2013级五年制实验课小鼠脾脏单个核细胞分离

2013级五年制本科生

免疫学实验课李冬基础医学院免疫学系

小鼠脾脏单个核细胞的分离实验内容小鼠脾脏单个核细胞的分离（实验）淋巴细胞分离及检测技术（讲解）实验目的掌握小鼠脾脏单个核细胞的分离及淋转的原理和方法熟悉淋巴细胞的检测技术细胞分离纯化的目的测定细胞免疫功能首先要从人或动物外周血或组织中获取有活性的细胞，如淋巴细胞、巨噬细胞、粒细胞等。根据实验目的不同，采用不同方法，主要需考虑(1)细胞纯度；(2)细胞获得量；(3)细胞活力；Ficoll密度梯度离心法常用来分离单个核细胞的分层液：比重是1.077左右的聚蔗糖(Ficoll)-泛影葡胺(Urografin)分层液。红细胞、粒细胞比重大(1.092)，离心后沉于管底；淋巴细胞和单核细胞的比重小于或等于分层液比重(1.070)，离心后漂浮于分层液的液面上，吸取分层液液面的细胞，就可从外周血/组织液中分离到单个核细胞。本次课分离小鼠脾脏单个核细胞FicollFicoll密度梯度离心法脾细胞悬液培养液实验材料分组：两人一组，每组一只小鼠器材数量试剂及动物数量滴管1支/2人分层液1ml/2人EP管3个/2人PBS1瓶/4人计数板1块/2人计数液1瓶/室1ml加样器(tip)1把/4人RPMI1640（无血清）100ml/室20ul加样器(tip)1把/4人RPMI1640(5%NCS)100ml/室滴管1支/2人平皿（含纱布块）1套/4人剪刀、镊子1套/4人显微镜1台/4人实验步骤1、处死小鼠，取4ml无血清RMPI1640培养液放入平皿中。2、取出脾脏放到平皿中，将3-4层纱布覆盖到组织上，用直头镊子固定组织，用弯头镊子轻压组织，将其捣碎。然后用1000µl加样器隔着纱布将细胞悬液吸出，放入1.5mlEP管中，做好标记。3、加样：吸取2ml细胞悬液沿试管壁缓慢加至分层液顶部(距1cm处)NOTE：不要打破细胞悬液与分层液的界面；4、1800转，室温离心30分钟；5、用毛细管插入液面下，尽量吸取白色毛玻璃层，放入EP管中；

NOTE：尽量少吸分层液；6、每管加PBS到1ml，重悬细胞，3000转离心5分钟。7、计数：吸弃上清，用100mlPBS重悬细胞，取出20ml加入新的EP管中，再加入20ml细胞计数液，混匀后取出10ml，加到计数板内，显微镜下计数。细胞计数方法查出四个大方格的总细胞数(X)算出每个大方格的平均细胞数：Y=X/4每个大方格的体积为V=1mm×1mm×0.1mm=0.1mm3=10-4ml制备的细胞悬液的细胞浓度（/ml)=Y×104×稀释倍数4淋巴细胞分离及检测技术巨噬细胞淋巴细胞DC细胞红细胞淋巴细胞分离及检测技术淋巴细胞的分离淋巴细胞的功能测定技术淋巴细胞分离一、外周血单个核细胞的分离淋巴细胞分离液密度梯度离心法二、淋巴细胞亚群的分离及鉴定

1.E花环分离法

2.

尼龙纤维分离法

3.

流式细胞术

4.

磁珠分离术E花环分离法

（纯化T细胞）

T细胞表面的CD2分子－绵羊红细胞受体（E受体）尼龙纤维分离法B细胞和单核细胞具有易粘附特性，将淋巴细胞悬液加到尼龙纤维上，37℃作用1－2小时后，洗脱的为非粘附性T细胞。T细胞尼龙纤维毛柱PBMCB细胞单核细胞流式细胞术

（FlowCytometry，FCM）FCM将免疫荧光技术应用于流式细胞仪，对单个细胞的表面标志（抗原或受体）进行快速、精确的分析和自动检测，并将不同类型的细胞分选收集。FCM还可对同一细胞的多种参数（如DNA、RNA、蛋白质和细胞体积等）进行多信息分析，是当代生命科学研究领域中广泛使用的一项新技术。流式细胞仪工作原理免疫磁珠分离术1.直接法：

抗细胞表面分子抗体+磁性微球

免疫磁珠+细胞悬液

强磁场与免疫磁珠结合的细胞2.间接法：

第二抗体+磁性微粒

第一抗体+细胞