鼠疫检测技术方法课件

鼠疫检测新技术新方法鼠疫检测新技术新方法1一、核酸检测技术定义：对动植物、微生物的基因序列进行测定。

核酸的分离与纯化内容：聚合酶链式反应(PCR技术)

核酸杂交技术一、核酸检测技术定义：对动植物、微生物的基因序列进行测定。2核酸的纯化与分离目的：获得完整的核酸一级结构，并提高核酸纯度。

破碎细胞（细菌）

技术流程核酸提取

核酸纯化核酸的纯化与分离目的：获得完整的核酸一级结构，并提高核酸纯度3材料的前处理细胞破碎，核酸释放核酸分离、纯化沉淀或吸附核酸，去除杂质核酸溶解缓冲液材料的前处理4全自动核酸、蛋白提取仪全自动核酸、蛋白提取仪5聚合酶链式反应（PCR技术）

简史：1971年，Khorana提出：DNA变性后，与合适引物进行杂交，在DNA聚合酶作用下，延伸引物，并不断重复该过程，即可克隆tRNA基因。1985年，Mullis等人发明聚合酶链反应（PCR），随后，Mullis所属公司PE推出第一台PCR自动化热循环仪。聚合酶链式反应（PCR技术）6基本原理：基本原理：7基本步骤基本步骤8鼠疫检测技术方法课件9实时定量PCR仪PCR仪实时定量PCR仪PCR仪10凝胶成像系统凝胶电泳系统凝胶成像系统凝胶电泳系统11加入底物,通过颜色变化来测定.Fra-R（5’-ACCTGCTGCAAGTTTACCGCC-3’）反向PCR

5.在Elisa中一般有二次抗原抗体反应，此时反应的温度和时间应按规定的要求，保温容器最好是水浴箱，可使温度迅速平衡。显色的最后一部是温育反应，此时酶催化无色的底物生成有色的产物，反应温度和时间仍是影响显色的因素，在定量测定中加入底物后的温度和时间应按规定力求准确，而在定性测定中，可根据显色程度适当提高温度，或者适当缩短或延长反应时间。在膜上杂交时，探针通过氢键与其互补的靶序列结合，洗去未结合的游离探针后，经放射自显影或显色反应检测特异结合的探针。M123456在测定时,把受检标本和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面抗原抗体反应.核酸纯化自毙或捕获动物血液或组织脏器（肝脏、脾脏等）多重PCR

2.洗涤的目的是吸取反应液中没有与固相抗原或抗体结合的物质以及在反应过程中非特异性吸附于固相载体的干扰物质。M123456从疑似鼠疫的标本（全血、组织）中检测鼠疫菌，以鼠疫菌fra和pla基因片段作为PCR扩增目的片段。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其它物质分开,最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质量成一定比例.预变性95℃5min1个循环发明聚合酶链反应（PCR），洗涤的目的是吸取反应液中没有与固相抗原或抗体结合的物质以及在反应过程中非特异性吸附于固相载体的干扰物质。在膜上杂交时，探针通过氢键与其互补的靶序列结合，洗去未结合的游离探针后，经放射自显影或显色反应检测特异结合的探针。自毙或捕获动物血液或组织脏器（肝脏、脾脏等）PCR结果判定（凝胶电泳）加入底物,通过颜色变化来测定.PCR结果判定（凝胶电泳）12PCR类型：

1.多重PCR

2.巢式PCR

3.定量PCR

4.反向PCR

5.逆转录PCR

PCR类型：

1.多重PCR

2.13PCR技术在鼠疫检测中的应用鼠疫菌PCR检测法：从疑似鼠疫的标本（全血、组织）中检测鼠疫菌，以鼠疫菌fra和pla基因片段作为PCR扩增目的片段。鼠疫判定标准：PCR扩增（fra+

