基因治疗不但在体外实验和动物模型上取得了显著效果，临床试验亦显示出良好效果。2、癌基因的反义核酸导入治疗1233、免疫基因疗法：

由于在肿瘤的发生发展过程中存在着机体免疫系统对肿瘤细胞的免疫耐受状态，而这种状态可能源于肿瘤细胞本身的免疫性不强（如MHC表达不足），也可源于抗原递呈细胞（APC）不能提供足够的共刺激信号（如B7），或者机体免疫因子分泌不足等。因此可以通过以下三种方法纠正机体肿瘤免疫的耐受状态。3、免疫基因疗法：124

(1)将某些细胞因子（如IL-2、IL-4、IL-1、IL-6、IL-7、IL-12、INF-γ、TNF-α、G-CSF、GM-CSF等）的基因转染到机体免疫细胞（如TIL、LAK细胞及细胞毒淋巴细胞）中，以提高机体免疫系统对肿瘤细胞的识别和反应能力，这实质上是免疫治疗加上基因转染技术。这些细胞因子的基因治疗在一定程度上克服了细胞因子注射疗法需反复多次应用、副作用严重等缺点，疗效也有提高。肿瘤免疫细胞因子基因治疗因其简单、有效、安全，已成为肿瘤免疫基因治疗研究的最常用方法。(1)将某些细胞因子（如IL-2、IL-4、IL-1125（2）由于肿瘤细胞存在功能性MHCI类抗原和（或）共刺激信号表达不足，可以将一些与免疫识别有关的基因（如HLA、B7等）转染到体外培养的肿瘤细胞，经照射后再植入肿瘤患者体内；或者将表达HLA-B7的病毒载体或质粒DNA与脂质体复合物直接注射到瘤体内，以增强肿瘤细胞对机体免疫系统的免疫原性，诱导宿主的免疫反应。（3）制备肿瘤DNA瘤苗，即将编码特异抗原的基因直接注入人体，通过其在机体内的表达从而可以激发机体对编码抗原的免疫反应。如应用癌胚抗原（CEA）制备的肿瘤DNA瘤苗在实验中显示出一定的效果。（2）由于肿瘤细胞存在功能性MHCI类抗原和（或）共刺激信1264、自杀基因疗法将某些细菌及病毒中特有的药物敏感基因转导入肿瘤细胞，使肿瘤细胞产生某些酶类，将原来无毒的抗病毒药物或化疗前体药物代谢转化成细胞毒性产物而杀伤宿主细胞，这种使肿瘤细胞自杀的基因称为自杀基因。目前肿瘤基因治疗中广泛应用并举有较好临床前景的自杀基因主要有：单纯疱疹病毒胸苷激酶基因（HSV-tk）和细菌胞嘧啶脱氨酶基因（CD）。

4、自杀基因疗法127胞嘧啶脱氨酶（cytosinedeaminase）可将无害的5－氟胞嘧啶转变为细胞毒素5－氟胞嘧啶。此病毒可感染正常细胞和癌细胞，但将该酶基因连接到一种“分子开关”后，则只能在肿瘤细胞中表达。Sikora等设计一个“嵌合小基因（chimericminigene）”，即将酶基因连接到erbB2基因启动子的下游，此启动子活性增强，使erbB2在乳腺癌细胞中过度表达。此时，药物5－FC注入细胞后即转变为5－FU而致癌细胞死亡。而当5－FC给予含有此嵌合基因却无erbB2表达的细胞时，亦无药物前体活性。这一基因治疗的新策略，可有可能使人对肿瘤等不同疾病进行基因治疗。胞嘧啶脱氨酶（cytosinedeaminase）可将无害128自杀基因疗法可以实现选择性原位转导和特异性杀伤，避免了应用exvivo技术基因疗法中步骤繁多、技术要求高、难度大的靶细胞获取及培养、目的基因转导、筛选及回输等过程，从而使其成为较早进入临床的基因治疗方法之一。自杀基因疗法可以实现选择性原位转导和特异性杀伤1295、抗肿瘤血管形成基因治疗：

在肿瘤的发生发展中，肿瘤血管形成起重要作用，因此，抗血管形成治疗成为肿瘤治疗极有潜力的方法。血管生成抑制剂Angiostatin和Endostatin在肿瘤动物模型中已有明确疗效，但长期连续给予蛋白质药物价格昂贵，抗血管生成基因治疗则在较大程度上解决了这一问题。近年来抗血管生成基因治疗研究主要包括：（1）针对血管形成生长因子及其受体的基因治疗；（2）血管形成抑制因子基因治疗；（3）针对肿瘤血管内皮细胞的自杀基因治疗等。这些方法虽然尚未进入临床，但可以相信其会有较广泛的临床应用前景。5、抗肿瘤血管形成基因治疗：1306、耐药基因基因治疗多药耐受基因（MDR）是研究较广泛的一组耐药基因，可将细胞内的药物包括化疗药物泵出细胞外，细胞可因此对化疗药物产生耐受。利用MDR的这种作用可设计出两种基因治疗的方法：一种是应用反义RNA技术，以抑制异常活化的MDR基因，从而达到逆转肿瘤细胞化疗耐药的作用；另一种是将MDR基因导入造血干细胞，获表达后可使骨髓细胞产生对化疗药物的抗性，抵御化疗药物的损害，从而达到增加化疗药物剂量，进而提高化疗疗效的目的。6、耐药基因基因治疗131

