《化工原理》实验教学大纲

）buffer缓冲液含有：20-247）buffer缓冲液含有：反应的过程：变性的MgCl2。、扩增、复性延伸3、需用的仪器和试剂PCR仪、水平电泳槽、外检测仪、10XPCR反应的过程：变性的MgCl2。、扩增、复性延伸3、需用的仪器和试剂PCR仪、水平电泳槽、外检测仪、10XPCR反应液、、中性dNTP、引物1、引物2、DNA模板、Taq酶（2.5U/卩l）、电泳缓冲液（1XTAE）、琼脂糖、Goldview、DNAMarkers（标准DNA恒压电泳仪、加样器、封口膜、PCR管、台式高速离心机、紫4、实验步骤PCR扩增目的基因（碱性磷酸酶AKP在0.2mLPCR管内配制50卩L反应体系1）2.5mmol/LdNTPMixture4uL10xPCRbuffer5uL10umol/mLsense2uL10umol/mLanti-sense2uL模板DNA模板DNA1uLEx-Taq1uL1U)ddH2O35uL1)94c预变性5分钟2)94cEx-Taq1uL1U)ddH2O35uL1)94c预变性5分钟2)94c变性1分钟3)55c退火1分钟4)72c延伸2分钟5)重复步骤2)一4)30次6)72c延伸10分钟。按下述程序进行扩增琼脂糖凝胶电泳分析PCR结果。3）配制0.8％琼脂糖凝胶30mL(1XTAE,力口1.5ulGoldView。50卩LPCR扩增产物+电泳，恒压80V。6uL10Xloading-bufer+6uLSYBR核酸染料，混匀，全部上样5、教学方式学生为主，教师辅助，充分预习，独立完成。6、考核要求以出勤、随堂提问、实验报告和预习报告为主要考核内容。7、实验报告要求实验报告应包括下列各项：1）报告的题目（要简明确切）；2）写报告人及共同测定人员的姓名；实验目的；实验原理；6）6）实验数据记录（包括原始数据记录表格和整理后的数据记录表格）；8）实验结果。明确提出本次实验的结论。回答思考题。实验九SDS--聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质分子量1、本次实验的目的和要求学习和掌握SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理、方法、并应用该方法测定蛋白质分子量。2、实验内容或原理如果在聚丙烯酰胺凝胶中加入一定浓度的十二烷基硫酸钠（SDS）,8）实验结果。明确提出本次实验的结论。回答思考题。实验九SDS--聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质分子量1、本次实验的目的和要求学习和掌握SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理、方法、并应用该方法测定蛋白质分子量。2、实验内容或原理如果在聚丙烯酰胺凝胶中加入一定浓度的十二烷基硫酸钠（SDS）,由于SDS带有大量的负电荷，且这种阴离子表面活性剂能使蛋白质变性，特别是强还原剂如巯基乙醇存在下，蛋白质分子内的二硫键被还原，肽键完全伸展，使蛋白质分子与SDS充分结合，形成带负电性的蛋白质-SDS复合物；此时蛋白质分子上所带的负电荷量远远超过蛋白质分子原有的电荷量，掩盖了不同蛋白质间所带电荷的差异。蛋白质分子量愈大，所带的负电荷愈多，在电场中移动得越快；反之越慢。在聚丙烯酰胺凝胶电泳中，蛋白质的迁移速率取决于它所带的电荷的多少、分子的大小和形状。如果用还原剂（如巯基乙醇或二硫苏糖醇等）和十二烷基硫酸钠（SDS）加热处理蛋白质样品，蛋白质分子中的二硫键将被还原，并且1g蛋白质可定量结合1.4gSDS，亚基的结构呈长椭圆棒状。由于与蛋白质结合的SDS的结构呈长椭圆棒状。由于与蛋白质结合的SDS呈解离状态，使蛋白质亚基带上大量负电荷，其数值大大超过蛋白质原有的电荷量，掩盖了不同亚基间原有的电荷差异。