pla）

+

胶体金抗原检测or酶联免疫吸附试验or反相血凝试验=确诊鼠疫PCR技术在鼠疫检测中的应用鼠疫菌PCR检测法：14鼠疫菌核酸检测样本处理样本类别1.鼠疫菌培养物2.鼠疫病人血液、痰液或尸检标本3.自毙或捕获动物血液或组织脏器（肝脏、脾脏等）4.媒介昆虫鼠疫菌核酸检测样本处理样本类别1.鼠疫菌培养物15样品处理方法1.煮沸法2.DNA提取试剂盒3.CTAB法4.氯仿抽提法样品处理方法1.煮沸法16鼠疫检测技术方法课件17鼠疫菌PCR检测反应体系10xbufferdNTPsFra-F（5’-GGAACCACTAGCACATCTGTT-3’）Fra-R（5’-ACCTGCTGCAAGTTTACCGCC-3’）Pla-F（5’-ACTACGACTGGATGAATGAAAATC-3’）Pla-R（5’-GTGACATAATATCCAGCGTTAATT-3’）Taq聚合酶待检测模板（基因组DNA）去离子水鼠疫菌PCR检测10xbuffer18鼠疫菌PCR检测反应程序预变性95℃5min1个循环变性95℃1min退火72℃1min延伸72℃1min变性72℃5min30个循环鼠疫菌PCR检测预变性95℃5min19M123456内参基因PlaFra鼠疫PCR检测电泳结果判定阳性结果：内参基因+Pla+Fra阴性结果：内参基因M1234520核酸杂交技术

待检测DNA或RNA先转移并固定到硝酸纤维素或尼龙膜上，与其互补的单链DNA或RNA探针用放射性或非放射性标记。在膜上杂交时，探针通过氢键与其互补的靶序列结合，洗去未结合的游离探针后，经放射自显影或显色反应检测特异结合的探针。核酸杂交技术待检测DNA或RNA先转移并固定到硝酸纤21二、标记检测技术标记技术：用标记物质荧光素、同位素或酶等示踪物质标记抗体（或抗原）进行抗原-抗体反应。通过测定标记物-抗原-抗体复合物来定性或定量的检测标本中的抗体或抗原。二、标记检测技术标记技术：用标记物质荧光素、同位素或酶等示踪22Fra-R（5’-ACCTGCTGCAAGTTTACCGCC-3’）为避免蒸发，板上应加盖，或将平板置于湿盒中。预变性95℃5min1个循环标本OD/阴性OD>2.在Elisa中一般有二次抗原抗体反应，此时反应的温度和时间应按规定的要求，保温容器最好是水浴箱，可使温度迅速平衡。（+）颜色明显可见；全自动核酸、蛋白提取仪Fra-R（5’-ACCTGCTGCAAGTTTACCGCC-3’）显色的最后一部是温育反应，此时酶催化无色的底物生成有色的产物，反应温度和时间仍是影响显色的因素，在定量测定中加入底物后的温度和时间应按规定力求准确，而在定性测定中，可根据显色程度适当提高温度，或者适当缩短或延长反应时间。M123456在膜上杂交时，探针通过氢键与其互补的靶序列结合，洗去未结合的游离探针后，经放射自显影或显色反应检测特异结合的探针。标记技术：用标记物质荧光素、同位素或酶等示踪物质标记抗体（或抗原）进行抗原-抗体反应。PCR类型：

1.出第一台PCR自动化热循环仪。自毙或捕获动物血液或组织脏器（肝脏、脾脏等）加入底物,通过颜色变化来测定.标本OD/阴性OD>2.PCR类型：

1.10xbuffer目测：平持反应版，距白色背景5-10cm，从板的正上方观察。标记检测特点：标记免疫技术=免疫技术+标记技术抗原抗体反应示踪物标记灵敏性特异性标记免疫技术的主要特点：高特异性、高灵敏性Fra-R（5’-ACCTGCTGCAAGTTTACCGCC23鼠疫标记检测技术ELISA胶体金鼠疫标记检测技术ELISA24ELISA技术原理：1.使抗原或抗体结合到到某种固相载体表面,并保持其免疫活性.2.在测定时,把受检标本和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面抗原抗体反应.3.用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其它物质分开,最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质量成一定比例.4.加入底物,通过颜色变化来测定.ELISA技术原理：25ELISA的类型：间接法ELISA的类型：间接法26双抗夹心法双抗夹心法27ELISA技术在鼠疫检测中的应用1.检测鼠疫F1抗原（or抗体）原理：以双抗体夹心法测定F1抗原为例。采用F1抗体包被反应板，加入待测标本，反应除去未结合物质，加入HRP-F1MCAb，如待测标本中含有F1抗原时就与包被F1抗体、HRP-F1抗体结合形成复合物，加入OPD底物产生显色反应，反之就无显色反应。所需试剂及器材：HRP-F1McAb冻干剂，F1McAb包被板，鼠疫F1阳性对照、阴性对照，PBS（稀释液）,显色液（邻苯二胺），终止液（2M硫酸）。ELISA检测工作站，ELISA洗板机、振荡器等ELISA技术在鼠疫检测中的应用1.检测鼠疫F1抗原（or抗28鼠疫检测技术方法课件29鼠疫检测技术方法课件30ELISA结果判读：1.目测：平持反应版，距白色背景5-10cm，从板的正上方观察。（+++）深黄棕色；（++）浅黄棕色；（+）颜色明显可见；（-）无色或颜色很浅2.ELISA检测工作站