10余年来所进行的肿瘤基因临床试验已表明，基因治疗不仅作为一个新的生物医学概念而为人们所接受，而且作为一种新的治疗手段和方法已被广大研究人员和临床工作者所实践。到目前为止所进行的不少研究表明，基因治疗实验是安全的、有效和易于操作的。

10余年来所进行的肿瘤基因临床试验已表明，基因治132四、肿瘤基因治疗存在的问题和发展方向

随着人类基因组计划的完成，肿瘤相关基因的揭示，肿瘤发病分子机理的深入阐明，DNA转移技术的革新，以及对于在体内重组载体表达的调控技术的提高，肿瘤的基因治疗必将在肿瘤的治疗中起重要作用，基因治疗在现代临床医学中具有广阔的前景。

四、肿瘤基因治疗存在的问题和发展方向1331.进行基因治疗需解决的关键问题有哪些？2.基因治疗技术路线3.外源基因导入宿主细胞有哪些方法？4.肿瘤的基因治疗目前有哪些具体策略？1.进行基因治疗需解决的关键问题有哪些？134基因治疗实例1、复合免疫缺陷综合征的基因治疗（人类Gene治疗成功例子）ADA缺乏症-——致死性疾病，患者由于腺苷酸脱氨酶（ADA）缺乏。基因治疗实例1、复合免疫缺陷综合征的基因治疗135ADA-Gene+vector（逆转录病毒）

重组分子患者TLyCIL-2刺激C分裂导入细胞生长分裂

10天

Gene表达

回输患儿体内

1~2月治疗一次,10个月患儿体内ADA水平达正常人的25%

ADA-Gene+vector（逆转录病毒）1362、乙型血友病XR，患者凝血因子Ⅸ缺乏，Ⅸ因子基因定位在Xq26.3~q27.2。临床表现，易出血，凝血时间长，轻伤、小手术后常出血不止。发病率为1/30000。例如：我国学者薛京伦实施的FⅨ的基因治疗。2、乙型血友病XR，患者凝血因子Ⅸ缺乏，Ⅸ因子基因定位在X137逆转录病毒载体

+FⅨcDNA

重组体

5`LTRFⅨneoSVPSOLTR3`①导入仓鼠细胞（CHO）→FⅨ表达；②导入乙型血友病患者皮肤成纤维细胞（体外培养）→FⅨ表达；③91年，导入乙型血友病患者皮肤成纤维细胞（体外培养）→回植病人皮下→FⅨ基因表达，FⅨ基表达水平达正常人的5%。是我国基因治疗成功的例子。逆转录病毒载体+FⅨcDNA1383、黑色素瘤的基因治疗肿瘤Gene治疗是人们十分关注的问题，进行了广泛的探索。研究发现，肿瘤浸润淋巴细胞——TIL，它积聚肿瘤部位，并在该处持续存在而无副作用，利用此特点协助治疗肿瘤。3、黑色素瘤的基因治疗肿瘤Gene治疗是人们十分关注的问题，139例：细胞因子基因治疗和肿瘤坏死因子基因治疗

①IL-2Gene②TNF-Gene

（白介2）

（肿瘤坏死因子）

逆转录病毒载体导入

TIL（体外培养的自体细胞）回植患者体内

TIL进入自体肿瘤部位，提高细胞因子杀伤肿瘤细胞的作用。例：细胞因子基因治疗和肿瘤坏死因子基因治疗

①IL-2Ge1404、自杀基因的基因治疗

原理：即用（逆转录）病毒载体将编码某种酶的基因（自杀基因）转染到肿瘤细胞中，此酶可将一种无害的药物前体转变为细胞毒复合物，进而杀伤肿瘤细胞（肿瘤细胞不能复制而死亡）。这种基因载体只能在特定的组织或肿瘤中表达，而正常细胞中不表达。4、自杀基因的基因治疗原理：即用（逆转录）病141如：自杀基因+病毒载体

转染重组载体

药物前体无毒Gene→酶→↓

药物复合物有毒

细胞死亡如：142例如：

单纯疱疹病毒

哺乳动物细胞

HSVGene-TK

（在肿瘤