各种蛋白质SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳不仅是-SDSSDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳不仅是有效迁移率与分子质量的对数成很好的线性关系。所以，一种好的蛋白质分离方法，也是一种十分有用的测定蛋白质分子质量的方法。应该注意的是，SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测得的是蛋白质亚基的分子质量。对寡聚蛋白来说，为了正确反应其完整的分子结构，还应用连续密度剃度电泳或凝胶过滤等方法测定天然构象状态下的分子质量及分子中肽链（亚基）的数目。3、需用的仪器和试剂恒压电泳仪、垂直板电泳槽、注射器、加样器、烧杯、下层胶缓冲液、上层胶缓冲液、Acr+Bis贮备液、10%过硫酸铵、样品缓冲液（裂解液）、电极缓冲液、染色液、脱色液、1.5%琼脂、“低分子量标准蛋白”、牛血清白蛋白、鸡血清4、实验步骤

（1） 电泳槽的安装：玻璃板先用洗液浸泡，再用热水冲洗，再用蒸馏水冲洗，直立干燥，垂直地固定在两半槽之间，对角拧紧。电泳槽装好后，将溶化的槽内的小池中。（2） 样品的处理：将标准蛋白质样品及未知样品分别配制浓度为为SDS样品处理液，溶解后在沸水浴中加热 3-4min。冷却后待用。（3）制胶：将胶沿玻璃壁缓慢加入已准备好的凝胶（在注胶过程中防止产生气泡） ，胶加到玻璃顶3cm处，立即覆盖3-5cm的水层，静止聚合40min左右。胶聚合好的标志是胶与水层之间形成清晰的界面。1.5%（1） 电泳槽的安装：玻璃板先用洗液浸泡，再用热水冲洗，再用蒸馏水冲洗，直立干燥，垂直地固定在两半槽之间，对角拧紧。电泳槽装好后，将溶化的槽内的小池中。（2） 样品的处理：将标准蛋白质样品及未知样品分别配制浓度为为SDS样品处理液，溶解后在沸水浴中加热 3-4min。冷却后待用。（3）制胶：将胶沿玻璃壁缓慢加入已准备好的凝胶（在注胶过程中防止产生气泡） ，胶加到玻璃顶3cm处，立即覆盖3-5cm的水层，静止聚合40min左右。胶聚合好的标志是胶与水层之间形成清晰的界面。1.5%的琼脂注入背面2mg/ml的溶液，溶剂分离胶聚合好之后，吸去分离胶上的水层，注入浓缩胶，同时插入梳子。其下端应具分离胶面1cm，待胶聚合好后小心的取出梳子。4）点样：标准分子量蛋白：将标准分子量蛋白溶于SDS样品缓冲液中（1-2mg/ml）在沸水浴中加热3-4nin冷却后使用。未知样品：将提取的未知分子量蛋白用处理标准蛋白的方法处理之。在两槽内加入电极缓冲液，用微量进样器将已知分子量的标准蛋白质混合物加入到一样品槽内，将未知样品加入到其他样品槽内。5）电泳：加样接通电源后立即电泳（上槽接负极，下槽接正极），最初控制在15mA，当样品进入分离胶以后 ，电流加大到30mA，电压恒定在80-100V之间，当指示剂染料溴酚蓝到达距分离胶底部1-2cm时可停止电泳，电泳约需 3〜4小时。6）固定和染色：电泳完毕，将胶取出，在水中浸泡10min，浸出部分SDS。后加入考马斯亮蓝R-250，染色时间以染透整个凝胶板为准，染料可重复使用。除去染色液后，用少量蒸馏水洗掉染料，然后加入脱色液，直至看出清晰的蛋白带，去掉脱色液加入固定液。7）脱色：用自来水冲洗凝胶上的染色液。之后放入脱色液中脱色。至能看出清晰的蛋白带测量已知与未知蛋白质的迁移率。8）结果与计算：相对迁移率（Rm）=蛋白质的迁移距离（d2）/指示剂的迁移距离（d1）绘制标准曲线及测定未知蛋白分子量以标准蛋白的迁移率为横坐标，以其对应的分子量的对数为纵坐标。在半对数坐标纸上作图，可得一条线，然后根据未知样品的迁移率在标准曲线上就可查得相应的分子量，为未知蛋白的分子量。5、教学方式学生为主，教师辅助，充分预习，独立完成。6、考核要求以出勤、随堂提问、实验报告和预习报告为主要考核内容。7、实验报告要求实验报告应包括下列各项：报告的题目（要简明确切）；写报告人及共同测定人员的姓名；实验目的；实验原理；实验仪器和试剂（包括主要仪器的规格、主要试剂的名称）；1）2）6）实验数据记录（包括原始数据记录表格和整理后的数据记录表格）；实验结果。明确提出