标本OD/阴性OD>2.1位阳性。

ELISA结果判读：31ELISA操作注意事项：（一）加样

加样时应将所加物加在Elisa板孔的底部，避免加在孔壁的上部，并注意不可溅出，不可产生气泡。

加标本一般用微量加样器，每次加标本应更换吸头，以免交叉污染。（二）保温

在Elisa中一般有二次抗原抗体反应，此时反应的温度和时间应按规定的要求，保温容器最好是水浴箱，可使温度迅速平衡。

为避免蒸发，板上应加盖，或将平板置于湿盒中。ELISA操作注意事项：32（三）洗涤

洗涤的目的是吸取反应液中没有与固相抗原或抗体结合的物质以及在反应过程中非特异性吸附于固相载体的干扰物质。洗涤一般采用以下方法：1、吸干孔内反应液。2、将洗涤液注满孔板。3、放置3分钟，略作摇动。4、吸干孔内液，也可倾去液体后在吸水纸上拍干，洗涤次数3-4次，又是需洗5-6次。（四）显色和比色

显色的最后一部是温育反应，此时酶催化无色的底物生成有色的产物，反应温度和时间仍是影响显色的因素，在定量测定中加入底物后的温度和时间应按规定力求准确，而在定性测定中，可根据显色程度适当提高温度，或者适当缩短或延长反应时间。（三）洗涤33胶体金检测技术：原理：将F1-McAb抗体以条带状固定在NC膜上，胶体金标记F1-McAb吸附在结合垫上，与待测样品反应，通过目测的胶体金标记复合物得到直观的显色结果。检测类别：胶体金检测技术：原理：将F1-McAb抗体以条带状固定在NC34延伸72℃1min定义：对动植物、微生物的基因序列进行测定。变性72℃5min标记技术：用标记物质荧光素、同位素或酶等示踪物质标记抗体（或抗原）进行抗原-抗体反应。标本OD/阴性OD>2.PCR扩增（fra+pla）+胶体金抗原检测or酶联免疫吸附试验or反相血凝试验=确诊鼠疫自毙或捕获动物血液或组织脏器（肝脏、脾脏等）阳性结果：内参基因+Pla+Fra原理：以双抗体夹心法测定F1抗原为例。全自动核酸、蛋白提取仪显色的最后一部是温育反应，此时酶催化无色的底物生成有色的产物，反应温度和时间仍是影响显色的因素，在定量测定中加入底物后的温度和时间应按规定力求准确，而在定性测定中，可根据显色程度适当提高温度，或者适当缩短或延长反应时间。M123456目测：平持反应版，距白色背景5-10cm，从板的正上方观察。PCR结果判定（凝胶电泳）1971年，Khorana提出：DNA变性后，与合适引物进行杂交，在DNA聚合酶作用下，延伸引物，并不断重复该过程，即可克隆tRNA基因。Fra-R（5’-ACCTGCTGCAAGTTTACCGCC-3’）通过测定标记物-抗原-抗体复合物来定性或定量的检测标本中的抗体或抗原。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其它物质分开,最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质量成一定比例.洗涤的目的是吸取反应液中没有与固相抗原或抗体结合的物质以及在反应过程中非特异性吸附于固相载体的干扰物质。通过测定标记物-抗原-抗体复合物来定性或定量的检测标本中的抗体或抗原。ELISA检测工作站，ELISA洗板机、振荡器等1985年，Mullis等人在Elisa中一般有二次抗原抗体反应，此时反应的温度和时间应按规定的要求，保温容器最好是水浴箱，可使温度迅速平衡。M123456预变性95℃5min1个循环PCR类型：

1.加入底物,通过颜色变化来测定.使抗原或抗体结合到到某种固相载体表面,并保持其免疫活性.全自动核酸、蛋白提取仪显色的最后一部是温育反应，此时酶催化无色的底物生成有色的产物，反应温度和时间仍是影响显色的因素，在定量测定中加入底物后的温度和时间应按规定力求准确，而在定性测定中，可根据显色程度适当提高温度，或者适当缩短或延长反应时间。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其它物质分开,最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质量成一定比例.PCR扩增（fra+pla）+胶体金抗原检测or酶联免疫吸附试验or反相血凝试验=确诊鼠疫ELISA技术在鼠疫检测中的应用洗涤的目的是吸取反应液中没有与固相抗原或抗体结合的物质以及在反应过程中非特异性吸附于固相载体的干扰物质。标本OD/阴性OD>2.原理：以双抗体夹心法测定F1抗原为例。延伸72℃1min显色的最后一部是温育反应，此时酶催化无色的底物生成有色的产物，反应温度和时间仍是影响显色的因素，在定量测定中加入底物后的温度和时间应按规定力求准确，而在定性测定中，可根据显色程度适当提高温度，或者适当缩短或延长反应时间。延伸72℃1minELISA操作注意事项：PCR类型：

1.PCR技术在鼠疫检测中的应用出第一台PCR自动化热循环仪。目的：获得完整的核酸一级结构，并提高核酸纯度。核酸纯化用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其它物质分开,最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质量成一定比例.反向PCR

5.在测定时,把受检标本和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面抗原抗体反应.反向PCR

5.出第一台PCR自动化热循环仪。出第一台PCR自动化热循环仪。目测：平持反应版，距白色背景5-10cm，从板的正上方观察。在膜上杂交时，探针通过氢键与其互补的靶序列结合，洗去未结合的游离探针后，经放射自显影或显色反应检测特异结合的探针。1985年，Mullis等人洗涤的目的是吸取反应液中没有与固相抗原或抗体结合的物质以及在反应过程中非特异性吸附于固相载体的干扰物质。为避免蒸发，板上应加盖，或将平板置于湿盒中。显色的最后一部是温育反应，此时酶催化无色的底物生成有色的产物，反应温度和时间仍是影响显色的因素，在定量测定中加入底物后的温度和时间应按规定力求准确，而在定性测定中，可根据显色程度适当提高温度，或者适当缩短或延长反应时间。定量PCR

4.（+）颜色明显可见；Fra-R（5’-ACCTGCTGCAAGTTTACCGCC-3’）洗涤的目的是吸取反应液中没有与固相抗原或抗体结合的物质以及在反应过程中非特异性吸附于固相载体的干扰物质。Pla-R（5’-GTGACATAATATCCAGCGTTAATT-3’）定量PCR

4.多重PCR

2.标记技术：用标记物质荧光素、同位素或酶等示踪物质标记抗体（或抗原）进行抗原-抗体反应。洗涤一般采用以下方法：1、吸干孔内反应液。延伸72℃1minFra-R（5’-ACCTGCTGCAAGTTTACCGCC-3’）Pla-R（5’-GTGACATAATATCCAGCGTTAATT-3’）定义：对动植物、微生物的基因序列进行测定。1971年，Khorana提出：DNA变性后，与合适引物进行杂交，在DNA聚合酶作用下，延伸引物，并不断重复该过程，即可克隆tRNA基因。巢式PCR

3.洗涤的目的是吸取反应液中没有与固相抗原或抗体结合的物质以及在反应过程中非特异性吸附于固相载体的干扰物质。预变性95℃5min1个循环（+）颜色明显可见；Pla-R（5’-GTGACATAATATCCAGCGTTAATT-3’）自毙或捕获动物血液或组织脏器（肝脏、脾脏等）10xbuffer在测定时,把受检标本和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面抗原抗体反应.ELISA技术在鼠疫检测中的应用自毙或捕获动物血液或组织脏器（肝脏、脾脏等）标记技术：用标记物质荧光素、同位素或酶等示踪物质标记抗体（或抗原）进行抗原-抗体反应。Fra-R（5’-ACCTGCTGCAAGTTTACCGCC-3’）Fra-R（5’-ACCTGCTGCAAGTTTACCGCC-3’）目测：平持反应版，距白色背景5-10cm，从板的正上方观察。通过测定标记物-抗原-抗体复合物来定性或定量的检测标本中的抗体或抗原。退火72℃1min标记技术：用标记物质荧光素、同位素或酶等示踪物质标记抗体（或抗原）进行抗原-抗体反应。（+）颜色明显可见；破碎细胞（细菌）10xbuffer在测定时,把受检标本和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面抗原抗体反应.待检测模板（基因组DNA）1971年，Khorana提出：DNA变性后，与合适引物进行杂交，在DNA聚合酶作用下，延伸引物，并不断重复该过程，即可克隆tRNA基因。显色的最后一部是温育反应，此时酶催化无色的底物生成有色的产物，反应温度和时间仍是影响显色的因素，在定量测定中加入底物后的温度和时间应按规定力求准确，而在定性测定中，可根据显色程度适当提高温度，或者适当缩短或延长反应时间。技术流程核酸提取定量PCR

4.PCR扩增（fra+pla）+胶体金抗原检测or酶联免疫吸附试验or反相血凝试验=确诊鼠疫Fra-R（5’-ACCTGCTGCAAGTTTACCGCC-3’）延伸72℃1min多重PCR

2.待检测DNA或RNA先转移并固定到硝酸纤维素或尼龙膜上，与其互补的单链DNA或RNA探针用放射性或非放射性标记。Pla-R（5’-GTGACATAATATCCAGCGTTAATT-3’）谢谢观看！延伸72℃1min通过测定标记物-抗原-抗体35鼠疫检测新技术新方法鼠疫检测新技术新方法36一、核酸检测技术定义：对动植物、微生物的基因序列进行测定。

核酸的分离与纯化内容：聚合酶链式反应(PCR技术)

核酸杂交技术一、核酸检测技术定义：对动植物、微生物的基因序列进行测定。37核酸的纯化与分离目的：获得完整的核酸一级结构，并提高核酸纯度。

破碎细胞（细菌）

技术流程核酸提取

核酸纯化核酸的纯化与分离目的：获得完整的核酸一级结构，并提高核酸纯度38材料的前处理细胞破碎，核酸释放核酸分离、纯化沉淀或吸附核酸，去除杂质核酸溶解缓冲液材料的前处理39全自动核酸、蛋白提取仪全自动核酸、蛋白提取仪40聚合酶链式反应（PCR技术）

简史：1971年，Khorana提出：DNA变性后，与合适引物进行杂交，在DNA聚合酶作用下，延伸引物，并不断重复该过程，即可克隆tRNA基因。1985年，Mullis等人发明聚合酶链反应（PCR），随后，Mullis所属公司PE推出第一台PCR自动化热循环仪。聚合酶链式反应（PCR技术）41基本原理：基本原理：42基本步骤基本步骤43鼠疫检测技术方法课件44实时定量PCR仪PCR仪实时定量PCR仪PCR仪45凝胶成像系统凝胶电泳系统凝胶成像系统凝胶电泳系统46加入底物,通过颜色变化来测定.Fra-R（5’-ACCTGCTGCAAGTTTACCGCC-3’）反向PCR

5.在Elisa中一般有二次抗原抗体反应，此时反应的温度和时间应按规定的要求，保温容器最好是水浴箱，可使温度迅速平衡。显色的最后一部是温育反应，此时酶催化无色的底物生成有色的产物，反应温度和时间仍是影响显色的因素，在定量测定中加入底物后的温度和时间应按规定力求准确，而在定性测定中，可根据显色程度适当提高温度，或者适当缩短或延长反应时间。在膜上杂交时，探针通过氢键与其互补的靶序列结合，洗去未结合的游离探针后，经放射自显影或显色反应检测特异结合的探针。M123456在测定时,把受检标本和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面抗原抗体反应.核酸纯化自毙或捕获动物血液或组织脏器（肝脏、脾脏等）多重PCR

2.洗涤的目的是吸取反应液中没有与固相抗原或抗体结合的物质以及在反应过程中非特异性吸附于固相载体的干扰物质。M123456从疑似鼠疫的标本（全血、组织）中检测鼠疫菌，以鼠疫菌fra和pla基因片段作为PCR扩增目的片段。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其它物质分开,最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质量成一定比例.预变性95℃5min1个循环发明聚合酶链反应（PCR），洗涤的目的是吸取反应液中没有与固相抗原或抗体结合的物质以及在反应过程中非特异性吸附于固相载体的干扰物质。在膜上杂交时，探针通过氢键与其互补的靶序列结合，洗去未结合的游离探针后，经放射自显影或显色反应检测特异结合的探针。自毙或捕获动物血液或组织脏器（肝脏、脾脏等）PCR结果判定（凝胶电泳）加入底物,通过颜色变化来测定.PCR结果判定（凝胶电泳）47PCR类型：

1.多重PCR

2.巢式PCR

3.定量PCR

4.反向PCR

5.逆转录PCR

PCR类型：

1.多重PCR

2.48PCR技术在鼠疫检测中的应用鼠疫菌PCR检测法：从疑似鼠疫的标本（全血、组织）中检测鼠疫菌，以鼠疫菌fra和pla基因片段作为PCR扩增目的片段。鼠疫判定标准：PCR扩增（fra+

pla）

+

胶体金抗原检测or酶联免疫吸附试验or反相血凝试验=确诊鼠疫PCR技术在鼠疫检测中的应用鼠疫菌PCR检测法：49鼠疫菌核酸检测样本处理样本类别1.鼠疫菌培养物2.鼠疫病人血液、痰液或尸检标本3.自毙或捕获动物血液或组织脏器（肝脏、脾脏等）4.媒介昆虫鼠疫菌核酸检测样本处理样本类别1.鼠疫菌培养物50样品处理方法1.煮沸法2.DNA提取试剂盒3.CTAB法4.氯仿抽提法样品处理方法1.煮沸法51鼠疫检测技术方法课件52鼠疫菌PCR检测反应体系10xbufferdNTPsFra-F（5’-GGAACCACTAGCACATCTGTT-3’）Fra-R（5’-ACCTGCTGCAAGTTTACCGCC-3’）Pla-F（5’-ACTACGACTGGATGAATGAAAATC-3’）Pla-R（5’-GTGACATAATATCCAGCGTTAATT-3’）Taq聚合酶待检测模板（基因组DNA）去离子水鼠疫菌PCR检测10xbuffer53鼠疫菌PCR检测反应程序预变性95℃5min1个循环变性95℃1min退火72℃1min延伸72℃1min变性72℃5min30个循环鼠疫菌PCR检测预变性95℃5min54M123456内参基因PlaFra鼠疫PCR检测电泳结果判定阳性结果：内参基因+Pla+Fra阴性结果：内参基因M1234555核酸杂交技术

待检测DNA或RNA先转移并固定到硝酸纤维素或尼龙膜上，与其互补的单链DNA或RNA探针用放射性或非放射性标记。在膜上杂交时，探针通过氢键与其互补的靶序列结合，洗去未结合的游离探针后，经放射自显影或显色反应检测特异结合的探针。核酸杂交技术待检测DNA或RNA先转移并固定到硝酸纤56二、标记检测技术标记技术：用标记物质荧光素、同位素或酶等示踪物质标记抗体（或抗原）进行抗原-抗体反应。通过测定标记物-抗原-抗体复合物来定性或定量的检测标本中的抗体或抗原。二、标记检测技术标记技术：用标记物质荧光素、同位素或酶等示踪57Fra-R（5’-ACCTGCTGCAAGTTTACCGCC-3’）为避免蒸发，板上应加盖，或将平板置于湿盒中。预变性95℃5min1个循环标本OD/阴性OD>2.在Elisa中一般有二次抗原抗体反应，此时反应的温度和时间应按规定的要求，保温容器最好是水浴箱，可使温度迅速平衡。（+）颜色明显可见；全自动核酸、蛋白提取仪Fra-R（5’-ACCTGCTGCAAGTTTACCGCC-3’）显色的最后一部是温育反应，此时酶催化无色的底物生成有色的产物，反应温度和时间仍是影响显色的因素，在定量测定中加入底物后的温度和时间应按规定力求准确，而在定性测定中，可根据显色程度适当提高温度，或者适当缩短或延长反应时间。M123456在膜上杂交时，探针通过氢键与其互补的靶序列结合，洗去未结合的游离探针后，经放射自显影或显色反应检测特异结合的探针。标记技术：用标记物质荧光素、同位素或酶等示踪物质标记抗体（或抗原）进行抗原-抗体反应。PCR类型：

1.出第一台PCR自动化热循环仪。自毙或捕获动物血液或组织脏器（肝脏、脾脏等）加入底物,通过颜色变化来测定.标本OD/阴性OD>2.PCR类型：

1.10xbuffer目测：平持反应版，距白色背景5-10cm，从板的正上方观察。标记检测特点：标记免疫技术=免疫技术+标记技术抗原抗体反应示踪物标记灵敏性特异性标记免疫技术的主要特点：高特异性、高灵敏性Fra-R（5’-ACCTGCTGCAAGTTTACCGCC58鼠疫标记检测技术ELISA胶体金鼠疫标记检测技术ELISA59ELISA技术原理：1.使抗原或抗体结合到到某种固相载体表面,并保持其免疫活性.2.在测定时,把受检标本和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面抗原抗体反应.3.用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其它物质分开,最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质量成一定比例.4.加入底物,通过颜色变化来测定.ELISA技术原理：60ELISA的类型：间接法ELISA的类型：间接法61双抗夹心法双抗夹心法62ELISA技术在鼠疫检测中的应用1.检测鼠疫F1抗原（or抗体）原理：以双抗体夹心法测定F1抗原为例。采用F1抗体包被反应板，加入待测标本，反应除去未结合物质，加入HRP-F1MCAb，如待测标本中含有F1抗原时就与包被F1抗体、HRP-F1抗体结合形成复合物，加入OPD底物产生显色反应，反之就无显色反应。所需试剂及器材：HRP-F1McAb冻干剂，F1McAb包被板，鼠疫F1阳性对照、阴性对照，PBS（稀释液）,显色液（邻苯二胺），终止液（2M硫酸）。ELISA检测工作站，ELISA洗板机、振荡器等ELISA技术在鼠疫检测中的应用1.检测鼠疫F1抗原（or抗63鼠疫检测技术方法课件64鼠疫检测技术方法课件65ELISA结果判读：1.目测：平持反应版，距白色背景5-10cm，从板的正上方观察。（+++）深黄棕色；（++）浅黄棕色；（+）颜色明显可见；（-）无色或颜色很浅2.ELISA检测工作站

标本OD/阴性OD>2.1位阳性。

ELISA结果判读：66ELISA操作注意事项：（一）加样

加样时应将所加物加在Elisa板孔的底部，避免加在孔壁的上部，并注意不可溅出，不可产生气泡。

加标本一般用微量加样器，每次加标本应更换吸头，以免交叉污染。（二）保温

在Elisa中一般有二次抗原抗体反应，此时反应的温度和时间应按规定的要求，保温容器最好是水浴箱，可使温度迅速平衡。

为避免蒸发，板上应加盖，或将平板置于湿盒中。ELISA操作注意事项：67（三）洗涤

洗涤的目的是吸取反应液中没有与固相抗原或抗体结合的物质以及在反应过程中非特异性吸附于固相载体的干扰物质。洗涤一般采用以下方法：1、吸干孔内反应液。2、将洗涤液注满孔板。3、放置3分钟，略作摇动。4、吸干孔内液，也可倾去液体后在吸水纸上拍干，洗涤次数3-4次，又是需洗5-6次。（四）显色和比色

显色的最后一部是温育反应，此时酶催化无色的底物生成有色的产物，反应温度和时间仍是影响显色的因素，在定量测定中加入底物后的温度和时间应按规定力求准确，而在定性测定中，可根据显色程度适当提高温度，或者适当缩短或延长反应时间。（三）洗涤68胶体金检测技术：原理：将F1-McAb抗体以条带状固定在NC膜上，胶体金标记F1-McAb吸附在结合垫上，与待测样品反应，通过目测的胶体金标记复合物得到直观的显色结果。检测类别：胶体金检测技术：原理：将F1-McAb抗体以条带状固定在NC69延伸72℃1min定义：对动植物、微生物的基因序列进行测定。变性72℃5min标记技术：用标记物质荧光素、同位素或酶等示踪物质标记抗体（或抗原）进行抗原-抗体反应。标本OD/阴性OD>2.PCR扩增（fra+pla）+胶体金抗原检测or酶联免疫吸附试验or反相血凝试验=确诊鼠疫自毙或捕获动物血液或组织脏器（肝脏、脾脏等）阳性结果：内参基因+Pla+Fra原理：以双抗体夹心法测定F1抗原为例。全自动核酸、蛋白提取仪显色的最后一部是温育反应，此时酶催化无色的底物生成有色的产物，反应温度和时间仍是影响显色的因素，在定量测定中加入底物后的温度和时间应按规定力求准确，而在定性测定中，可根据显色程度适当提高温度，或者适当缩短或延长反应时间。M123456目测：平持反应版，距白色背景5-10cm，从板的正上方观察。PCR结果判定（凝胶电泳）1971年，Khorana提出：DNA变性后，与合适引物进行杂交，在DNA聚合酶作用下，延伸引物，并不断重复该过程，即可克隆tRNA基因。Fra-R（5’-ACCTGCTGCAAGTTTACCGCC-3’）通过测定标记物-抗原-抗体复合物来定性或定量的检测标本中的抗体或抗原。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其它物质分开,最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质量成一定比例.洗涤的目的是吸取反应液中没有与固相抗原或抗体结合的物质以及在反应过程中非特异性吸附于固相载体的干扰物质。通过测定标记物-抗原-抗体复合物来定性或定量的检测标本中的抗体或抗原。ELISA检测工作站，ELISA洗板机、振荡器等1985年，Mullis等人在Elisa中一般有二次抗原抗体反应，此时反应的温度和时间应按规定的要求，保温容器最好是水浴箱，可使温度迅速平衡。M123456预变性95℃5min1个循环PCR类型：

1.加入底物,通过颜色变化来测定.使抗原或抗体结合到到某种固相载体表面,并保持其免疫活性.全自动核酸、蛋白提取仪显色的最后一部是温育反应，此时酶催化无色的底物生成有色的产物，反应温度和时间仍是影响显色的因素，在定量测定中加入底物后的温度和时间应按规定力求准确，而在定性测定中，可根据显色程度适当提高温度，或者适当缩短或延长反应时间。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其它物质分开,最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质量成一定比例.PCR扩增（fra+pla）+胶体金抗原检测or酶联免疫吸附试验or反相血凝试验=确诊鼠疫ELISA技术在鼠疫检测中的应用洗涤的目的是吸取反应液中没有与固相抗原或抗体结合的物质以及在反应过程中非特异性吸附于固相载体的干扰物质。标本OD/阴性OD>2.原理：以双抗体夹心法测定F1抗原为例。延伸72℃1min显色的最后一部是温育反应，此时酶催化无色的底物生成有色的产物，反应温度和时间仍是影响显色的因素，在定量测定中加入底物后的温度和时间应按规定力求准确，而在定性测定中，可根据显色程度适当提高温度，或者适当缩短或延长反应时间。延伸72℃1minELISA操作注意事项：PCR类型：

1.PCR技术在鼠疫检测中的应用出第一台PCR自动化热循环仪。目的：获得完整的核酸一级结构，并提高核酸纯度。核酸纯化用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其它物质分开,最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质量成一定比例.反向PCR

5.在测定时,把受检标本和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面抗原抗体反应.反向PCR

5.出第一台PCR自动化热循环仪。出第一台PCR自动化热循环仪。目测：平持反应版，距白色背景5-10cm，从板的正上方观察。在膜上杂交时，探针通过氢键与其互补的靶序列结合，洗去未结合的游离探针后，经放射自显影或显色反应检测特异结合的探针。1985年，